Anda di halaman 1dari 17

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

ACARA 6

MORFOLOGI DAN PEWARNAAN BAKTERI

Oleh :

NAMA : APRIANTO

NIM : 1811050039

KELAS : 3A

TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK D4

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

2019
A. TUJUAN
1. Mengetahui teori dasar pengelompokan pewarna biologis untukbakteri beserta tenik-
teknik pewarnaan bakteri.
2. Melakukan dan terampil dalam pembuatan preparat apus bakteri
3. Melakukan dan terampil dalam pewarnaan bakteri yang meliputi pewarnaan
sederhana dan pewarnaan diferensial
4. Mengetahui dan memahami tentang, bentuk, susunan, dan bagian-bagian dari sel
bakteri.

B. LATAR BELAKANG
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroba atau mikroorganisme.
Karena ukurannya yang sangat kecil dan sukar dilihat oleh mata biasa, maka mikroba hanya
dapat dilihat menggunakan mikroskop. Mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba
dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang masih hidup tanpa diwarnai
dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan diwarnai. Melihat dan mengamati
bakteri dalam keadaan hidup merupakan hal yang sangat sulit, selain karena bakteri tidak
berwarna, bakteri juga transparan dan kecil. Bakteri yang hidup akan kontras dengan air
dimana sel-sel tersebut disuspensikan. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan
sebuah teknik pewarnaan bakteri, sehingga sel mudah diamati. Agar lebih mudah diamati
bakteri diwarnai dengan zat warna, beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri
juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Adanya pewarnaan
terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran yang retif kecil akan lebih mudah
untuk diamati di bawah mikroskop.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spiral, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan mewarnai menggunakan zat pewarna. Mikroba sulit dilihat dengan
cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang
menyebabkan berkembangnya teknik pewarnaan bakteri. Zat warna akan mengadsorbsi
dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat
ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur pada mikroba
yang diamati. Terdapat juga beberapa faktor pewarnaan yang akan dipelajari dan
dilakukan dalam praktikum kali ini. Pada praktikum kali ini, digunakan bakteri Bacillus
sp untuk pengamatan dengan empat teknik pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana,
pewarnaan gram, pewarnaan negatif dan pewarnaan spora.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga
sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Pewarnaan merupakan salah satu cara yang paling sering digunakan untuk
membedakan mikroorganisme, khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif dan gram
negative. Kedua jenis bakteri dibedakan berdasarkan komponen penyusun dinding sel.
Selain tiu, pewarnaan spora dapat membedakan ada/tidaknya spora dan letak dari spora
tersebut di dalam sel.
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam
langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel
bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif
dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel
selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara
dua lapis membran sel.
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difensial. Dalam proses ini, olesan bakteri yang
sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan seperti zat pewarna Kristal violet, larutan
iodium,larutan alcohol (pemucat), dan zat pewarna tandingannya (counter strain) berupa
zat warna safranin. Hasil pewarnaan pada bakteri Gram positif berwarna ungu, sedangkan
pada bakteri Gram negative berwarna merah.
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu jenis pewarna untuk mewarnai
organisme. Zat warna yang akan digunakan umumnya bersifat alkalin. Pewarnaan
sedehana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe
morfologi (coccus, villario, basillus, dll),dari bahan-bahan lainnya yang diwarnai
(Hadiutomo, 1990). Hasil pewarnaan sel dengan metoda ini menghasilkan satu warna. Zat
warna yang dapat digunakan untuk pewarnaan ini adalah biru metilen (30-60 detik)
berwarna biru, Kristal violet (10 detik) berwarna ungu dan fuchsin karbol (5 detik)
berwarna merah.
Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genus bacillus dan clostridium. Pada
umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan ukuran yang berbeda. Spora
pada bakteri dibentuk pada kondisi secara kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang
menguntungkan misalnya nutrisi, sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang
digunakan untuk melihat spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan
Donner. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak
spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel), terminal (
letak spora ada diujung sel) dan sub terminal (letak spora diantara ujung-ujung dan
ditngah-tengah terminal).
Kapsula adalah bagian dari sel berupa lapisan tebal, lebih kental, dan melekat kuat pada
dinding sel. Kapsul dapat berfungsi sebagai pelindung terhadap lingkungan yang kurang
menguntungkan, sebagai cadangan makanan, dan pengikat antar sel dalam satu koloni.
Adanya kapsul melindungi bakteri dan mekanisme kerja sel pagosit inang (sel yang
mencerna benda asing) dan kapsul tersebut menambah kemampuan bakteri untuk
menginfeksi Lapisan kapsul cukup tebal sehingga sulit diwarnai, oleh karena itu
diperlukan sutu pewarnaan khusus. Salah satu pewarnaan kapsula bakteri adalah dengan
pewarnaan bakteri.
Mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi
sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan
pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak
digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan Gram dapat diketahui
morfologi sel antara lain sifat Gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan Gram atau
metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi
dua kelompok besar. Berdasarkan latar belakang diatas maka dilakukan praktikum
pengecetan dan morfologi mikroorganisme.

C. TINJAUAN PUSTAKA
Mikroskop merupakan alat yang wajib ada untuk mempelajari sel-sel bakteri dalam
skalala boratorium. Kemampuan mikroskop untuk menghasilkan gambar yang baik dan
jelas sangat diperlukan karena ada beberapa jenis bakteri yang sulit untuk diamati dibawah
mikroskop. Untuk mengatasi keterbatasan tersebut, maka dikembangkan metode
pengamatan sel-sel bakteri dengan menggunakan zat pewarna agar sel-sel bakteri tersebut
dapat diamati dengan mudah. Tujuan adanya penambahan zat pewarna adalah untuk
membedakan antara sel bakteri dengan daerah sekitarnya karena zat warna memiliki
kemampuan untuk menyerap dan membaskan cahaya mikroskop sehingga sel bakteri dapat
dilihat dengan jelas.
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang
memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan
diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi
kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan
pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada
umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang
tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk
mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati
struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang
diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif
dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya
sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna
yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif
dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi
dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna
adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang
mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif
(Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna
basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan
memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan
karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan
sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan
dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun
biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam
yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada
struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang
bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap
struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan
(Dwidjoseputro.1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut
pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang
bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada
pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk
meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup
penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak
sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali
dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi
tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila
terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya
(Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali
setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat
dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol.
Fiksasi digunakan untuk :

1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur
pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen,
karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif
untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan
merah kongo (Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada
bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan
sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan
seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk
kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina
atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai
bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan
terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari
Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan
secara tidak sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu,
bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat
bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang
tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan
pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan
identifikasi bakteri (Lay,1994)
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang
berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil
pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding
selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu
dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel
yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri
gram negatif (Lay,1994)
Cirri-ciri gram negative:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer.
2. Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari
berat kering, tidak mengandung asam laktat.
3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
4. Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:
1. Struktur dindingnya tebal
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
3. Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
5. Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
2. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur
pewarnaan gram untuk :
1. Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
2. Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
3. Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa
Bakteri merupakan makhluk hidup yang memiliki morfologi, struktur dan sifat yang
khas. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, tempat sel bakteri
di suspensikan. Salah satu cara untuk mengidentifikasi adalah dengan cara pewarnaan sel
bakteri. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan zat pewarna karena sifatnya yang
basofilik, sedangkan zat warna yang digunakan biasanya bersifat alkalin.
Tujuan pewarnaan ini biasanya untuk,
1. Mempermudah dan memperjelas melihat bentuk serta ukuran bakteri
2. Melihat struktur luar bahkan jika memungkinkan bisa untuk melihat struktur
bagian dalam
3. Melihat reaksi bakteri terhadap pewarna sehingga sifat fisika dan kimia dapat
diketahui.
Secara kimiawi, pewarnaan (dye) adalah suatu senyawa organik yang terdiri atas cincin
benzena dan suatu kelompok chromophore dan auxophore. Kemampuan suatu pewarna
untuk mengikat komponen seluler berukuran besar seperti protein dan asam nukleat
tergantung pada muatan elektrik yang ditemukan pada bagian chromogen naupun pada
komponen seluler yang diwarnai.
Zat warna asam merupakan suatu anion yang pada saat ionisasi pada bagian
chromogennya bermuatan negatif dan memiliki afinitas tinggi terhadap komponen yang
bermuatan positif. Sedangkan zat warna basa adalah suatu kation karena pada saat ionisasi
bagian chromogennya menunjukkan muatan positif sehingga memiliki afinitas tinggi
terhadap komponen sel yang bermuatan negatif.

D. METODE
1. Alat
a. Bunsen g. Bak pewarnaan
b. Gelas objek h. Mikroskop
c. Jarum ose i. Timer
d. Korek api j. Pinset
e. Beaker glass k. Kawat strimin
f. Botol semprot l. Cover glass

2. Bahan
a. Kultur bakteri i. KOH 10%
b. Alkohol 70% j. Malachit green
c. Alkohol 96% k. Cupper sulfat20%
d. Aquadest l. Nigrosin
e. Kristal violet m. Tisue
f. Lugol iodine n. Alkohol aseton
g. Alkohol aceton o. Kertas merang
h. Safranin

3. Cara kerja
a. Pembuatan apus bakteri
1) Dari medium agar cawan atau agar miring
a) Meneteskan 1 tetes aquadest steril keatas objek glass
b) Menyiapkan 1 ose isolat murni bakteri secara aseptis dan sentuhkan ujung
ose tersebut ke atas aquadest dan putar-putar sampai tercampur rata
c) Mendiamkan pada suhu ruang sampai kering.
2) Dari medium cair
a) Mengambil 1-2 ose isolat bakteri secara aseptis dan sentuhkan diatas
objek glass sambil ujung jarum ose diputar-putar sehingga suspensi
bakteri dapat tersebar merata dan tida terlalu tebal
b) Mendiamkan pada suhu ruangan sampai kering
3) Melakukan fiksasi dengan cara melewatkan objek glass diatas api bunsen
sehingg sel-sel bakteri dapat menempel pada objek glass tanpa menyebabkan
kerusakan struktur bakteri.
b. Pewarnaan sederhana
1) Pewarnaan positif
a) Menyiapkan alat dan bahan yang bebas dari lemak
b) Menuliskan identitas isolat bakteri yang akan diwarnai pada salah satu
ujung preparat
c) Membuat preparat apus sesuai dengan prosedur yang ada
d) Mengecat preparat yang sudah dibuat, dengan menggunakan Crystal
violet dan tunggu kurang lebih 30 detik
e) Menyiram preparat yang sudah jadi dengan aquadest sampai tetesan yang
ada menjadi jernih
f) Mendiamkan beberapa saat pada suhu ruang sehingga preparat kering.
g) Mengamati preparat dengan menggunakan perbesaran yang tinggi.
h) Mencatat hasil.
2) Pewarnaan negatif
a) Mencuci bersih gelas objek dengan alkohol 70% dan membiarkan sampai
kering
b) Meneteskan pewarna nigrosin di salah satu ujung objek glass
c) Mengambil 1 tetes atau 1 ose isolat bakteri dan campurkan dengan
pewarna nigrosin sampai rata
d) Mengambil objek glass yang lainnya dan tempelkan salah satu ujung pada
pewarna nigrosin, menggeser objek gass yang kedua kearah depan
sehingga nigrosin dapat menyebar ke objek glass yang pertama
e) Membiarkan preparat kering di udara tanpa di fiksasi
f) Mengamati dibawah mikroskop

c. Pewarnaan diferensial
1) Pewarnaan gram
Cara kerja 1
a) Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
b) Membuat preparat apus sel-sel bakteri sesuai prosedur diatas.
c) Meneteskan pewarna cristal violet diatas preparat apus, kemudian
didiamkan selama 1 menit.
d) Menyiram preparat apus dengan akuades sampai tetesannya jernih.
e) Meneteskan lugol iodin diatas preparat apus secara merata kemudian
didiamkan selama 1 menit.
f) Menyiram preparat apus dengan akuades sampai tetesannya jernih.
g) Meneteskan alkohol 95% atau alkohol aseton (decolorizer) diatas preparat
apus, lakukan secara perlahan tetes demi tetes sampai warna tetesan jernih.
h) Menyiram preparat apus dengan akuades sampai tetesannya jernih.
i) Meneteskan safranin diatas preparat apus secara merata kemudian
didiamkan selama 1 menit.
j) Menyiram dengan akuades sampai tetesannya jernih.
k) Mendiamkan preparat apus beberapa saat pada suhu ruang sampai preparat
kering.
l) Mengamati bentuk, susunan, warna sel bakteri di bawah mikroskop.
Cara kerja 2
a) Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan..
b) Meneteskan 1 tetes KOH 10% diatas gelas objek.
c) Ditambahkan 1 ose isolat bakteri secara aseptis dan putar-putar jarum ose
sampai bakteri tercampur sempurna kemudian diamkan selama 30 detik
dengan jarum ose tetap menempel pada campuran bakteri dan KOH 10%.
d) Menarik ke atas ujung jarum ose secara perlahan dan perhatikan sifat dan
campuran tersebut.
e) Melihat campuran tersebut apabila elastis dan memanjang seperti karet
ketika jarum ose di tarik ke atas, maka ini menunjukkan bahwa bakteri yang
diuji termasuk gram negatif.
f) Melihat campuran tersebut cair, tidak elastis dan tidak memanjang seperti
karet ketika jaurm ose ditarik ke atas, maka ini menunjukkan bahwa bakteri
yang diuji termasuk bakteri gram positif.

2) Pewarnaan khusus
Pewarnaan endospora
a) Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
b) Membuat preparat apus sel bakteri sesuai prosedur diatas.
c) Menempatkan preparat ulas di atas beaker glass berisi air mendidih
kemudian ditutup menggunakan kertas merang/ kertas buram.
d) Meneteskan kertas buram dengan pewarna malachite green kemudian
diamkan selama 5-6 menit, ulangi sekali lagi pemberian malachite green
sehingga proses ini berlangsung, gelas objek tidak boleh mengalami
kekeringan.
e) Mengangkat kertas buram dari gelas objek, diamkan sebentar sampai
dingin, kemudian disiram menggunakan akuades selama 30 detik.
f) Meneteskan pewarna safranin diatas preparat apus selama 60-90 detik.
g) Menyiram preparat ulang menggunakan akuades selama 30 detik.
h) Mengamati dibawah mikroskop.

Pewarnaan capsule
a) Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b) Meneteskan salah satu bagian ujung/tepi objek glass dengan 3 tetes crystal
violet.
c) Mengambil isolate bakteri secara aseptis dan medium kultur sebanyak 3
ose, oleskan serta campurkan dengan crystal violet tersebut.
d) Membuat ulasan tipis campuran crystal violet dan kultur bakteri dengan
cara menempelkan dan mendorong objek glass yang kedua di atas objek
glass pertama.
e) Mendiamkan selama 5-7 menit objek glass pertama dalam posisi berdiri.
f) Mencuci ulasan menggunakan larutan cupper sulphate 20%
g) Mengeringkan noda dengan mengibas-ngibas objek glass secara pelan-
pelan.
h) Mengamati dibawah mikroskop.

E. HASIL DAN PEMBAHASA


1. Hasil
No. Gambar Keterangan
1. Pewarnaan positif dengan Warna ungu
menggunakan crystal violet Bentuk basil
Susunan bergerombol
Di cat dengan menggunakan 1 macam
cat.
Diamati pada perbesaran 40x

2. Pewarnaan negatif dengan Berwarna bening/ tidak berwarna,


menggunakan nigrosin mengkilap
Bentuk bacil
Susunan bergerombol
Latar belakang hitam
Diamati pada perbesaran 40x

3. Pewarnaan Gram Warna merah


Bentuk bacil
Susunan bergerombol
Gram negatif menyerap warna safranin
Bakteri gram negatif

4. Pemeriksaan diferensial Bakteri gram negatif, karena pada saat


dengan KOH diamati terlihat elastis dan memanjang
ketika jarum ose ditarik ke atas
5. Pewarnaan Endospora Warna hijau
Bentuk bacil
Susunan menyebar
Diamati pada perbesaran 100x

6. Pewarnaan Capsule Pada bakteri ini tidak terbentuk kapsul.

2. Pembahasan
Berdasarkan praktikum yang sudah dilakukan dapat diketahui bahwa
pemeriksaan morfologi bakteri dengan berdasarkan pewarnaan bakteri yang
menggunakan beberapa macam pemeriksaan dapat diketahui bahwa sampel bakteri
yang diamati merupakan bakteri gram negatif yang memiliki susunan bergerombol,
bentuk basil, tidak memiliki kapsul dan juga endospora. Sampel ini merupakan
sampel gram negatif karena warna yang terjadi ketika dilakukan pengecatan gram
adalah warna merah yang merupakan hasil dari safranin sebagai warna tandingan.

Pada pewarnaan sederhana warna yang dihasilkan adalah warna ungu ini terjadi
karena warna yang digunakan hanya menggunakan 1 jenis cat, sehingga dinding
bakteri yang dihasilkan dari crystal violet. Kebanyakan bakteri telah bereaksi
dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil yaitu
suka akan basa. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin yaitu komponen kromofornya bersifat positif. Pewarnaan
sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe
morfologi dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai.
Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras
antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel
bakteri itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel bakteri dengan zat warna,
khususnya dengan Crystal violet. Pada percobaan pengecatan sederhana ini
digunakan biakan bakteri yang belum diketahui jenisnya. Setelah pengecatan
diperoleh bakteri tersebut ungu, yang berarti bakteri tersebut menyerap zat warna
cat tersebut sehingga nampak pada mikroskop. Adapun bentuk bakteri yang
didapatkan yaitu bacil..
Sedangkan pada pewaraan negatif adalah pewarnaan yang bertujuan untuk
mewarnai latar belakang dari bakteri tersebut sehingga bakteri akan terlihat jernih
atau tidak berwarna, yang terlihat morfologi dari bakteri tersebut dan juga
susunannya saja. Cat yang digunakan pada pewarnaan ini adalah cat nigrosin/ tinta
cina/tinta india. Pada pengecatan ini apusan dibuat sediaan apus yang dibuat dengan
cara meneteskan 1 tetes cat nigrosin yang ditambah dengan suspensi bakteri yang
kemudian di homogenkan dan di buat apusan tanpa difiksasi, hanya dikeringkan
pada udara. Tujuan tidak di fiksasinya pada pewarnaan ini adalah agar morfologi
dari bakteri tidak rusak sehingga dapat dilihat dengan baik dan juga cat yang
digunakan tidak kering dan rusak.
Pewarnaan endospora adalah salah satu proses dalam suatu indentifikasi jenis
mikroba, endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga
metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia
seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Pada pewarnaan endospora
ini digunakan malachite green dimana bahan ini berfungsi untuk mewarnai
endospora dari bakteri. Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial karena
dapat digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar, yaitu
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Dalam pengecatan gram, tahap-tahap
yang dilakukan yaitu mewarnai bakteri dengan cat warna utama basa, yaitu larutan
cat crystal violet, diikuti dengan mordant yaitu larutan lugol’s iodine, untuk
mengintensifkan cat utama. Kemudian mencuci sel dengan larutan peluntur alkohol
untuk menghilangkan violet kristal, selanjutnya diwarnai dengan cat penutup
safranin. Sel-sel yang tidak dapat melepaskan cat utama pada saat pelunturan akan
tetap berwarna ungu disebut bakteri Gram positif, sedangkan sel-sel yang
melepaskan cat utama dan mengikat safranin sehingga berwarna merah muda
disebut bakteri Gram negatif. Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan
negatif adalah pada komponen dinding selnya. Bakteri Gram positif memiliki
membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal, sedangkan bakteri Gram
negatif lapisan peptidoglikan tipis. Pada saat pemberian larutan cat kristal violet,
bakteri Gram positif dan negatif sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada
Gram positif dan negatif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel
berwarna biru. Namun setelah pencucian dengan larutan peluntur, warna ungu yang
diikat oleh bakteri Gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri Gram positif tidak.
Hal itu karena pada bakteri Gram negatif lemak terekstrasi dari dinding sel sehingga
pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada Gram
positif dinding sel mengalami dehidrasi, pori berkerut, dan permeabilitas rendah,
sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan
membran sitoplasma sehingga sel tetap berwarna biru atau ungu yang disebut
dengan bakteri Gram positif. Saat penambahan safranin, bakteri Gram positif
melewatkannya, sedangkan bakteri Gram negatif mengikatnya sehingga berwarna
merah muda.
Endospora merupakan suatu sruktur yag sangat resisten dan mampu bertahan
hidup untuk waktu yang lama dan kondisi lingkungan yang sangat lama dalam
kondisi lingkungan yang sangat tidak menguntungkan untuk kemudian
berkecambah apabila kondisi lingkungan sudah membaik. Tujuan dari pewarnaan
spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari
prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif. Prinsip pada
pewarnaan ini pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga
berwarna hijau. Melalui pendinginan utama akan terperangkap di dalam spora
dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas,
sehingga pada pewarnaan yang kedua (safranin) sel vegetatif akan berwarna
merah. Fungsi zat warna malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat
berpenetrasi kedalam endospora.
Pada pewarnaan edndospora dipanaskan pada bagian atas uap air adalah
bertujuan untuk mempermudah cat yang digunakana masuk kedalam spora bakteri,
namun tidak merusak sel tersebut, sehingga morfologi bakteri tetap dapat diamati
dengan baik dan tidak rusak saat diamati dengan menggunakan mikroskop.
Pewarnaan kapsula bakteri secara langsung (pewarnaan positif).
Pada kegiatan praktikum ini, pewarnaan secara langsung dilakukan dengan
menggunakan kristal violet dan CuSO4. Pewarnaan secara langsung ini
dimaksudkan untuk mewarnai sel-sel bakteri yang diamati. Apabila bakteri
mempunyai kapsul, maka dalam pengamatan sel bakteri akan tampak berwarna
ungu dan diselubungi oleh kapsul yang berwarna biru muda. Kristal violet
merupakan larutan yang yang mempunyai kromophore atau butir pembawa warna
yang bermuatan positif (memiliki kation) sedangkan muatan yang berada di
sekeliling bakteri bermuatan negatif (memiliki anion), sehingga terjadi adanya tarik
menarik antara kedua ion tersebut. Hal inilah yang menyebabkan bakteri berwarna
ungu. Dan terbentuknya warna biru muda pada kapsula disebabkan karena kapsula
menyerap CuSO4 20%. Kapsul tidak memiliki aktifitas yang besar terhadap bahan-
bahan cat basa. Beberapa kapsul cepat rusak oleh gangguan mekanis atau larut bila
dicuci dengan air. Karena kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-
zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang
sama.
Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum ini, dapat diketahui bahwa hasil
yang didapat tidak sesuai dengan ciri ciri kapsul. Hal ini ditandai dengan tidak
adanya warna biru muda yang menyelubungi sel bakteri yang berwarna ungu, selain
itu ukuran sel terlalu besar sehingga tidak dapat dikatakan bakteri. Tidak
terbentuknya warna biru muda disekeliling sel bakteri dapat diketahui bahwa tidak
ada yang menyerap CuSO4, seperti yang kita ketahui yang dapat menyerap CuSO4
adalah kapsul. Menurut Tarigan (1988), fungsi kapsul adalah untuk melindungi
tubuh dari kekeringan sementara dengan mengikat molekul-molekul air, dapat
memblok perlekatan bakteriofag, serta sebagai anti fagositosik. Selanjutnya Hastuti
(2002) menjelaskan bahwa pada beberapa jenis bakteri, adanya kapsula ini
menunjukkan sifat virulen.
Pewarnaan gram dengan cara kedua yaitu dengan KOH 10% dimana larutan ini
berfungsi untuk mengelompokan bakteri dengan berdasarkan sifat dari bakteri
tersebut ketika ditambah dengan larutan KOH 10% diamana apabila bakteri tersebut
terlihat elastis dan memanjang seperti karet ketika jarum ose ditarik keatas maka
bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif, sedangkan apabila bakteri tersebut
terlihat cair, tidak elastis, tidak memanjang seperti karet maka bakteri tersebut
merupakan bakteri gram negatif, sehingga dapat disimpulkan bahwa pada bakteri
sampel merupakan bakteri gram negatif pada sampel yang digunakan.
Penggunaan minyak imersi pada saat menggunakan lensa objektif 100x adalah
untuk memperjeas dari preparat yang dibuat dan mencegah agar apusan tidak
tergores dengan lensa tersebutm, namun setelah digunakan lensa itu seharusnya di
bersihkan dengan xylol supaya lensa mikroskop yang digunakan tidak berjamur dan
untuk pemeliharaan mikroskop yang lebih baik lagi.

F. KESIMPULAN DAN SARAN


1. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang sudah dilakukan dapat disimpulkan bahwa praktikan
dapat:
a. Mengetahui pengelompokan bakteri berdasarkan morfologi dan teknik
pewarnaannya.
b. Melakukan pembuatan preparat apus bakteri baik yang menggunakan medium padat
ataupun dengan medium cair.
c. Melakukan pewarnaan bakteri baik pewarnaan sederhana, yaitu pewarnaan positif
dan pewarnaan negatif, sedangkan pada pewarnaan differensial ada pewarnaan gram
dan dan pewarnaan khusus yang terdiri dari pewarnaan kapsul, endospora dan
flagella.
d. Mengetahui bentuk bakteri yaitu bentuk bacil dan kokus, sedangkan susunan
bakterinya adalah menyebar, berderet dan bergerombol, dan bagian bagian bakteri
ada kapsula, flagella dinding se dan lainnya namun hanya beberapa bakteri yang
memiliki flagella dan endospora.
2. Saran
Menurut pendapat saya dalam praktikum sudah baik dan lancar, namun untuk
ketersediaan mikroskop dan kondisinya lebih dijaga lagi supaya mikroskop ketika
digunakan dapat digunakan untuk melihat sel dengan jelas dan tidak bluur, serta untuk
penjelasan mengenai prosedur kerja kalau bisa disertai dengan demo praktikum yang
dikerjakan.
G. DAFTAR PUSTAKA

Betsy, Tom. Microbiology Demystifed. USA: McGraw-Hill Publisher, 2005.


Dwidjoseputro. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Gramedia, 2005
Hadiutomo, Ratna S. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka Utama
: Jakarta, 1993.
Junaidi, W. 2010. Makalah Tentang Pewarnaan Gram atau Pengecatan Bakteri –Makalah
Biologi. Junaidi Blog. http://wawan-junaidi.blogspot.com/2010/02/makalah-
tentang-pewarnaan-gram-atau.html (3 Desember 2019).
Lay,W.B..Analisa Mikroba di Laboratorium.EdisiI.Jakarta : PT.Raja Grafindo Persada,
1994
Salle, A. J. Fundamental Principles of Bacteriology 5th. New York: McGraw-HillBook,
1961.
Sutedjo, M.M., Kartajapoetra, S.A. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Penerbit Rieka Cipta,
1991.
Volk, A.W dan Wheeler, M.F.MikrobiologiDasarjilid1.Jakarta: Erlangga, 1993.
H. LAMPIRAN

Pewarnaan gram pewarnaan kapsul pewarnaan gram ddg KOH

Pewarnaan endospora pewarnaan negative pewarnaan sederhaana

Anda mungkin juga menyukai