LAPORAN PRAKTIKUM

KIMIA FARMASI ANALISIS 1

ANALISIS KUALITATIF SENYAWA ISONIAZID DENGAN METODE

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

Disusun oleh :
Kelompok 6 (3D Farmasi)
Pipit Pitriyani 31117181
Rafida Fasha 31117182
Rani Maharani 31117183
Renaldi Eka Mufti R 31117184
Restu Rizky Ananda K 31117185
Rifa Khoirunnisa 31116085

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN
BAKTI TUNAS HUSADA
TASIKMALAYA
2019
Praktikum ke : 11
Hari / Tanggal Praktikum : Selasa, 19 November 2019
Sampel : Isoniazid

A. Tujuan Praktikum
Tujuan percobaan adalah untuk melakukan pemisahan komponen kimia
dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) dan menentukan nilai Rf dari
noda yang diperoleh.

B. Dasar Teori
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan
komponen menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben
inert. KLT merupakan salah satu jenis kromatografi analitik. KLT sering
digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak keuntungan menggunakan
KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk dalam kategori
kromatografi planar, selain kromatografi kertas. Kromatografi juga merupakan
analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun
cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang
sifatnya hidrofobik sepertilipida –lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan
dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk
kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom,
identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil
(Gandjar et al, 2008).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu teknik yangsederhana yang
banyak digunakan, metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran
plastik yang ditutupi penyerap atau lapisan tipis dan kering. Untuk menotolkan
karutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarya menggunakan mikro pipet
atau pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan
pengelusi di dalam wadah yang tertutup (Bernaseoni,2005).
Prinsip KLT adalah adsorbsi dan partisi dimana adsorbsi adalah penyerapan
pada pemukaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau kemampuan suatu zat
yang ada dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan.
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada
(Sudarmadji et al. 2007) :
a. Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, hal inibergantung pada
bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
b. Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gelsilika.
Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel
silika. Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan
adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa.
Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam. Fasa gerak yang digunakan dalam
KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas
senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda
polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLTdipilih dengan
cara trial and error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor
retensi) yang diperoleh (Gritter et al , 1991).
Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanyadinyatakan sebagai
faktor resensi. Pada fase diam, jika dilihatmekanisme pemisahan, fase diam
dikelompokkan (Gritter et al.1991) :
a. Kromatogarfi serapan (Silika gel, alumina).
b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel).
c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina).
d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel).
Pada fase gerak, yang terjadi jika menggunakan silika gel, alumina dan fase
diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom serapan.
Sistem tak berair paling banyak digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri
pelarut mikroskop diberikan dalam tabel 25, yang meliputi (sifat hidrofob
menaik)methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform (perlu
diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan etanol)benzene,
sikloheksana, dan eter petroleum (Lipsy, 2010).
Identifikasi secara kulitatif pada kromatografi kertaskhususnya
kromatografi lapis tipis dapat ditentukan dengan menghitung nilai Rf. Nilai Rf
merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa. Harga Rf didefinisikan
 sebagai perbandingan antara jarak senyawa titik awal dan jarak tepi muka pelarut
dari titik awal (ibnu gholib, 2007).
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu.
Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa
dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai
kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa
diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat padafasa diam,
sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara
0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi
kepolaran eluen, dansebaliknya. KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu :
1. Waktu pemisahan lebih cepat
2. Sensitif artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.
3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna

C. Alat dan Bahan

1. Alat
 Plat GF254
 Chamber
 Tabung setrifugasi
 Sentrifugator
 Corong pisah
 Pipa kapiler
 Vial

2. Bahan
 Sampel isoniazid
 Air
 Propanol
 Heksana
 Etil Asetat
 Ammonia
D. Prosedur Kerja

1. Preparasi sampel

Sampel Larutkan Sentrifugasi Ambil

isoniazid dalam air analitnya

2. Prefrasi fase diam

Plat silika gel GF254 Simpan pada

diaktivasi dalam oven desikator
30menit pada suhu 105℃

3. Prefarasi fase gerak

Campuran propanol : Jenuhkan dalam

heksana : etil asetat : chamber selama 12
ammonia (5 ; 2 ; 1,7 ; 0,2) jam.

4. Proses elusi

Totolkan Masukkan pada Amati

sampel pada chamber yang kromatogram di
plat KLT berisi eluen yang sinar UV 254
dengan Pipa sudah dijenuhkan nm atau 366 nm
kapiler untuk proses elusi

Hitung RF nya

E. Hasil Pengamatan

Keterangan :

a. Sampel (Rf = 0,8)

b. Standar Isoniazid (Rf = 0,76)

c. Sampel (Rf = 0,78)

Dibawah sinar UV 254 nm

Perhitungan :

a. Standar Isoniazid
Jarak bercak = 3,9 cm
Jarak eluen = 5 cm
Jarak Bercak 3,9
Nilai Rf = = = 0,78
Jarak Eluen 5

b. Sampel

Jarak bercak = 4 cm

Jarak eluen = 5 cm

Jarak Bercak 4
Nilai Rf = = = 0,8
Jarak Eluen 5

c. Sampel

Jarak bercak = 3,8 cm

Jarak eluen = 5 cm

Jarak Bercak 3,8

Nilai Rf = = = 0,76
Jarak Eluen 5

 Eluen
Propanolol Heksana Etil asetat Ammonia
5 2 1,7 0,2

KD 20,1 1,89 6,02 22

20 2 6 22

KD Total = ([ ] propanolol x ε propanolon) + ([ ] heksana x ε heksana) +

([ ] etil asetat x ε etil asetat ) + ([ ] ammonia x ε ammonia)
5 2 1,7 0,2
= ( x 20) + ( x 2) + ( x6)+( x 22)
8,9 8,9 8,9 8,9

= 11,2359 + 0,4494 + 1,1460 + 0,4943

= 13,3256
F. Pembahasan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu metode analisis yang
digunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan
sederhana dengan prinsip yang didasarkan atas adsorpsi dan partisi. Pemisahan
dipengaruhi oleh fase gerak dan fase diam, dimana fase gerak dapat memisahkan
senyawa karena adanya perbedaan konstanta dielektrik. Zat penyerap
merupakan fase stasioner, berupa bubuk halus dibuat serba rata dan tipis di atas
lempeng kaca. Prinsip eluen tersebut dalam melewati fase diam (terelusi naik ke
atas) adalah bergerak berdasarkan prinsip partisi dimana fase gerak akan
teradsorpsi pada permukaan dan mengisi ruang-ruang diantara sel penyerap,
kemudian terpartisi.

Prinsip pemisahan noda adalah berdasarkan kepolarannya sehingga

menghasilkan kecepatan yang berbeda-beda saat terpartisi dan terjadilah
pemisahan. Untuk memisahkan noda dengan sebaik-baiknya maka digunakan
kombinasi eluen non polar dengan polar. Apabila noda yang diperoleh terlalu
tinggi, maka kecepatannya dapat dikurangi dengan mengurangi kepolaran.
Namun apabila nodanya lambat bergerak atau hanya ditempat, maka kepolaran
dapat ditambah. Pemilihan sinar UV yang digunakan yaitu UV 254 nm karena
UV ini telah mampu mewakili jenis UV . Dimana UV pendek diwakili oleh 254
nm.

Tujuan dilakukan percobaan ini yaitu untuk memperoleh jenis sampel kimia
apa yang terkandung dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis
(KLT). Pada percobaan ini, pertama-tama dilakukan penyiapan lempeng silika
gel dengan ukuran 4 x 7 cm, kemudian lempeng diberi jarak penotolan 1 cm
(atas) dan batas elusi 1cm (bawah). Setelah itu, dibuat eluen butanol : n-hexan :
etil asetat : amonia dengan perbandingan 5 : 2 : 1,7 : 0,2 dalam chamber,
kemudian dilakukan penjenuhan chamber dengan cara eluen dihomogenkan
±10 𝑗𝑎𝑚 hingga chamber dianggap jenuh. Dan yang terakhir dilakukan
penotolan sampel pada lempeng dengan cara ekstrak hasil partisi diambil
menggunakan pipa kapiler kemudian ditotolkan dengan hati-hai pada lempeng
yang telah disediakan. Dimasukkan lempeng yang telah ditotol ke dalam
chamber yang telah dijenuhkan. Apabila eluen telah mencapai batas elusi dari
silika gel maka keluarkan lempeng. Lalu diamati menggunakan lampu UV254.

Setelah dilakukan pengamatan di bawah lampu UV254, maka dapat

ditentukan perbandingan kecepatannya yang disebut dengan nilai Rf (Retention
Factor). Pada KLT, komponen gerak (eluen), karena daya serap adsorben pada
komponen-komponen tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan
berbeda yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan

tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena
adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang
terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi
cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang
tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian
kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.

Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 adalah berdasarkan

kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor
dari zat aktif sehingga panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih
panjang (UV menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata.
Mekanisme penampakan noda ini dapat disebabkan juga karena gugus OH yang
dimiliki H2SO4 sehingga berfungsi sebagai ausokrom, dimana ausokrom ini
dapat menyebabkan pergeseran batokromik yaitu pergeseran ke arah panjang
gelombang yang lebih panjang sedangkan pergeseran hipsokromik ke arah
panjang gelombang yang lebih pendek (ke arah UV hampa).

Adapun faktor yang mempengaruhi harga Rf yaitu ukuran partikel pada

absorben, derajat keaktifan dari lapisan penjerap, ketetapan perbandingan dari
eluen, konsentrasi zat yang dipanaskan, kejenuhan chamber, diameter penotol,
teknik percobaan, suhu, keseimbangan, jumlah cuplikan yang digunakan, tebal
dan kerataan dari lapisan penjerap, pelarut dan struktur kimia dari senyawa yang
sedang dipisahkan.
 Dari percobaan ini, diperoleh hasil yaitu noda yang telihat pada UV 254 nm
dengan menggunakan fraksi n-heksan adalah 3 noda dengan nilai Rf masing-
masing yaitu Rf standar 0,76 dan nilai Rf sampel yaitu 0,8 dan 0,78.

G. Kesimpulan
Dari hasil percobaan ini dapat dismpulkan bahwa sampel Isoniazid jumlah
3 titik penotolan sampel, jarak yang ditempuh pelarut 5 cm, sehingga dihasilkan
nilai Rf 0,6 sampel adalah 0,8 dan 0,78. Dengan Rf standar 0,76 dengan
mengunakan pelarut air.

H. Daftar Pustaka
Bernaseoni, G. 2005.“Teknologi Kimia” . PT Padya Pranita.Jakarta.

Gandjar, IbnuGholib dan Abdul Rahman. 2008."Kimia Farmasi Analisis”

.Pustaka Pelajar : Yogyakarta.

Gholib, Ibnu. 2007.“Kimia Farmasi Analisis” . Pustaka Pelajar :Yogyakarta.

Lipsy, P. 2010.“Thin Layer Chromatography Characterization ofthe Active

Ingredients in Excedrin and Anacin” . USA :Departement of Chemistry and
Chemical Biology, StevensInstitute of Technology.

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S. 1991.“PengantarKromatografi ” .

Penerbit ITB : Bandung.

Sudarmadji, S, dkk, 2007.“ Analisa Bahan Makanan danPertanian” . Penerbit

Liberty : Yogyakarta
I. Lampiran

Proses penjenuhan eluen Hasil elusidasi