MODUL PRAKTIKUM

Mata Kuliah Dasar – Dasar Bioteknologi

Semester Genap 2019

Disusun oleh:

Dr. Ir. Delianis Pringgenies, M.Sc.

NIP: 19581007 198703 2 001

Tim Asisten :
Tiara Ulfa Bachtiarini 26020116140160
Stefanie Jessica H L 26020116130164
Defi Puspita Sari 26020116120011
Annisa Roro S 26020116140170
Sidiq Sakti Prawira 26020116120051

Departemen Ilmu Kelautan

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Diponegoro
Semarang
2019

1
 UNIVERSITAS DIPONEGORO
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

GARIS – GARIS BESAR PROGRAM PRAKTIKUM

MATA KULIAH : Dasar – Dasar Bioteknologi
KODE MK/SKS/SEMESTER : PKK416 / 3 SKS/I (Mei 2019)
TIM PENGAMPU KULIAH & : PJMK 4
PRAKTIKUM
Anggota 4

WAKTU DAN TEMPAT : Semester Genap 2019 / Laboratorium Mikrobiologi Kelautan, Jurusan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro,
PRAKTIKUM Semarang

DESKRIPSI SINGKAT MATA : Bioteknologi laut sebagai pendatang baru bidang bioteknologi berkembang sangat pesat sehingga diperlukan

KULIAH penyesuaian dengan perkembangannya. Dalam mata kuliah ini diberikan pemahaman tentang penerapan
bioteknologi untuk lingkungan laut, farmasi, suplai pangan, sumber energi terbarukan, kesehatan manusia,
proses dan produk industri, dan rekayasa marikultur berbasis bioteknologi.

STANDAR KOMPETENSI MATA : 1. Melakukan cara mengekstraksi DNA secara sederhana

KULIAH 2. Melihat presipitasi DNA

3. Mengetahui cara membuat pohon filogenetik

4. Mampu mengidentifikasi kekerabatan terdekat suatu sekuen DNA berdasarkan hasil konstruksi pohon

filogenetik

2
 Kelompok : .......................

Tanggal : .......................

MODUL I: VISUALISASI EKSTRAKSI DNA

Nama: ............................................ NIM: .................................. Ttd:.........................

1. Pengantar Teori Praktikum

1.1. Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi

genetik makhluk hidup yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus,
mitikondria, dan kloroplas. Menurut Faatih (2009), isolasi DNA merupakan langkah awal yang
bisa dilakukan untuk mempelajari DNA. Prinsip isolasi DNA ada dua, yaitu dengan sentrifugasi
dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan substansi berdasarkan berat
jenis molekul. Molekul dengan berat yang lebih besar akan berada dibagian bawah tabung dan
molekul yang lebih ringan akan berada dibagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan
dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan natan (pelet) pada bagian
bawah.

3
1.2. Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk:

1. Melatih praktikan untuk dapat melakukan ekstraksi DNA secara sederhana.

2. Melatih praktikan untuk dapat melihat presipitasi DNA dari hasil ekstraksi.

3. Melatih praktikan untuk dapat melakukan analisa hasil ekstraksi DNA.

1.3. Landasan Teori

DNA merupakan suatu polimer besar dengan properti karakteristik fisik yang unik.
Eksploitasi ukuran dan struktur kimia DNA dapat dilakukan dengan isolasi dan purifikasi.

Sebagian besar teknik isolasi DNA memerlukan lisis sel, yang dilanjutkan dengan ekstraksi
protein dengan menggunakan larutan organic berbasis fenol dan presipitasi DNA dalam
ethanol. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometri dengan
menghitung ratio hasil pengamatan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm = 1,8.
Keutuhan relative DNA dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Apabila purifikasi
diperlukan, metode kromatografi bisa digunakan atau dengan penambahan enzim RNase.

1.4. Kompetensi
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat:
1. Melakukan ekstraksi DNA dari berbagai macam sampel.
2. Melakukan analisa terhadap hasil ekstraksi DNA

1. Prosedur Kerja
a. Bahan
 95 % alcohol (ice cold)
 Stawberry, Pisang, Rumput Laut
 Lysis buffer : detergent (Shampoo Pantene Pro- V)
 Garam iodium
 Aquabidest
 Enzim protease (Cairan softlens)
 Agarose
4
  Loading Dye
 ETBR
 Buffer TAE 1X

b. Alat
 Tabung sentrifuge ukuran 50 ml atau Valcon
 Beaker glass
 Cawan petri dan spatula
 Saringan
 Perangkat Gel Elektroforesis
 UV – Transluminator

c. Metoda

 Ekstraksi DNA Pisang/Strawberry

1. Buat 100 ml buffer lisis dengan cara mengambil 90 ml air steril + 10 ml detergent + ¼
sendok garam + enzim protease secukupnya, kemudian diaduk hingga garam larut /
homogen
2. Ambil 1 buah strawberry, pisang, kemudian dibelah / dibagi menjadi 2 bagian.
3. Letakkan sebagian bahan kedalam cawan petri dan hancurkan dengan spatula hingga
menjadi cairan juice
4. Tambahkan 10 ml buffer lisis kedalam cawan petri dan tutup kembali
5. Lanjutkan mengaduk kurang lebih 2-3 menit hingga bercampur/ homogen dengan larutan
juice
6. Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit
7. Buang saringan dan ekstrak yang ada
8. Tuangkan sebanyak 30 ml 95 % alcohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50 ml
9. Lalu tuangkan larutan yang telah disaring kedalam tabung, tutup tabungnya dan amati
fraksinya hingga terjadi presipitasi sampai beberapa menit.
10. Sampel hasil ekstraksi dipindahkan ke dalam mikro tube steril dan selanjutnya dianalisa
menggunakan Gel Elektroforesis.

5
 Ekstraksi DNA Bakteri Laut (Sibero et al, 2019)

1. Bakteri Laut pada fase optimal disiapkan

2. Masukan bakteri laut secukupnya dalam larutan500 µL 0,5% saponin dalam PBS dan 100µL
ddH2O
3. Simpan pada lemari pendingin (4°C) selama 24 am.
4. Larutan yang mengandung bakteri selanjutnya di vortex dan di sentrifugasi dengan kecepatan
12.000 rpm selama 10 menit.
5. Filtrat hasil sentrifugasi dibuang
6. Tambahkan 100µL ddH-2O
7. Vortex selama 30 detik dan sentrifugasi lagi dengan kecepatan dan waktu yang sama.
8. Filtrat dibuang lagi, lalu tambahkan 50 µL 20% Chelex 100 pada natan (pelet)
9. Kemudian panaskan pada heating block selama 5 menit dengan suhu 85°C
10. Lalu diagitasi dengan menggunakan vortex hingga homogen dengan kecepatan 12.000 rpm.
11. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tube yang baru untuk digunaan dalam
amplifikasi DNA

 Gel Elektroforesis

1. Gel agarose 1% disiapkan.

2. Gel agarose 1% diletakkan ke mesin elektroforesis dan ditambahkan buffer TAE (Tris
acetat EDTA) 1X hingga terendam.
3. Sebanyak 1 µl loading dye dan 4 µl sampel dicampurkan hingga homogen menggunakan
mikropipet.
4. Campuran loading dye dan sampel dimasukkan ke dalam sumur gel agarose.
5. Proses elektroforesis dilakukan dengan mengalirkan listrik sebesar 100 volt selama 50
menit.
6. Lakukan visualisai cara dengan merendam agarose ke dalam ETBR.
7. Kemudian gel diamati menggunakan mesin UV – Transluminator.

8. Kemudian gel diamati menggunakan mesin UV – Transluminator.

6
 PCR

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30- 40 siklus :
1. Denaturasi
Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA
untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 5 menit dengan suhu 97,5°C.
2. Annealing (penempelan primer)
Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik dengan
suhu 50°C - 60°C.
3. Pemanjangan Primer (Extention)
Pada proses ini digunakan suhu 72°C diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik

7
 DATAR PUSTAKA

Faatih, Mukhlissull. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom Isoation and Digestion Of Chromosomal
DNA. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, Vol. 10. No. 1. Surakarta.

Sibero, Mada Triandala. Kustiariyah Tarman. Ocky Karna R. Agus Sabdono. Agus Trianto. Tiara Ulfa
Bachtiarini. 2018. Produksi Pigmen dan Identifikasii Kapang Penghasilnya Menggunakan
Pendekatan DNA Barcoding. JPHPI 20018, Vol. 21. No. 1. Bogor

8
 Kelompok : .......................

Tanggal : .......................

MODUL II: ANALISIS SEKUEN DNA DENGAN BLAST DAN

PENGOLAHAN DATA HASIL IDENTIFIKASI MENGGUNAKAN
PROGRAM BIOINFORMATIKA

Nama: ............................................ NIM: .................................. Ttd:.........................

1. Pengantar Teori Praktikum

1.1. Latar Belakang

Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya

seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal, dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat
promoternya. Hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang
telah terlebih dahulu diketahui biasanya menggunkan analisis dengan RDP, FASTA dan BLAST.

1.2. Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk:

1. Mengidentifikasi kekerabatan terdekat suatu sekuen DNA.

2. Mengetahui cara membuat pohon filogenetik yang menunjukan tingkat kekerabatan

terdekat.

1.3. Landasan Teori

Ketika sequen suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali gambaran yang
dapat diperoleh dari sekuens tersebut. Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui
beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal, dan kodon akhir,
atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan
kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu
diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan RDP, FASTA dan BLAST

9
1.4. Kompetensi

Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat:

1. Memiliki kemampuan mengidentifikasi kekerabatan terdekat suatu sekuen DNA.

2. Mengetahui cara membuat pohon filogenetik yang menunjukan tingkat kekerabatan

terdekat suatu sekuen DNA.

2. Prosedur Kerja

a. Alat dan Bahan

 Hasil sekuen

 Komputer

 LCD

 Koneksi internet

 Software Bioinformatika Bioedit, ClustalX dan Mega

b. Metoda

 Analisa BLAST

1. Setelah computer dihidupkan, aktifkan sambungan internet.

2. Cari Web BLAST www.ncbi.nlm.nih.gov./Blast.cgi akan muncul tampilan seperti di

bawah ini :

10
3. Click nucleotide blast.

4. Sekuen dimasukkan ke dalam kotak enter query sequence dengan cara copy/paste.

5. Pilih 16S ribosomal RNA sequences (Bacteria and Archaea) pada kolom database.

6. Klik BLAST.

7. Tunggu beberapa saat, dan hasil identifikasi sekuen bisa diamati.

8. Pilih hasil sekuen dengan homologi tertinggi.

9. Klik pada bagian accession number.

11
10. Klik tombol FASTA, kemudian copy urutan sekuen dan pindahkan ke notepad.

12
 Konstruksi Pohon Filogenetik

Langkah-langkah dalam pembuatan pohon filogentik adalah sebagai berikut :

1. Data urutan sekuen DNA sampel, Hasil BLAST dan beberapa sekuen pembanding yang
akan diolah disimpan dalam bentuk file txt (Notepad).
2. Buka program ClustalX kemudian pilih File kemudian Load Sequences.

3. Pilih data yang sudah disimpan kemudian pilih Allignment dilanjutkan Do Complete
Allignment -> Align.

4. Pilih Tree kemudian ceklish exclude, boot strap dan draw N-J tree. data akan tersimpan
dalam bentuk phb, ph dan dnd.

13
5. Selanjutnya buka program Mega.

6. Buka data yang tersimpan dalam format phb.

7. Setelah gambar filogenetik tampil selanjutnya disimpan dalam bentuk TIFF atau PDF.

14