Anda di halaman 1dari 11

26

BAB III
BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat


Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Januari sampai dengan Juli 2016,
bertempat di Balai Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) yang terletak di kaki
Gunung Tangkuban Perahu, yang berlokasi di Jl. Tangkuban Perahu No. 517 Desa
Cikole Kecamatan Lembang Kabupaten Bandung Barat Provinsi Jawa Barat
tepatnya pada 107o 30’ Bujur Timur dan 60o 30’ Lintang Selatan, berada pada
ketinggian tempat ± 1.250 meter di atas permukaan laut (mdpl) dengan suhu rata-
rata harian berkisar antara 19-24 oC, kelembaban udara berkisar 39-90% dan rata-
rata curah hujan 2.207,5 mm/tahun. Ditinjau dari segi geologis jenis tanah di
daerah tersebut merupakan tanah Andisol sehingga daerah tersebut sangat cocok
dijadikan pusat penelitian dan pengembangan tanaman sayuran.

3.2. Bahan dan Alat Percobaan


3.2.1. Bahan yang digunakan
Adapun bahan-bahan yang digunakan selama proses percobaan adalah :
bibit tanaman bawang merah var. mentes sebanyak 540 umbi, tanah/media tanam,
pupuk organik, isolat Actinomycetes (koleksi Balai Penelitian Tanaman Sayuran),
suspensi isolat Actinomycetes, air destilata (aquades), media Potato Dextrose
Agar (PDA), media Starch Nitrat Agar (SNA), media pikovskaya, pupuk NPK
majemuk, alcohol, chlorox dan air bersih.

3.2.2. Alat yang digunakan


Adapun alat-alat yang digunakan selama proses percobaan ini, antara lain :
polybag ukuran 40 x 40 cm, cawan petri, gelas ukur, baskom, embrat, Laminar
Air Flow Cabinet (LAFC), autoclave, jarum ose, papan nama, gelas ukur, shacker,
vortex, cork borer, timbangan analitik, haemocytometer, wrapping plastics,
mikroskop digital, kamera, alat tulis dan mikropipet.

3.3. Metode Penelitian


26
27

Metode penelitian yang digunakan dalam percobaan ini adalah metode


eksperimental dengan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktorial.
a. Faktor pertama adalah jenis isolat Actinomycetes (A) yang terdiri dari 6 (enam)
taraf, yaitu :
- A0 = Tanpa Isolat (Kontrol)
- A1 = Isolat SW13
- A2 = Isolat SW5
- A3 = Isolat BYM1
- A4 = Isolat BYM4
- A5 = Isolat SIO5
b. Faktor kedua adalah dosis suspensi Actinomycetes (B) yang terdiri dari 3 (tiga)
taraf, yaitu :
- B1 = dosis suspensi 5 ml/tanaman
- B2 = dosis suspensi 10 ml/tanaman
- B3 = dosis suspensi 15 ml/tanaman
Total kombinasi perlakuan sebanyak 18 (delapan belas) perlakuan dan
diulang sebanyak 3 (tiga) kali sehingga terdapat 54 plot penelitian, satu plot terdiri
dari 10 tanaman, seperti disajikan dalam Tabel 2. di bawah ini :

Tabel 2. Jenis Perlakuan Percobaan.


No. Kombinasi Perlakuan No. Kombinasi Perlakuan
1. A0B1 10. A3B1
2. A0B2 11. A3B2
3. A0B3 12. A3B3
4. A1B1 13. A4B1
5. A1B2 14. A4B2
6. A1B3 15. A4B3
7. A2B1 16. A5B1
8. A2B2 17. A5B2
9. A2B3 18. A5B3
Keterangan :
A0 : Kontrol (Air), A1 : Isolat SW13, A2 : Isolat SW5, A3 : Isolat BYM1, A4 : Isolat
BYM4, A5 : Isolat SIO 5, B0 : Kontrol (Air), B1 : konsentasi suspensi 5 ml/tanaman,
B2 : dosis suspensi 10 ml/tanaman, B3 : dosis suspensi 15 ml/tanaman.
28

Model linear untuk Rancangan Acak Kelompok (RAK) Faktorial menurut


Herdiyantoro, D (2013) adalah sebagai berikut :

Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + ρk + εijk


Keterangan :
Yijk : Pengamatan pada satuan percobaan ke-i yang memperoleh kombinasi
perlakuan taraf ke-j dari faktor A dan taraf ke-k dari faktor B
µ : Mean populasi
ρk : Pengaruh taraf ke-k dari faktor Kelompok
αi : Pengaruh taraf ke-i dari faktor A
βj : Pengaruh taraf ke-j dari faktor B

(αβ)ij) : Pengaruh taraf ke-i dari faktor A dan taraf ke-j dari faktor B
εijk : Pengaruh acak dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi

perlakuan ij. εijk ˜ N(0,ơ2)

Hipotesis yang diuji dalam percobaan ini dinyatakan sebagai berikut :


H0 : t1 = t2 = t3
H1 : Paling sedikit sepasang t1 tidak sama
Jika : Fh ≤ F Tabel, maka H0 di terima (non significant)
Fh ≥ F Tabel, maka H0 di tolak (significant)

Bila hasil uji F menunjukkan perbedaan nyata, maka untuk membedakan


rata-rata dari tiap perlakuan dilakukan uji lanjutan dengan metode uji jarak
berganda Duncan pada taraf 5% dengan rumus sebagai berikut :
a. Pengaruh faktor tunggal A:

b. Pengaruh faktor tunggal B:

c. Pengaruh interaksi AxB:

LSR = SSR x Sx
29

Keterangan:
LSR = Least Significant Ranges
SSR = Studentized Significant Ranges

3.4. Pelaksanaan Penelitian


3.4.1. Isolasi Actinomycetes
Isolasi dilakukan sebagai penapisan untuk menemukan isolat
Actinomycetes yang dilakukan secara in vitro. Isolat diperoleh dari rhizosfer
tanaman sayuran organik sehat yang terdiri dari siomak, sawi, bayam. Rhizosfer
sayuran berasal dari Parongpong (Jawa Barat). Penanaman sampel dilakukan
dengan menggunakan metode pour plate melaui pengenceran berseri 10-1 hingga
10-5. Isolat Actinomycetes dibiakkan pada media Starch Nitrat Agar (SNA)
dengan komposisi (gram/liter aquades) : MgSO4.7H2O (0,5), FeSO4.7H2O
(0,01), NaCl (0,5), KNO3 (1), K2HPO4, (0,5) amilum (tepung kanji) (20),
agar teknis (20). Adapun prosedur pelaksanaan isolasi tersebut adalah :
1. Sampel yang berasal dari rhizosfer tanaman sayuran organik disiapkan untuk
selanjutnya dikeringanginkan selama 5 hari pada suhu ruang.
2. Sebanyak 10 gram sampel tanah ditimbang dan dimasukkan ke dalam 90 ml
akuades untuk diaduk menggunakan shacker selama 1 jam.
3. Pengenceran 10-1 dimulai dengan pengambilan sebanyak 1 ml larutan sampel
dan dimasukkan ke dalam 9 ml akuades untuk diaduk menggunakan vortex.
4. Hal yang sama dilakukan hingga taraf pengenceran berseri 10-5.
5. Selanjutnya hasil pengenceran diinkubasikan selama 2 minggu.
Pengamatan presentase pertumbuhan Actinomycetes dilakukan pada hari
ke-7 (tujuh) setelah isolasi dan isolat yang diduga Actinomycetes dimurnikan
pada media SNA untuk ditumbuhkan pada cawan petri yang baru.
3.4.2. Uji Antagonis secara in vitro
Uji antagonis dilakukan utuk menguji pengaruh penghambatan
Actinomycetes terhadap pertumbuhan dan perkembangan penyakit Layu
Fusarium yang disebabkan oleh cendawan F. oxysporum pada bawang merah
secara in vitro. Pengujian dilakukan pada media PDA dengan metode dual culture
antara bakteri Actinomycetes dengan cendawan patogen F. oxysporum. Sumber
30

isolat F. oxysporum merupakan koleksi dari laboratorium Mikologi-Bakteriologi


Balai Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) Lembang. Cendawan patogen F.
oxysporum diambil dengan metode cork borer yaitu dengan meletakkan patogen
di tengah cawan petri, sementara isolat Actinomycetes digores secara memanjang
dengan jarak 2 cm dari pinggir cawan petri untuk diinkubasi selama 14 hari pada
suhu ruang. Setelah 14 hari, persentase penghambatan dihitung dengan
menggunakan perhitungan PIGR (percentage inhibition of radial growth)
(Dwiastuti, dkk., 2015) :

Keterangan :
P : Presentase Penghambatan
R1 : Diameter Kontrol
R2 : Diameter Perlakuan
Sebanyak 5 isolat terbaik hasil uji antagonis yang menunjukkan pengaruh
penghamabatan F. oxysporum akan digunakan sebagai perlakuan dalam uji
keefektifan Actinomycetes secara in planta.

A A

K P

R1 R2 A
A

Gambar 8. Skema Penempatan Cendawan Patogen dengan Cendawan Antagonis


Metode Dual Culture. P = koloni cendawan patogen, A = koloni
cendawan antagonis uji, R1 = jari-jari kontrol, R2 = jari-jari koloni
patogen yang dihambat antagonis.
3.4.3. Peremajaan bakteri Actinomycetes
Isolat Actinomycetes yang digunakan merupakan hasil eksplorasi dan
isolasi bakteri di Laboratorium Mikologi-Bakteriologi Balitsa Lembang.
Sebanyak 5 isolat terbaik hasil uji antagonis dihilangkan masa dormannya dengan
cara didiamkan selama 1x24 jam pada suhu ruang untuk kemudian diremajakan
31

pada media SNA. Isolat yang telah diremajakan akan digunakan untuk
diaplikasikan ke tanaman. Prosedur pelaksanaannya adalah :
1. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan, meliputi media SNA, api
bunsein, isolat yang akan diremajakan, label, wrapping plastics, jarum ose
steril, alkohol.
2. Langkah pertama untuk menjaga agar tidak terjadi kontaminasi, alkohol
disemprotkan ke kedua tangan, kemudian api bunsein dinyalakan. Langkah
pengerjaan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC).
3. Isolat yang akan diperbanyak diambil dengan menggunakan jarum ose steril,
kemudian dipindahkan ke cawan petri baru yang berisi media SNA dengan pola
zigzag. Hasil peremajaan direkatkan menggunakan wrapping plastics.
4. Isolat yang telah diperbanyakan diberi label berisi jenis isolat dan tanggal.

3.4.4. Penyediaan Suspensi Actinomycetes


Biakan isolat Actinomycetes berumur 7 hari sebanyak 2 cawan petri
dilarutkan dalam aquades 1000 ml untuk diaduk menggunakan shacker dengan
kecepatan 100-150 rpm selama 7 hari. Kerapatan dihitung dengan mengambil 1
ml suspensi dan meletakannya pada haemositometer. Kerapatan suspensi yang
digunakan yaitu hasil pengenceran taraf 107. Formulasi suspensi Actinomycetes
diaplikasikan dengan cara disiramkan pada tanaman, dan dilakukan setiap 7 hari
sekali dimulai pada saat tanaman berumur 1 HST hingga 84 HST. Perhitungan
kerapatan spora dilakukan melalui pengenceran berseri. Adapun prosedur
pelaksanaannya adalah :
1. Sebanyak 1 ml suspensi isolat yang akan dihitung kerapatan sporanya
dimasukkan ke dalam test tube pertama dan diisi aquades hingga 10 ml.
Suspensi kemudian diaduk menggunakan vortex hingga homogen.
2. Setelah homogen, sebanyak 1 ml suspensi diambil dengan menggunakan
mikropipet untuk dimasukkan ke dalam test tube ke dua dan diaduk hingga
homogen. Larutan suspensi tersebut kemudian dinamakan sebagai pengenceran
berseri 101.
3. Langkah kerja yang sama diulangi hingga pengenceran berseri 107.
32

3.4.5. Uji Keefektifan Bakteri Actinomycetes secara in planta


1. Persiapan Umbi
Umbi yang digunakan adalah umbi bawang merah var. mentes milik Balai
Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) Lembang. Secara fisik umbi dinilia telah
siap tanam bila dilihat dari ciri-cirinya, yaitu telah memiliki titik-titik akar atau
telah muncul tunas-tunasnya.

2. Penanaman Bawang Merah


Prosedur kerja penanaman tanaman bawang merah, adalah :
a. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan, meliputi, polybag, tanah,
pupuk organik, bibit bawang merah var. mentes, dan air bersih.
b. Polybag kapasitas 5 kg (± 40 x 40 cm).
c. Tanah dan pupuk organik dipersiapkan, keduanya di aduk hingga merata dan
menghasilkan komposisi media tanam.
d. Media tanam yang telah siap kemudian dimasukkan ke dalam polybag yang
telah tersedia.
e. Umbi yang akan ditanam direndam ke dalam suspensi isolat Actinomycetes
selama 5 menit sesuai perlakuan.
f. Umbi kemudian ditanam ke dalam media tanam yang telah tersedia.
g. Siram dengan air untuk mempertahankan kondisi kelembapan tanah.
h. Setelah selesai, tanaman bawang merah ditata rapi sesuai tata letak percobaan.

3. Pemeliharaan
a. Pemupukan Susulan
Pemupukan susulan diberikan sebanyak dua kali. Pemberian dilakukan
setelah bibit bawang merah berumur 15 HST dan 30 HST. Jenis pupuk yang
digunakan adalah Pupuk NPK 16 : 16 : 16 dengan dosis 600 kg/ha/masa tanam
atau masing-masing tanaman memperoleh pupuk sebanyak 2,25 gr. Pemupukan
dilakukan dengan cara disiram. Sebanyak 2,25 gr NPK dilarutkan dalam 15 ml
larutan air untuk setiap aplikasi.
b. Penyiangan
33

Penyiangan merupakan kegiatan membersihkan areal penanaman bawang


merah agar terbebas dari gangguan gulma atau tanaman lain yang tidak
diharapkan keberadaannya. Penyiangan dilakukan setiap interval 15 hari
setelah tanam atau lebih, tergantung volume tanaman penganggu.
c. Pengairan
Pengairan atau penyiraman dilakukan pada saat tanaman berusia 0-10 hari,
penyiraman rutin dilakukan setiap pagi dan sore hari. Setelah berumur 10 hari,
intensitas penyiraman dapat dikurangi hingga cukup sehari sekali hanya pada
sore maupun pagi. Namun pada pelaksanaannya penyiraman dilakukan sesuai
kondisi tanah. Apabila tanah masih dalam keadaan lembab, penyiraman relatif
tidak diperlukan agar tidak terlalu basah atau menggenang. Namun apabila
tanah berada dalam keadaan kering, penyiraman dilakukan sesuai kebutuhan.
d. Pengendalian Hama dan Penyakit melalui aplikasi suspensi isolat
Actinomycetes sesuai perlakuan

4. Pemanenan
Indeks panen yang digunakan untuk bawang merah adalah jumlah hari
sejak tanam. Tanaman Bawang merah var. mentes telah siap panen pada usia 90
HST. Pemanenan dapat dilakukan apabila daun telah 80 % menguning dan
leher batang telah gembos atau kosong dan umbi telah menyembul
kepermukaan tanah serta berwarna hijau (Suwandi, 2014). Ciri-ciri lain adalah
sebagian umbi tersembul ke permukaan tanah dan sudah terjadi pembentukan
pigmen merah dan timbulnya bau bawang yang khas serta daun bagian atas
mulai rebah. Pemanenan dilakukan dengan cara menggali media tanam untuk
diambil umbinya atau dicabut menggunakan tangan secara hati-hati kemudian
setiap satu kepal diikat pada 1/3 daun bagian atas untuk mempermudah
penanganan berikutnya (Balitbang, 1995).
5. Pengamatan
1. Pengamatan Utama
Variable pengamatan utama dalam penelitian ini adalah intensitas serangan
penyakit F. oxysforum yang dilakukan dengan cara menghitung jumlah
tanaman yang terserang (ditandai dengan daun yang menguning dan cenderung
34

terpelintir/terputar) dan jumlah keseluruhan tanaman yang diamati dalam setiap


plot. Pengamatan dilakukan pada seluruh populasi tanaman yang tersedia.
Pengamatan Intensitas serangan penyakit dihitung dengan formula menurut
Nurhayati (2011) yaitu:

I= x 100%

Keterangan :
I = Intensitas serangan (%)
n = Jumlah tanaman yang terserang
N = Jumlah tanaman yang diamati

2. Pengamatan Penunjang
a. Tinggi Tanaman
Pengamatan terhadap tinggi tanaman dilakukan sebanyak 11 kali, dimulai pada
saat tanaman berumur 14 HST, 21 HST, 28 HST, 35 HST, 42 HST, 49 HST, 56
HST, 63 HST, 70 HST, 77 HST dan 84 HST. Cara mengukur tingi tanaman
adalah dengan menggunakan alat ukur penggaris. Pengukuran dimulai pada
bagian pangkal batang di atas permukaan tanah hingga ke ujung daun.
Pengukuran dilakukukan pada seluruh plot tanaman tersedia.
b. Jumlah Rumpun
Jumlah rumpun diperoleh dengan cara menghitung total jumlah rumpun
bawang merah saat pertumbuhan. Penghitungan dilakukan secara manual pada
semua plot tanaman yang tersedia.
c. Bobot Akhir Tanaman
Bobot akhir tanaman diperoleh dengan menimbang bobot tanaman pada saat
panen pada masing-masing sample penelitian. Penimbangan dilakukan dengan
menggunakan timbangan elektrik.

3.4.6. Uji Lanjutan


Uji lanjutan dilakukan untuk mengetahui jenis isolat yang mengkoloni
jaringan tanaman dan efektifitas penggunaan isolat selama proses pengujian in
planta dilakukan. Pengujian dilakukan dengan dua metode, yaitu melalui uji
tanah dan uji kolonisasi isolat.
35

1. Uji Tanah
Uji tanah dilakukan pada media tanah yang digunakan selama pengujian
in planta. Untuk melaksanakan uji tanah diperlukan alat dan bahan meliputi, 5
sample tanah, aquades, media PDA, media SNA, dan media Pikovskaya, test tube,
vortex, mikro pipet
Langkah kerja pelaksanaannya adalah :
a. Sebanyak 5 sample ditimbang dengan menggunakan timbangan elektrik,
masing-masing seberat 0,5 gram.
b. Sample kemudian dimasukkan ke dalam test tube dan tambahkan
sebanyak 10 ml air aquades kedalamnya.
c. Sample diaduk dengan menggunakan vortex hingga homogen
d. Sebanyak 1 ml larutan sample diambil dengan menggunakan mikro pipet
dan dipindahkan ke test tube baru yang telah diisi 9 ml air aquades sebelumnya.
Langkah tersebut dinamakan pengenceran berseri taraf 10-1.
e. Langkah kerja diulangi hingga pengenceran berseri taraf 10-5.
f. Hasil pengenceran berseri taraf 10-5 ditanam kembali di 3 (tiga) media
berbeda untuk melihat jenis mikroba yang ada didalamnya, yaitu pada media
PDA, media SNA dan media Pikovskaya.
g. Hasil penanaman diinkubasi selama 7 hari untuk diamati perkembangannya.

2. Uji Kolonisasi Isolat


Uji kolonisasi isolat dilakukan pada media pangkal tumbuh tanaman
baawng merah. Untuk melaksanakan uji kolonisasi tersebut diperlukan alat dan
bahan meliputi, titik tumbuh 5 sample tanaman, aquades, media PDA, media SNA
dan media Pikovskaya, test tube, morter, mikro pipet. Adapun langkah
pengerjaannya adalah :
a. Sample yang akan diuji diambil bagian titik tumbuhnya dengan cara memotong
secara horizontal bagian pangkal umbi.
b. Sample dibersihkan dengan air mengalir dan air aquades. Selanjutnya sample
direndam di dalam chlorox selama beberapa detik.
c. Morter disiapkan dan sample digerus hingga lembut dan tambahkan air aquades
kedalamnya.
36

d. Sample ditanam pada media dengan menggunakan mikro pipet.


e. Hasil diinkubasi selama 7 hari untuk diamati perkembangannya.