GENETIKA REKOMBINAN

19/11

Yang dibutuhkan PCR

- Primer (reverse & forward)

- DNA template
- ddH2O
- dNTPS
- Buffer PCR
- MgCl2 kalau diperlukan

Primer ukurannya adalah 10-20 basa yang akan diamplifikasi

Primer forward : primer dibagian depan/hulu (5’ ke 3’), kalau ambil di bagian tengah tidak mewakili
hubungan kekerabatan

Primer reverse : cari bagia paling conserve dari bagian paling bawah, harus dari (3’ ke 5’). Kalau mau
pesen biar 3 ke 5 itu pesen komplemennya dan dibalik missal ATGCA pesennya TGCAT

18S : daerah ribosomal yang untuk hewan ada, bakteri ada, tumbuhan ada, tapi beda pada eukariot
sama prokariot. Yang atas itu 18S sub unit… belum bisa membedakan pada tingkat substrain (bawahnya
spesies > strain > substrain)

Kalau pake ITS : missal ada bakteri A substrainnya (1 sama 2) nah kalau pake its bisa bedain sampe
substrain. Bisa tau kekerabatannya lebih spesifik. Missal H5N1, N1 itu substrain.

Kalau bakteri pake 16S

Kalau di primer ada (C/G)TT… adalah kodon degenerative bisa untuk banyak bakteri teramplifikasi yang
basanya CTT dan GTT, kalau mau cari bakteri di alam .

Kodon genetic satu huruf = Y untuk tirosin. Tirosin untuk menyandi basa UAU UAC jadi Y …. (U/C).
Pada saat PCR dapat pita, setelah di amplifikasi lagi ga dapet. Karena 1 pada saat ambil DNA template
tidak menghomogenkan terlebih dahulu (abis dari es tidak diaklimitasi dulu/ taro di suhu ruangan)
setelah dihomogenkan baru diambil, 2 marka dirunning sebelah kiri dan kanan, di DNA marker ada
warnanya, diliat ada yang warna biru jalan kebawah kalau birunya berenti elektroforesis berhenti, dilihat
di gel elektroforesis posisinya di tengah, 3 hasil diduga positif dari awal, ada fragmen dimer

primer juga teramplifikasi kalau suhunya ga tepat bisa nempel pada temannya sendiri

THE DNA TOOLBOX

Kloning : digunakan untuk memperbanyak gen dalam waktu yang sangat singkat. teknologi yang paling
utama dalam rekayasa genetic kalau kita pengen melihat ekpresi gennya.

Rekayasa genetika dapat digunakan pada tumpahan minyak dapat dihilangkan dengan bakteri,
menghasilkan protein yang bisa mengencerkan darah, gen yang resisten pada hama di tanaman, gen
untuk mencegah ‘kecebolan’

Enzim restriksi cara memotongnya (?) pake gambar

Hasil : koloni kalo yang biru tidak mengandung rekombinan yang putih mengandung

Pustaka genom membawa semua, pustaka plasmid, pustaka cDNA mengandung semua gen yang ada di
dalam suatu organisme… hanya dipilih gen-gennya saja jadi yang dipilih RNAnya saja.

Cara mengetahui cara pustaka genom sudah komplit : kalau ukuran dari genom misalnya 3x10^6 bp,
menggunakan fitoplasmid yang enzimnya bisa memotong setiap potongan 300 basa sehingga dapat
10000 sel bakteri yang masing masing mengandung plasmid yang mengandung potongan yang berbeda
beda. Satu bakteri akan mengambil satu plasmid.

Yang dimasukkan di BAC bukan vector plasmid, yang dimasukkan adalah kromosom bakteri yang
mengandung hamper beberapa gen sekaligus. Misalnya gen tumbuhan, hewan, bakteri dll. Karena BAC
ukurannya besar makanya bisa membawa banyak gen.

BAC adalah plasmid yang ukurannya besar, hamper seukuran kromosom dari suatu bakteri.

Cara hibridisasi asam nukleat atau tambahkan metode southern blot

Beberapa teknik untuk cloning tidak bisa menampilkan ekpresi suatu gen maka bisa digunakan vector
ekspresi.

Di daerah promotor yang bisa meningkatkan ekspresi gen: enhancer

pBR322 mengandung ampilisin, tetrasiklin, ada tempat pemotongan untuk EcoRI.

Turunannya pbr322 pUC18/19 ditambah tempat pemotongan untuk enzim restriksi disebut polilinker

pUC19 yang digunakan untuk praktikum kemaren

virus yang digunakan sebagai vector ada lamda dan m13 (bakteriofage). Setelah dihilangkan materi
genetiknya, dapat membawa materi genetic 5-25 kb DNA fragmen

kalau mau melihat ekspresi virus: petri yang udah ada koloni (10) trus ditempelin sama petri lain yang
udah diinfeksi virus nanti koloninya berkurang jadi 8, yang 2 positif rekombinan, trus dilihat disebelah
mana yang hilang.

Vector lamda sifatnya mempunyai beberapa vector site, bisa untuk dipindah-pindahkan. Kita harus bisa
memasangkan kepala batang sama kakinya. Acarnya gennya dimasukkan di package dan mendapat
partikel yang sudah matang.

Virus yang berbentuk filament, M13. Bisa membawa materi genetic 6x materi genetic itu sendiri.

Site directed mutagenesis

26/11

Kalo pcr diaro di agarose hibridisasi melepaskan dipindahkan ke membrane. Membrannya ditempelin
(pindah gennya karena disfusi osmosis) tertariknya buffer ke atas sehingga gennya tertahan di
membrane.

Denaturasi, diinkubasi dengan suhu annealing, di seal di plastic yang sudah ada pelacak heterolog pada
buffernya.
Homolog : (melayang-layang) pelacak sama persis dengan gennya, berkompetisi dengan rantai dna
satunya yang lepas.

Heterolog : pelacaknya yang tidak mirip dengan sekuensnya, organismenya beda dan tidak punya gen
tersebut. Tidak berkompetisi & akan mempelnya kembali dengan gen homolognya.

Aplikasi DNA Probe: Alga hijau biru gen dilacak pake pelacak heterolog, menggunakan fragmen dari
spesies lain untuk fiksasi nitrogen. Dari pola hibridisasi yang diperoleh, walaupun ada homologi antara

Kemungkinan masih bisa nempel

- ada yang cocok
- pitanya tetep tidak bisa menempel

Yang menentukannya kestabilannya -> basa guanine dan sitosin

Pada saat PCR masih bisa teamplifikasi walaupun ga nempel, tapi kalo diPCR kedua kemungkinan tidak
terlihat. Kalo PCR berhasil terlihat pita terwarnai

Kalo hibridisais : kalo terikat pada membrane, dengan metode pewarnaan kalo ikatannya kuat nanti
pitanya tebal dan jelas. Membrane dikeluarin trus dicuci dibilas 3 kali dimasukkan ke pewrna overnight ,
warna langsung nempel ke dna, di cuci untuk menghilangkan warna sisa. Nanti hasilnya putih pitanya
tebel item/biru

Transposon terjadi secara alami atau tidak? Secara alami, disebut elemen mobile menimbulkan mutase,
masuk kedalam genome random, untuk menghasilkan gen gen yang tahan terhadap antibiotic.

Aplikasi transposon: untuk mensintesis suatu gen, gen yg menghasilkan histidine atau methionine.
Bakteri prototroph diubah menjadi auxotrof

Karakter dari transposon: mengandung daerah inverted repeat & mengandung enzim transposase

Site-directed mutagenesis : mutase terarah pada titik tertentu

Directed mutagenesis : mutase terarah

Kaset mutagenesis : gen yang sudah mutase dengan gen targetnya mirip tapi diberi perubahan basa,
kenapa bisa masuk site directed karena targetnya gen tertentu. Tidak membutuhkan pemanjangan
primer karena ada urutan basa yang tidak cocok. Dapat mengetahui gen mana yang berperan dan
dimana mutase terjadi.

Mutasi mismatch : basanya salah berpasangan