I.4.

PRINSIP
MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari
hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang
ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan
menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang
diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.
Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu
sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam
tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak
selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang
dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel
yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang”
tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang
menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang
dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat
memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi
metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi
mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.
 Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :
 bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel
 sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri
coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).
 Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu
inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif
selama masa inkubasi tersebut.
 jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka
dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan.

Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan
bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok coliform dapat menggunakan media
Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan
garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan coliform untuk tumbuh.
 Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang paling mungkin.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

II.1. TEORI UMUM

 Metode MPN untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam praktikum digunakan
kelompok coliform sebagai indicator. Kelompok coliform mencakup bakteri yang bersifat
aerobic dan anaerobic fakultatif, batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Coliform
memfermentasikan laktosa dengan pembentukan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada
suhu 35oC (Hadioetomo,1993)
Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan yang
menggunakan medium padat (agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang
positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu
tertentu.pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk
gas dalam tabung durham (sutedjo,1991).
Metode MPN biasanya biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di
dalam contoh yang bebentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk
padat. Dalam praktikum ini suatu bahan makanan/ minuman dengan sampelnya yaitu sirup
dilakukan pengenceran secara desimal (10-1), kemudian masing-masing tabung dengan seri
3-3-3 dimasukkan 10 ml, 1 ml dan 0,1 ml ke dalam tabung yang berisi Lactosa Broth dan
tabung Durham. (sutedjo,1991).
Untuk setiap pengenceran digunakan 3 seri tabung. Setelah diinkubasi selama 2 x 24
jam dengan suhu 37°C, maka akan dapat dilihat tabung yang positif yaitu tabung yang
ditumbuhi mikroba yang dapat ditandai dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham.
Lalu diamati tabung yang terdapat gas/ gelembung dan berwarna keruh sehingga kombinasi
tabung yang positif dari uji duga dan uji penegasan dapat dicocokkan dengan tabel MPN-seri
9 tabung. (sutedjo,1991).

Prosedur pengujian MPN Coliform sesuai Metode Analisis Mikrobiologi (MA PPOM
69/MIK/06) yaitu dengan cara menyiapkan dua tabung reaksi masing-masing berisi 9
ml PDF. Dari hasil homogenisasi pada penyiapan sampel dipipet 1 ml pengenceran 10-1 ke
dalam tabung PDF pertama hingga diperoleh suspense dengan pengenceran 10-2 lalu dikocok
sampai homogen. Selanjutnya dibuat pengenceran 10-3. Ada dua tahap pengujian MPN
Coliform yaitu : (BPOM RI, 2006)

1. Uji Praduga (Presumtif Test)

Untuk mendapatkan pengenceran disiapkan 3 tabung reaksi berisi 9 ml MCB yang
dilengkapi tabung durham. Kedalam tiap tabung dari masing masing seri dimasukkan 1 ml
suspensi pengenceran. Diiinkubasi pada suhu 37° C selama 24-48 jam. Setelah 24 jam dicatat
dan diamati adanya gas yang terbentuk dalam tiap tabung, kemudian inkubasi dilanjutkan
hingga 48 jam dan dicatat tabung-tabung yang menunjukkan uji positif.

2. Uji Penegasan
Biakan dari tabung yang menunjukkan uji praduga positif dipindahkan 1 sengkelit ke
dalam tabung reaksi berisi 10 ml BGLB yang telah dibungkus tabung durham. Seluruh
tabung diiinkubasi pada suhu 37 °C selama 24- 48jam. Dilakukan pengamatan adanya
pembentukkan gas. Pernyataan hasil dari uji MPN coliform ini yaitu jumlah tabung yang
positif gas dicatat dan dirujuk ke tabel MPN. Angka yang diperoleh pada table MPN
 menyatakan jumlah bakteri coliform dalam tiap gram/tiap ml sampel yang diuji (BPOM RI,
2006).

Mikroorganisme sebagai indikator air :

Pada pemeriksaan mikrobiologi yang rutin terhadap air untuk menentukan aman tidaknya
untuk diminum, tidaklah cukup bila mendasarkan uji-uji yang digunakan hanya terhadap
adanya mikroorganisme patogenik karena alas an sebagai beikut :
1) Kemungkinan besar pathogen masuk kedalam air secara sporadic, tetapi karena tidak dapat
bertahan hidup lama mungkin saja tidak dapat bertahan hidup lama mungkin saja tidak
terdapat di dalam contoh air yang dikirimkan ke laboratorium.
2) Bila terdapat jumlahnya amat sedikit, maka besar kemungkinan patogen-patogen tersebut
tidak terdeteksi oleh prosedur laboratorium yang digunakan.
3) Hasil pemeriksaan laboratorium baru dapat diketahui setelah 24 jam atau lebih. Arabia
ternate ditemukan adanya patogen sementara itu tetntunya banyak orang telah mengkonsumsi
air tersebut dan tereksposisi terhadap infeksi sebelum dapat dilakukan usaha untuk mengatasi
situasi tersebut.
Beberapa spesies atau kelompok bakteri telah dievaluasi untuk menentukan sesuai
tidaknya untuk digunakan sebagai organism indikator. Diantaranya organism-organisem yang
dipelajari, yang hamper memenuhi semua persyaratan suatu organism indikator yang ideal
adalah Escherica coli dan kelompok bakteri coli lainnya. Bakteri-bakteri tersebut dianggap
sebagai indikator polusi tinja yang dapat diandalkan.
Escherichia Coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman, Theodor
Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan. Pada 1885, beliau
menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri coli (Escherich 1885) dengan
membangun segala perlengkapan patogenitasnya di infeksi saluran pencernaan. Nama
“Bacterium Coli” sering digunakan sampai pada tahun 1991. Ketika Castellani dan Chalames
menemukan genus Escherichia dan menyusun tipe spesies E. Coli.
Escherichia coli dan bakteri coliform lain
Escherichia coli adalah penghuni normal saluran pencernaan manusia dan hewan
berdarah panas. Biasanya tidak patogenik, anggota lain kelompok koliform adalah Klebsiella
pneumonia, yang tersebar ialah luas dialam terdapat dalam tanah, air, dan paddi-padian, dan
juga dalam saluuran pencernaan manusia dan hewan. Eterobacter aerogenes, sejenis bakteri
koliform yang terdapat dalam saluran pencernaan manusia dan juga terdapat dalam tanah, air,
koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri yang berbentuk batang gram
negative, tidak membentuk spora, aerobic dan anaerobic fakultatif yang memfermentasikan
laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam wakti 48 jam pada suhu
350C. (sutedjo,1991).
Kelompok koliform mempunyai beberapa cirri yang juga dimiliki oleh anggota-anggota
genus Salmonella dan shigella, yaitu duagenera yang mempunyai spesies-spesies enteric
patogenik. Namun, ada juga perbedaan biokimiawi utama yang nyata yaitu bahwa koliform
dapat memfermentasikan lactose dengan menghasilkan asam dan gas, sedangkan salmonella
dan shigella tidak memfermentasikan laktosa. (sutedjo,1991).
 II.2. URAIAN MIKROBA
II.2.1. KLASIFIKASI MIKROBA
a. Escherichia coli

Kingdom : Protista
Filum : Protophyta
Kelas : Schyzomycutes
Ordo : Enterobacteriales
Family : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Species : Escherichia Coli

II.3. MORFOLOGI MIKROBA

a. Escherihia coli
E. Coli dari anggota family Enterobacteriaceae. Ukuran sel dengan panjang 2,0 – 6,0 μm
dan lebar 1,1 – 1,5 μm. Bentuk sel dari bentuk seperti coocal hingga membentuk sepanjang
ukuran filamentous. Tidak ditemukan spora.. E. Coli batang gram negatif. Selnya bisa
terdapat tunggal, berpasangan, dan dalam rantai pendek, biasanya tidak berkapsul.bakteri ini
aerobic dan dapat juga aerobic fakultatif.
E.coli berbentuk besar (2-3 mm), circular, konveks dan koloni tidak berpigemn pada
nutrient dan media darah. E. Coli dapat bertahan hingga suhu 600C selama 15 menit atau
pada 550C selama 60 menit.

BAB III
METODE PRAKTIKUM

III.1. ALAT DAN BAHAN

III.1.1. Alat-alta yang digunakan
1. Erlenmeyer 100 mL
2. Erlenmeyer 500 mL
3. Rak Tabung
4. Lampu Spiritus
5. Tabung Reaksi
6. Sprayer + Alkohol
7. Spoit 10 mL
8. Spoit 1 mL
9. Tabung Durham
10. Pipet Ukur
11. Karet Penghisap

III.1.2. Bahan yang digunakan

1. MCB (Media)
2. BGLB 2 % (Media)
3. Aquadest
4. Air sumur
5. NaCl fisiologi
6. Alcohol 70%
7. Tissue
8. Minyak Bunsen

III.2. CARA KERJA

III.2.1. Penyiapan sampel
1. Persiapan Alat

 Tabung reaksi di bersihkan sekitar 120 tabung, tabung durham juga di bersihkan.
 Kemudian di keringkan. Tabung durham di masukkan ke dalam tabung reaksi.

2. Perhitungan Media

- BGLB 2% = 2/100 x 1000

= 20 gram
- MCB = 2/100 x 1000
= 20 gram

3. Pembuatan Media

1) Media MCB dan BGLB 2% di timbang masing- masing 20 g untuk 500 mL

2) Masukkan media ke dalam Erlenmeyer
3) Dilarutkan dengan air 500 mL, sedikit demi sedikit, di kocok.
4) Kemudian di sumbat dengan kapas.
5) Di panaskan ke dalam belanga sampai mendidih dan homogen.
6) Setelah di panaskan, media di dinginkan. Kemudian setiap media di pipet 9 mL dan di
masukkan ke dalam tabung reaksi, yang telah berisi tabung durham di dalamnya.
7) Setelah semua tabung reaksi terisi oleh media, tabung-tabung itu di bungkus dengan kertas
untuk di sterilisasikan ke dalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit.
8) Setelah sterilisasi, media di dinginkan dan di simpan ke dalam kulkas untuk di gunakan
keesokan harinya.

4. Prosedur Kerja

1. Di siapkan alat dan bahan

2. Di pipet sampel yakni air sumur sebanyak 10 mL, dan di masukkan ke dalam Erlenmeyer
steril
3. Di pipet NaCl Fisiologis sebanyak 90 mL dan di masukkan ke dalam Erlenmeyer berisi
sampel, di kocok hingga homogen.
4. Kemudian dilakukan faktor pengenceran sebanyak 2x. Di pipet 1 mL sampel di dalam
Erlenmeyer steril (10-1) dan di masukkan ke dalam tabung reaksi (10-2) yang berisi 9 mL
NaCl Fisiologis. Di kocok, kemudian di pipet kembali 1 mL sampel di dalam tabung reaksi
(10-2) dan di masukkan ke dalam tabung reaksi (10-3) yang berisi 9 mL NaCl Fisiologis, dan
di kocok homogen.
5. Setelah itu, di siapkan 9 tabung reaksi yang berisi 9 mL MCB dan di lengkapi tabung
durham di dalamnya.
6. Di pipet 1 mL pengenceran 10-1 dan di masukkan ke masing_ masing 3 tabung reaksi MCB.
Di lakukan hal yang sama pada pengenceran 10-2 dan 10-3.
7. Setelah itu, media di bungkus kembali dengan kertas dan di inkubasi pada suhu 350 -370C
selama 2 x 24 jam.
8. Di lakukan pengamatan dan di catat tabung yang menunjukkan uji presumtif positif yaitu
terbentuknya di dalam tabung durham dan perubahan warna media menjadi kuning.
9. Setelah di amati, di lakukan uji konfirmasi dengan di pindahkan 1 sengkelit biakan dengan
menggunakan ose dari tabung yang menunjukkan uji presumtif positif ke dalam tabung
reaksi yang berisi BGLB 2% sebanyak 10 mL yang di lengkapi tabung durham.
10. Kemudian di bungkus kembali dengan kertas dan di inkubasi selama 2 x 24 jam dengan suhu
370C.
11. Setelah itu di lakukan pengamatan kembali dan di catat tabung yang menunjukkan reaksi
positif yaitu terbentuknya gas dalam tabung durham.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN

IV.1. HASIL PENGAMATAN

I. Tabel pengamatan
Dalam percobaan MPN dengan sampel air sumur, terdapat beberapa tabung yang
menunjukkan tabung positif pada uji persumtif dan uji konfirmasi, yakni sebagai berikut :

a Uji Persumtif
Hari / Tanggal Jumlah tabung positif AMP per gram/mL
10-1 10-2 10-3
Senin,
7-05-2012 3 3 3 > 1100
b Uji Konfirmasi
Hari / Tanggal Jumlah tabung positif AMP per gram/mL
10-1 10-2 10-3
Rabu, ---
9-05-2012 0 3 3 ( Tidak terdapat
pada table MPN )