A.

Alat dan Bahan

1. Uji PCR

Alat:

Mikropipet dan Tip, Lemari es, Miktrotube steril, Plat mikro, Alat RT PCR.

Bahan:

R-mix, primer forward, primer reverse, NFW, enzim RT dan RNA template.

2. Uji Elektroforesis

Alat:

Satu set elektroforesis, mikropipet dan tip, Gel Doc, Power Supply, Parafilm.

Bahan:

Sampel, Ethidium Bromide (EtBr). Gel Agarose, Loading Buffer (Loading dye), Buffer
Tri-Asetat-EDTA (TAE), Akuades.

B. Prosedur Kerja
1. Uji RT PCR
a. Dipipet R-mix sebanyak 40 µl dan dimasukkan ke dalam PCR tube
b. Ditambahkan primer forward sebanyak 4,8 µl
c. Ditambahkan primer reserve sebanyak 4,8 µl
d. Ditambahkan NFW kedalam mikrotube sebanyak 20,4 µl
e. Selanjutnya ditambahkan Enzim RT sebanyak 2 µl
f. Setelah volume akhir telah sebanyak 72 µl kemudian digunakan untuk uji ke reasi
PCR dengan membagi ke 8 kelompok.
g. 9 µl campuran ditambah 1 µl RNA template
h. Setelah semua reagent dimasukkan ke dalam tube PCR, langkah selanjutnya
masukkan tube ke dalam mesin Thermocycler dengan optimasi :
 50C selama 1 jam (Reverse Transkriptase)
 95C selama 7 menit.(Pre Denaturasi)
 94C selama 45 detik.(Denaturasi)
 52C selama 45 detik.(Annealing)
  72 C selama 1 menit.(Extention/Sintesis/Elongasi)
 Siklus No 3-5 diulang sebanyak 39 kali siklus.
 72C selama 5 menit.(Post extention)
 22C selama 0 menit (Suhu penyimpanan)
i. Setelah semua proses RT-PCR selesai pada mesin Thermocycler selesai selanjutnya
dilakukan pembacaan pada gel agarose 1% (proses elektroforesis)

2. Uji Elektroforesis
Pembuatan Gel Agarose
1) Dibuat TAE dengan kepekatan 1X dari buffer TAE 50X, dengan cara memipet 20 mL
TAE 50X dilarutkan dalam 980 mL akuades
2) 1,5 gram bubuk agarose dilarutkan pada 150 mL buffer TAE 1X
3) Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan
4) Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis
5) Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didingikan hingga
mengeras
6) Sete;ah gel tersebut menegars, sisir dapat diambil dan gel agarose siap untuk
digunakan
Elektroforesis
1) Gel agarose direndam dengan buffer Tae
2) Disiapkan kertas parafilm, ditambahkan dengan 2 gel stain diatasnya
3) Ditambahkan 2 µl loading dye dicampur dan 5 µl produk DNA pada parafilm yang
telah tersedia dengan bantuan mikropipet, lalu dicampurkan.
4) Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose
5) Sedangkan untuk 5µl DNA marker 100bp yang ditambahkan dengan 2 µl gel stain
dituangkan pada sumur/well pertama
6) Tangki elektroforesis kemudia ditutup dan dihubungkan ke power supply
7) Power supply (250mA, 100 V) dinyalakan selama 45 menit
8) Hasil running diangkat menggunakan sarung tangan, kemudian divisualisasikan pad
aUV transluminator
Pembacaan Pita DNA dengan UV Solo
1) Ditekan tombol power pada bagian kanan atas touch screen
2) Dinyalakan UV solo dengan cahaya putih, buka pintu dan letakkan gel diatas
permukaan transluminator. Tutup pintu kembali
3) Diklik icon Vision Works untuk membuka software
4) Dinyalakan cahaya UV pada transluminator pada bagian bawah kanan ON (1).
Digunakan nob untuk mengatur intensitas cahaya
5) Ppada software, tekan start preview untuk melihat gel. Untuk mengubah posisi gel.
Dimatikan lampu UV dan atur posisi gel kembali
6) Dimatikan lampu UV (transluminator)
 7) Dimatikan alat dengan menekan tombol power pada bagian kanan atas touchscreen
dan dikeluarkan gel setelah UV Solo TS selesai digunakan.

A. Hasil Pengamatan
1. Uji PCR

Gambar Keterangan

Penambahan R-mix, primer

forward, primer reverse, NFW
enzim RT dan RNA template.
Setelah semua dicampur maka
dilakukan RT PCR.

2. Hasil PCR

Jenis Virus : Parvovirus Gen VP

Gambar Hasil Hasil

Positif Negatif
Kelompok dengan Kelompok
hasil positif : dengan hasil
- Kelompok 2 negatif :
- Kelompok 3 - Kelompok 1
- Kelompok 4 - Kelompok 7
- Kelompok 5 - Kelompok 8
- Kelompok 6
Dimana terlihat
Pita positif terlihat pada gambar
pada gambar, saat tidak terbentuk
ditarik garis lurus ke pita
kiri didapatkan hasil
memiliki bp sekitar
300 bp.