BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Hampir setiap orang pernah mengalami sakit pertu setelah mengonsumsi
makanan yang terkotaminasi atau tercemar. Efek dari makanan yang
terkontaminasi bisa mulai sakit perut ringan sampai kematian. Meskipun begitu,
dengan mata telanjang seringkali tidak bisa dibedakan makanan yang telah
terkontaminasi atau tidak baik dilihat dari segi fisik, rasa, dan kadang bau.
Makanan yang terkontaminasi disebabkan karena proses penyiapan makanan
yang tidak bersih. Kontaminasi bisa disebabkan oleh udara ataupun hewan yang
berkontak dengan makanan dan meninggalkan sejumlah bakteri atau virus yang
menimbulkan efek bagi manusia.
Kontaminan atau cemaran pada makanan sangat bervariasi, salah satunya
adalah mikrobiologis, seperti bakteri dan virus. Kontaminasi bakteri dapat
berbahaya bagi kesehatan. Bakteri adalah suatu organisme yang kecil dan hanya
dapat dilihat dibawah mikroskop. Sebenarnya, bakteri terdapat dimana-mana.
Bakteri terdapat di tubuh manusia, seperti hidung, tangan, telinga, kuku.Terdapat
juga di benda yang biasa dipegang atau digunakan sehari-hari, seperti uang,
pegangan pintu, tempat duduk toilet dan lain-lain.
Berdasarkan fungsinya, bakteri terbagi menjadi dua, yaitu bakteri apatogen dan
bakteri patogen. Bakteri apatogen adalah bakteri yang dapat mebmberikan
manfaat pada kehidupan manusia, seperti Lactobacillus sp. dapat dimanfaatkan
untuk membuat yoghurt. Sedangkan bakteri patogen merupakan bakteri penyebab
penyakit.
 Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit melalui dua cara, yaitu infeksi dan
intoksikasi. Bakteri yang menyebabkan patogen melalui infeksi harus tertelan
dalam keadaan hidup ke tubuh manusia untuk bisa menyebabkan keracunan.
Bakteri ini biasanya Salmonella sp. dan Eschericia coli. Sedangkan bakteri yang
menyebabkan penyakit melalui intoksikas oleh karena senyawa beracun yang
dihasilkan sebagai produk sampingan selama proses pertumbuhan bakteri.
Sehingga bakteri itu sendiri tidak perlu tertelan secara langsung, selama toksin
yang dihasilkan tertelan akan timbul penyakit. Beberapa bakteri yang bekerja
dengan intoksikasi adalah Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, dan
Streptococci sp(Jenie, 2014)

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah :

1. Untuk mengetahui koloni bakteri yang terdapat dalam sampel bahan makanan
padat yang akan diujikan metode Total Plate Count
2. Untuk mengidentifikasi bakteri yang terdapat pada bahan makanan yang
diujikan
 BAB II

Metode

2.1 Alat dan Bahan

2.1.1 .Alat :

1. Tabung reaksi
2. Gelas erlenmeyer
3. Ose bulat
4. Ose jarum
5. Rak tabung
6. Lampu bunsen
7. Mikroskop
8. Object glass
9. Mikropipet
10. Pipet
11. Mortir alu
12. Neraca
13. Alumunium foil
14. Cawan petri
15. Inkubator

2.1.2 Bahan :
1. Bahan makanan yang akan diuji
2. NaCl fisiologis
 3. Kristal violet
4. Etano
5. Lugol
6. Safranin
7. Aquades
8. Medium cair atau NB(Nutrient broth)
9. Larutan
10. Media tryptophan atau peptone broth (Indole test)
11. Medium semi solid (Uji motilitas)
12. Larutan Peroksida(Uji Katalase)
13. Simmos citrate (SC)
14. Triple sugar iron agar (TSIA)

2.2 Cara Kerja

2.2.1 Pengenceran

1. Menghaluskan sampel makanan (donat) menggunakan mortar alu.

2. Menimbang sampel yang telah dihaluskan sebangak 1 gram dengan

neraca dan dialaskan aluminium foil.

3. Memasukkan sampel ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi cairan

fisiologis atau NaCl 0.9% 10ml.

4. Menghomogenkan larutan dengan cara menggoyangkan tabung.

5. Mengambil larutan dari tabung Erlenmeyer sebanyak 1 ml menggunakan

pipet kemudian memasukkan larutan tersebut ke dalam tabung reaksi
yang telah berisi cairan fisiologis atau NaCl 0.9% secara aseptis.

6. Menghomogenkan larutan dengan cara menggoyangkan tabung,

 7. Mengambil larutan dari tabung reaksi sebanyak 1 ml menggunakan pipet
ke dalam tabung reaksi lain yang telah berisi cairan NaCl 0.9% dan
dihomogenkan dengan cara menggoyangkan tabung tersebut.

8. Memasukkan suspense ke dalam cawan petri menggunakan mikropipet.

9. Tambahkan nutrient broth ke dalam cawan petri.

10. Melakukan inkubasi pada cawan petri selama 24 jam.

2.3.1 Perhitungan Jumlah Koloni

1. Mengambil isolat bakteri 100l dengan menggunakan mikropipet

2. Menuangkan isolat bakteri pada medium PCA cawan dengan teknik
spread
3. Meratakan isolat bakteri yang sudah dituang dengan menggunakan &
glass
4. Menginkubasi pada suhu 39 selama 24 jam
5. Mengamati dan menghitung jumlah koloni yang tumbuh padam medium

2.3.2 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram

1. Bersihkan kaca objek dengan alkohol sehingga bebas dari lemak.

Kemudian panaskan diatas lampu spirtus.
2. Buat sediaan preparat dalam bentuk suspensi. Jika sampel berbentuk
padat gunakan NaCl fisiologis untuk membuat suspensi.
3. Pijarkan ose lalu dinginkan. Celupkan ose ke dalam suspensi bakteri dan
goreskan pada kaca objek. Jika bakteri yang akan diperiksa terdapat
pada medium padat(media agar), maka teteskan NaClFisiologis terlebih
dahulu pada kaca preparat kemudian goreskan bakteri tersebut dengan
ose.
 4. Keringkan preparat dengan mengangin-anginkan pada suhu ruang atau
dekat hawa hangat api, kemudian lalukan preparat diatas api bunsen
sebanyak 3x.
5. Tetesi preparat tersebut dengan zat warna Karbol Gentian Violet. Diamkan
selama 1 menit. Buang zat warna berlebih.
6. Tambahkan zat pematek Lugol (Iodium : Kalium Iodium : Aquades = 1 :
2 : 300), selama 1 menit. Kemudian cuci dengan air
7. Bilas preparat dengan alkohol 96% selama 2 detik hingga zat warna larut
kemudian bilas dengan akuades.
8. Tetesi preparat dengan pewarna kedua atau safranin. Diamkan selama 1
menit. Buang kelebihan zat warna. Bilas dengan akuades.
9. Keringkan preparat dan diatasnya diberi satu tetes minyak imersi untuk
menghindarkan perbedaan indek bias. Amati di bawah mikroskop.
10. Catat hasil pengamatan.

2.3.3. Identifikasi Bakteri dengan Uji Biokimia

Uji Katalase

1. Mengambil kultur sampel dengan ose secara aseptis dari agar miring
dengan meijarkan ose dan mendinginkannya.
2. Biakan digoreskan pada petridish agar sel rata dan tidak bertumpuk.
3. Kultur mikroba kemudian ditetesi 1-2 tetes H2O2 3% agar aktivitas
katalase pada mikroba dapat diketahui.
4. Petridish ditutup kembali agar tidak ada kontaminasi dan memaksimalkan
mikroba untuk merombak H2O2.
5. Amati ada tidaknya gelembung-gelembung kecil. Jika terdapat
gelembung maka dalam petridish tersebut merupakan bakteri katalase
positif, sebaliknya jika tidak ada gelembung termasuk bakteri katalase
negatif.

Uji TSIA
 Uji ini bertujuan untuk mengetahui organisme yang dapat memfermentasi
glukosa, sukrosa dan atau laktosa dengan atau tanpa menghasilkan gas. Juga untuk
mengetahui kemampuan organisme dalam menghasilkan hydrogen sulfida dan
thiosulfate dalam kondisi asam.

Fermentasi glukosa akan menghasilkan warna kuning pada dasar media.

Fermentasi sukrosa dan atau laktosa akan menyebabkan warna kuning pada bagian
dasar dan permukaa miring dari media. Adanya warna hitam menunjukan bakteri
menghasilkan hidrogen sulfida.

1. Acid/acid/gas : Klebsiella
2. Acid/acid : Yersinia enterocolitica (18 jam)
3. Acid/acid : Yersinia enterocolitica. Sesudah 48 jam
4. Acid/acid/gas/hydrogen sulphide : Citrobacter
5. Acid/acid/gas/hydrogen sulphide : Erysipelothrix rhusiopathie

Uji Motilitas

Tes ini bertujuan untuk mengetahui pergerakan organise pada suhu yang
dikehendaki dengan media semi solid. Bakteri yang motil akan migrasi dari area
penusukan dan menyebar ke dalam media yang menyebabkan kekeruhan. Bakteri non
motil akan menunjukan batas pertumbuhan yang jelas, tidak menyebar, dan tidak
menghasilkan kekeruhan.

1. Motile : Shewanella. Tumbuh menyebar menghasilkann kekeruhan disekitar

penusukan samai kira-kira 1,5 cm dari dasar tabung
2. Non-motile : Acinetobacter
3. Non-motile : Klebsiela. Dalam beberapa kasus bakteri Klebsiella dapat
menghasilkan banyak gelembung gas disekitar area penusukan. Menyebabkan
pola pertumbuhan yang mirip pohon pinus.Fenomena ini tidak terlihat pada
gambar
Uji Indole atau Indole Test

Tes ini bertujuan untuk mengetahui apakah perganisme menghasilkan gugus

indole dan tryptophan atau peptone. Setelah inkubasi mikroorganisme dalam media
tryptophan atau peptone broth, tambahkan reagen kovac.

1. Reaksi Positive : E.coli

2. Reaksi Negative : Salmonella

Uji Simmon Citrate

Tes ini bertujuan untuk mengetahui apakah suatu organisme dapat

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dengan menghasilkan
suasana bromthymol blue digunakan sebagai indikator yang menunjukan warna biru
pada media bila suasana menjadi alkali.

1. Reaksi Positive reaction Klebsiella

2. Reaksi Negative reaction E. coli
 BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

Jumlah Koloni

BENTUK KOLONI JUMLAH

Besar 2
Sedang 8
Kecil bulat 28
Kecil lonjong 32
Total 70

UJI HASIL
Uji Katalase (+) Ada gelembung
Uji SC (+) Menjadi warna biru
Uji SIM
Uji TSIA (+) Pada bagian dasar terutama

3.2 Pembahasan

Berdasarkan hasil yang didapatkan saat praktikum kemarin, terdapat sejumlah 70 koloni
pada sampel yang ditumbuhkan dalam media nutrien broth. Koloni tersebut didapatkan
dari pengenceran sebanyak 10-3 dengan bahan yang diujikan adalah jajanan pinggir jalan,
yaitu molen mini. Metode yang digunakan untuk mengukur jumlah koloni adalah metode
total plate count. Metode ini dilakukan dengan asumsi bahwa mikroorganisme hidup akan
bertumbuh dalam suspensi dan membentuk suatu koloni bakteri denga media pertumbuhan
dan lingkungan yang sesuai(Fardiaz,1993)Bakteri yang tumbuh dan berkembang biak akan
dapat dilihat dengan mata telanjang. Sehingga penghitungan koloni bakteri dilakukan tanpa
perlu mikroskop(Volk, 1989). Untuk menghindari kepadatan bakteri yang berlebihan maka
dilakukan proses pengenceran. Pada pengenceran 10-3 didapatkan hanya satu koloni saja.
Dengan demikian koloi tunggal yang diperoleh disebut juga koloni yang murni.

Pada pewarnaan gram yang dilakukan dari sampel koloni, didapatkan bakteri negaitf
berbentuk basil berwarna merah. Bakteri gram negatif merupakan bakteri yang memiliki
seidkit peptidoglikan dan tidak mengandung asam pada dinding selnya namun
mengandung sejumlah polisakarida dan lebih rentan terhadap kerusakan mekanik dan
kimia. Sehingga saat diteterkan oleh etanol pewarna kristal violet yang telah diserap akan
ikut luntur. Lalu saat dialnjutkan dengan pewarnaan kedua menggunakan safranin sehingga
dapat menyerap safranin dan menghasilkan warna merah(Prasetyo, 2009)

Uji Indol dilakukan bertujuan untuk mengetahui apakah organisme menghasilkan gugus indole
dan tryptophan atau peptone. Uji indol menunjukan hasil negatif karena ditandai larutnya senyawa
amino benzealdehid dalam air sehingga tidak membentuk warna merah seperti cincin sebagai
pembentukan indol(Lumantouw et al, 2013). Pada uji indol yang dilakukan pada praktimum ini
menunjukan adanya cincin merah yan berarti positif (+). Cincin merah yang disebabkan oleh indol
yang bereaksi dengan aldehida ketika diteteskan dengan reagen kovac. Bakteri akan teoksidasi oleh
tryptophan sebagai sumber karbon. Uji indol adalah salah satu komponen asam amino yang
terdapat pada protein, sehingga asam amino pada umumnya digunakan oleh mikroorganisme untuk
penguraian protein. Bakteri yang menghasilkan enzim triptofanase akan menguraikan gugus indol
dapat dikatalis dari triptofan. Gugus indol pada media akan menumpuk sebagai produk buangan
dan molekul triptofan kemudian digunakan untuk memenuhi kebetuhan zat hara mikroorganisme.

Pada uji sitrat bertujuan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat. Pada praktikum ini
uji sitrat didapatkan hasil positif, hal ini ditunjukan dengan perubahan dari warna hijau menjadi
biru. Bila suatu bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dan energi untuk bakteri
tersebu maka asam yang terdapat dalam media akan dihilangkan sehingga tidak terjadi perubahan
 warna atau didapatkan hasil negatif(-). Namun bila pada medium sitrat bakteri memiliki
kemampuan menggunakan sitrat maka akan terjadi perubahan warna(Saridewi, 2016)

Prasetyo T. 2009. Pola resistensi kuman dari kultur darah di Lab mikro FKUI th 2001 – 2006 terhadap
Kloramfenikol,Trimethoprim dan Tetrasiklin. [Skripsi]. FKUI: Jakarta

Lumantouw SF, Febby EFK, Sendy BR, Marina FOS. 2013. Isolasi dan identifkasi bakteri yang toleran
terhadap fungisida mankozeb pada lahan pertanian tomat di DesaTempok, KecamatanTompaso,
Sulawesi Utara. Bios Logos. 3(2):73-77

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan Edisi Pertama. Cetakan. Pertama. Raja Grafindo Persada,
Jakarta.

Volk dan Wheeler. 1989. Mikrobiologi Dasar II. Jakarta: Erlangga

Saridewi I, Pambudi A, dan Ningrum Y F. 2016. ANALISIS BAKTERI Escherichia coli PADA
MAKANAN SIAP SAJI DI KANTIN RUMAH SAKIT X DAN KANTIN RUMAH SAKIT Y.
Bioma Vol.12 No.2
Daftar Pustaka

Jenie Betty S. 2014. Sanitasi dalam Penanganan Pangan. Universitas Terbuka : Tangerang Selatan

Prasetyo T. 2009. Pola resistensi kuman dari kultur darah di Lab mikro FKUI th 2001 – 2006
terhadap Kloramfenikol,Trimethoprim dan Tetrasiklin. [Skripsi]. FKUI: Jakarta

Lumantouw SF, Febby EFK, Sendy BR, Marina FOS. 2013. Isolasi dan identifkasi bakteri yang
toleran terhadap fungisida mankozeb pada lahan pertanian tomat di DesaTempok,
KecamatanTompaso, Sulawesi Utara. Bios Logos. 3(2):73-77

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan Edisi Pertama. Cetakan. Pertama. Raja Grafindo
Persada, Jakarta.

Volk dan Wheeler. 1989. Mikrobiologi Dasar II. Jakarta: Erlangga

Saridewi I, Pambudi A, dan Ningrum Y F. 2016. ANALISIS BAKTERI Escherichia coli PADA
MAKANAN SIAP SAJI DI KANTIN RUMAH SAKIT X DAN KANTIN RUMAH
SAKIT Y. Bioma Vol.12 No.2