Sinergi Efek Antibakteri antara Maillard Reactive Product (MRP) dan

Hidrogen Peroksida (H2O2) pada Streptococcus mutans

Morimichi Mizuno, Ki‑ichiro Inoue

Tujuan: Untuk mengevaluasi aktivitas antibakteri dari resin komposit yang mengandung
Maillard Reactive Product (MRP) dan hidrogen peroksida (H2O2) pada Streptococcus mutans (S.
mutans), dan untuk meneliti mekanisme antibakteri yang terlibat.
Metode: Pertumbuhan S. mutans diteliti setelah resin yg mengandung H2O2 yang ada dan tidak
ada MRP direndam dalam larutan bakteri. Efek MRP pada penurunan H2O2 diuji dengan
pengukuran kandungan H2O2.
Hasil: Resin komposit yang mengandung MRP dan H2O2 menunjukkan aktivitas antibakterial
yang stabil dibandingkan dengan resin komposit yang hanya mengandung H2O2 saja, dan efek
MRP dipertimbangkan sebagai yang menekan penurunan H2O2, dan adanya H2O2 berhubungan
dengan aktivitas antibakteri pada resin komposit. Hasilnya mengindikasikan bahwa aktivitas
antibakteri resin komposit yang mengandung MRP dan H2O2 pada S. mutans tergantung dar
adanya H2O2 dan MRP menekan penurunan H2O2 setelah dikombinasikan dengan H2O2. EDTA
juga menekan penurunan H2O2.
Kesimpulan: Efek antibakteri resin komposit yang mengandung MRP dan H2O2 pada S. Mutans
telah diteliti. Efek MRP pada H2O2 dapat merupakan aksi pelarutan logam. Aplikasi resin
komposit yang mengandung MRP dan H2O2 pada karies gigi dapat menjadi perawatan alternatif
yang diberikan sebagai tambahan perawatan antibakteri untuk meminimalkan invasi.

Kata kunci: Hidrogen peroksida H2O2, maillard reactive product (MRP), Streptococcus mutans
(S. mutans)
Pendahuluan
Saat ini, konsep intervensi minimal yang bertujuan untuk mengelola karies gigi dengan
memberikan perawatan preventif secara optimal dan interfensi operatif invasif minimal telah
diterima secara luas.1 Pengakuan ini berdasarkan konsep untuk membangun sistem perawatan
atraumatic restorative treatment (ART). ART termasuk penghilangan jaringan karies gigi
dengan hand instrument diikuti dengan restorasi kavitas menggunakan bahan adesif (semen glass
ionomer viskositas tinggi) yang secara simultan menutup pit dan fissure. Perawatan ini
diharapkan dapat menghalang invasi bakteri.
Semen glass ionomer mengandung fluoride untuk memudahkan remineralisasi namun memiliki
aktivitas antibakteri yang kurang, hal ini merupakan salah satu alasan bahwa sistem ART tidak
dapat diandalkan.2
Salah satu cara menghilangkan bakteri adalah dengan aplikasi antibiotik kompleks ke dalam
karies atau kavitas dan prosedur ini diketahui menunjukkan hasil kilinis yang baik.3
Namun, antibiotik menunjukkan bakteri dengsn spektrum yang terbatas dikarenakan aktivitas
inhibitor yang berbeda untuk setiap metabolik bakteri. Selain itu, aplikasi antibiotik dalam
jangka panjang menimbulkan toleransi bakteri terhadap antibiotik (resisten).
Klorheksidin adalah semacam agen antibakteri4 dan pernah digunakan untuk mempelajari
kemanjuran aktivitas antibakteri yang tersedia pada semen glass ionomer.5
Hidrogen peroksida (H2O2) adalah reagen antibakteri, yang dapat mematikan sebagian besar
anaerob melalui aksi oksidasi.6 Aksi antibakteri disebabkan hidroksil radikal, yang dihasilkan
dari interaksi H2O2 dengan ion besi yang terdapat dalam bakteri.7 Melalui reaksi H2O2 dengan
ion besi, dihasilkan air dan oksigen. Oleh karena itu H2O2 mungkin adalah reagen antibakteri
yang cocok untuk menghilangkan bakteri dari karies gigi.
H2O2 secara luas telah digunakan dalam bentuk uap. Namun, aplikasi dan pemberian larutan
H2O2 pada karies sulit untuk dilakukan akibat tingginya fluiditas larutan H2O2. Dalam penelitian
ini kami mengembangkan polimer karbohidrat yang mengandung H2O2 dan menghasilkan resin
antibakteri meliputi H2O2.
MRP adalah bentuk reaksi aminokarbonil yang disebabkan oleh reaksi maillard antara senyawa
amino (asam amino, peptida, dan protein) dan karbohidrat tereduksi.8 Reaksi ini menampilkan
beberapa aktivitas seperti antioksidatif7,9 antihipertensif8,10 reaksi pelarutan logam9,11 dan
aktivitas antibakteri.12,13 Dari analisa struktur kimia ditemukan bahwa MRP bertindak sebagai
bahan anionic,14 dan mampu membentuk kompleks stabil dengan kation logam.15 Penemuan ini
menunjukkan bahwa MRP dapat memiliki daya anionik dan mampu bereaksi dengan beberapa
kation seperti Fe, Zn, dan Cu,16 yang sangat diperlukan bagi pertumbuhan dan pertahanan
beberapa bakteri.17
Pada dasar dari penelitian ini, kami menguji potensi efek sinergis antara MRP dan H 2O2 dan
meneliti efek antibakteri pada Streptococcus mutans (S. mutans) dalam hal ini meneliti tentang
mekanisme yang terkait.

BAHAN DAN METODE

Larutan MRP sintesis, dan preparasi resin yang mengandung MRP dan H2O2
Larutan MRP dipersiapkan melalui modifikasi metode yang dideskripsikan oleh Morales dan
Babber.18 50mg glukosa dan jumlah yang sama untuk histidine dilarutkan dalam 1.5 mL atau
3mL larutan saline dan dipanaskan pada suhu 120 °C selama 30 menit menggunakan autoklaf
lalu didinginkan sampai mencapai suhu ruangan.
Larutan MRL 150 μL (5mg dan 10 mg MRP/150 μL) dan 1% larutan H2O2 dalam jumlah yang
sama (1.5mg/150 μL H2O2), konsentrasinya hampir sama dengan yang dipakai sebagai disinfeksi
oral,19 kedua larutan ini dicampurkan secara merata dan kemudian diserapkan ke 50mg senyawa
amilase polimer karbohidrat (60%), amilopektin (30%), dan selulosa (10%).
Hal ini dilakukan pada ruangan dengan suhu dalam kondisi anaerobik untuk mencegah oksidasi
senyawa polimer selama proses pengeringan. Setelah kami menentukan ketiadaan air pada
polimer dengan menggunakan pengukur kelembapan (MT-900, Kett co., Tokyo, Japan), polimer
tersebut diubah dalm bentuk bubuk, ukuran partikelnya dibawah 100 μ, menggunakan mixer (Dr.
Fritsch - Sondermaschine co., Fellbach, Germany). Bubuk polimer yang telah dibuat disimpan
pada suhu -30°C hingga digunakan.
Dua ratus mg resin tipe light cure dicampur dengan 50mg polimer dan dibuat ke dalam bentuk
cakram dengan diameter 3mm, dan ketebalan 1mm). Resin tersebut mengandung 5mg dan 10mg
MRP, dan 1,5mg H2O2.
Pengukuran aktivitas antibakteri pada MRP dan H2O2
Pada penelitian ini, kami menggunakan 1x16 colony forming unit (CFU) /mL S.mutans
(ATCC25175) dengan media brain-heart infusion (BHI) dalam kondisi anaerobik pada suhu
35°C.
Sampel bakteri (1mL) di inkubasi dengan cakram resin selama 2 jam pada suhu ruangan dalam
kondisi anaerobik. Kemudian, sel suspense disentrifugasipada 1000rpm selama 15 menit.
Aktivitas antibakteri dievaluasi melalui pertumbuhan bakteri, yang ditentukan dengan cara
mengukur optical density pada OD660 dari tiap sampel menggunakan spectrophotometer seperti
yang dijelaskan Kim et al.20 Semua percobaan dilakukan duplikasi dan dan diulang tiga kali (n =
6).

Pengukuran kadar H2O2 pada resin dengan dan tanpa MRP

Kadar H2O2 pada resin diukur melalui metode modifikasiyang telah dijelaskan Gay et al.21 Resin
direndam dalam 1mL air suling dan dibiarkan selama 2 jam dalam suhu ruangan diikuti dengan
sentrifugasi pada 10000g selama 3 menit pada suhu 20°C. kemudian, 10 μL supernatant
dicampur dengan 1mL reagen agar menghasilkan konsentrasi akhir dari 25mM H2SO4, 100 μM
xylenol orange (XO), dan 150 μM ferrous ammonium sulfate dengan volume 1mL. Setelah
campuran tersebut disimpan pada suhu ruangan selama 30 menit dalam kondisi gelap,
densitasnya diukur pada penyerapan 560nm dengan XO. Pengukuran memberikan hasil rangkap
tiga pada percobaan independen.

Analisa statistik
Efek MRP terhadap pertumbuhan bakteri dan kadar H2O2 dinilai dengan membandingkan sampel
dengan ada tau tanpa adanya MRP menggunakan t-test. Semua tes yang diterapkan adalah two-
tailed dan nilai P dibawah 0.05 dianggap signifikan.
HASIL DAN DISKUSI
Aktivitas antibakteri dari MRP dan H2O2
Bakteri pada gigi dapat menghalangi remineralisasi gigi melalui metabolis asam yang mereka
produksi. Karena itu, penghilangan bakteri dari karies gigi dapat membantu remineralisasi.

Gambar 1: Aktivitas antibakteri pada resin gigi yang melibatkan MRP atau H 2O2. Pertumbuhan baktei ditunjukkan
dalam persentase OD660 dari media bakteri non inkubasi dengan resin(100%). Nilai ditunjukkan sebagai ± standar
deviasi (SD) dari 6 sampel dan P<0.05 menunjukkan signifikan secara statistic

Deyhle et al. menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan hubungan kolagen antara gigi normal dan
gigi karies pada tahaw awal infeksi,22 dan Zhang et al. menyebutkan bahwa phosphorylation
yang dikombinasi dengan perawatan kalsium hidroksida dapat menyebabkan remineralisasi pada
permukaan gigi yang demineralisasi.23 Mereka menganggap bahwa peningkatan potensi zeta
negative dari molekul kolagen menyebabkan remineralisasi yang sangat baik dari gigi yang
demineralisasi tidak mengandung bakteri.23 Penemuan ini mengindikasikan bahwa
demineralisasi gigi dapat direminalisasi apabila jaringan serat kolagen tetap dalam kualitas dan
susunan yang normal dan penghilangan bakteri dari karies cenderung menyebabkan
remineralisasi gigi.

Pertama, kami meneliti aktivitas antibakteri dari MRP. Rufián-Henares et al. melaporkan bahwa
2-8 mg/mL MRP cukup untuk mencegah pertumbuhan bakteri.13 Lalu, kami membuat resin gigi
untuk 5mg dan 10mg MRP diikuti dengan inkubasi pada suhu 37°C dengan kelembapan 100%
selama 7 hari. Kemudian, resin tersebut direndam dalam media bakteri (1 mL) selama 2 jam
dengan temperatur kamar dalam keadaan anaerobic (konsentrasi MRP pada media bakteri adalah
5mg dan 10mg/mL).

Seperti yang terlihat pada gambar 1, resin gigi non-inkubasi mengandung 1,5 mg H2O2
menghalangi pertumbuhan bakteri, namun, efek penghambatan menghilang setelah inkubasi
selama 1 hari pada suhu 37°C dengan kelembapan 100%. Dengan kata lain, resin gigi yang
mengandung 5mg dan 10mg MRP tidak dapat menekan pertumbuhan bakteri selama masa
percobaan. Penemuan ini mengindikasikan bahwa 5mg/mL dan 10mg/mL MRP tidak
menunjukkan efek antibakteri. Penemuan kami berbeda dengan laporan Rufián-Henares et al.13
dan perbedaan mungkin disebabkan oleh perbedaan kondisi percobaan. Rufián-Henares et al.
menggunakan beberapa bakteri sebagai ganti S.mutans dan perbedaan spesies bakteri menjadi
perbedaan sensitivitas terhadap MRP. Kedua, mereka menggunakan MRP yang berasal dari kopi,
yang mengandung beberapa jenis MRP dengan beban molekular tinggi. Dengan kata lain, MRP
yang digunakan dalam penelitian ini memiliki beban molekulas rendah dan perbedaan kualitas
MRP dapat mencerminkan perbedaan hasil percobaan.

Selanjutnya, kami meneliti aktivitas antibakteri dari MRP dan H2O2.

Gambar 2: Aktivitas antibakteri resin dengan MRP (5mg dan 10mg) dan H2O2. Pertumbuhan bakteri ditunjukkan
dalam presentase OD660 dari media bakteri non-inkubasi degan resin gigi (100%). Nilai ditunjukkan sebagai mean
± SD dari 6 sampel dan P < 0.05 mengindikasikan signifikan secara statistic
Resin gigi yang mengandung MRP (5mg dan 10mg) ditambah 1,5mg H2O2 diinkubasi pada suhu
37°C dengan kelembapan 100% selama 7 hari dan kemudian direndam dalam 1mL media
bakteri (1,5 mg/mL H2O2, 5mg dan 10mg/mL MRP dalam media bakteri). Seperti yang
ditunjukkan pada gambar 2, aktivitas antibakteri pada resin dengan H2O2 dan MRP hampir sama
dengan resin H2O2 tanpa MRP sebelum inkubasi. Setelah inkubasi selama sehari, aktivitas
antibakteri resin H2O2 dengan 5mg MRP menurun sepertiga kali lipat dibandingkan dengan resin
non-inkubasi, namun, resin yang mengandung H2O2 dengan 10mg MRP mempertahankan
aktivitas antibakterinya. Pada hari kedua, resin yang mengandung H2O2 dengan 10mg MRP
mengalami penurunan aktivitas antibakteri menjadi seperempat kasi lipat dibandingkan dengan
aktivitas awal dan resin yang mengandung 5mg MRP hilang aktivitas antibakterinya. Pada hari
ketiga, aktivitas antibakteri tidak ditemukan di semua resin. Penemuan ini mengungkap bahwa
MRP tidak menambah aktivitas antibakteri H2O2, namun, akitivitas antibakteri ditunjukkan
dalam durasi yang lebih panjang, tergantung pada jumlah dosis MRP. Analisa statistik
menunjukkan bahwa efek MRP plus H2O2 adalah tepat. Karena itu, dapat disimpulkan bahwa
mekanisme antibakteri MRP terhadap H2O2 merupakan perlindungan aktivitas antibakteri H2O2.

Kadar H2O2 pada resin gigi

Kami berspekulasi bahwa MRP dapan menekan degradasi H2O2. Untuk memastikan hipotesa ini,
kami mengukur kadar H2O2 pada resin gigi setelah inkubasi pada suhu 37°C dengan kelembapan
100% selama 7 hari.
Gambar 3: Kadar H2O2 pada resin gigi yang mengandung MRP (5mg dan 10mg). Kadar H 2O2 diukur dalam 1mL
air suling yang digunakan untuk merendam resin. Nilai ditunjukkan sebagai mean ± SD dari 6 sampel dan P<0.05
mengindikasikan signifikan secara statistic

Seperti yang terlihat pada gambar 3, resin yang mengandung H2O2 atau H2O2 plus MRP (5mg
dan 10mg) masing-masing menunjukkan 55.5 mM, 55.1 mM, dan 55.3 mM sebelum inkubasi,
dan sekitar 80% pertumbuhan bakteri dihambat seperti yang ditunjukkan pada gambar 2.
Hasilnya adalah H2O2 terlepas dari resin dan menekan pertumbuhan bakteri tidak bertentangan
dengan penemuan Feuerstein bahwa 10mM H2O2 menunjukkan 85% penghambatan
pertumbuhan S.mutans.24 Setelah resin diinkubasi selama seharim kadar H2O2 tanpa MRP
menurun ke 5.6 ± 4.29 mM, disamping itu, resin yang mengandung 5mg dan 10mg MRP
menunjukkan masing-masing 16.7 ± 7.22 mM dan 44. 4 ± 9.11 mM. Pada hari kedua, kadar
H2O2 pada resin yang mengandung 5mg dan 10mg MRP adalah 5.6 ± 3.39 mM dan 15.6 ± 7.78
mM dan H2O2 tidak terdeteksi pada resin tanpa MRP. Pada hari ketiga, 5.6 ± 2.23 mM H2O2
terdeteksi pada resin yang mengandung 10mg MRP, namun tidak terdeteksi pada resin 5mg
MRP. Analisa statistik mengindikasikan bahwa MRP menghambat penurunan kadar H2O2 tetapi
tidak menambahkadar H2O2. Hasil juga menunjukkan bahwa adanya H2O2 pada resin adalah
penyebab utama untuk menghambat pertumbuhan bakteri (koefisien determinasi R2=0,995).
Karena itu, mekanisme efek antibakteri MRP terhadap H2O2 mungkin adalah penekanan
penurunan H2O2 melalui MRP.
Mekanisme penekanan MRP terhadap H2O2 yang dapat terjadi adalah, (1) interaksi antara MRP
dan H2O2 yang dapat membentuk kompleks stabil dan (2) aksi metal chelating MRP yang
menekan produksi hidroksil radikal oleh penekanan dari penurunan H2O2.
Dalam beberapa kemungkinan ini, formasi kompleks antara MRP dan H2O2 sulit untuk
ditentukan karena sejauh ini tidak ada laporan mengenai formasi kompleks. Repine et al.25
melaporkan bahwa 1.5 μg besi menambah 1000 kali lipat aktivitas pembunuhan bakteri dari
H2O2 dibandingkan dengan 0.1 μg besi terhadap Staphylococcus aureus dan penemuan ini berarti
bahwa produksi hidroksil radikal dipercepat oleh jumlah ion diatas. Telah disebutkan bahwa ion
besi ada dalam aksi bakteri sebagai agen katalis untuk menambah produksi hidroksil radikal dari
H2O226 dan MRP menunjukkan aksi metal chelating.13
Gambar 4: Kadar H2O2 pada resin gigi yang mengandung 10mM EDTA. Kadar H 2O2 diukur dalam 1mL air suling
yang digunakan untuk merendam resin. Nilai ditunjukkan sebagai mean ± SD dari 4 sampel dan P<0.05
mengindikasikan signifikan secara statistik

Lalu, kami meneliti efek dari agen chelating pada penurunan H2O2. Seperti yang ditunjukkan
pada gambar 4, kadar H2O2 pada resin yang melibatkan ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) empat kali lebih tinggi daripada resin control (resin yang hanya mengandung H2O2
saja) setelah inkubasi selama sehari dan 6.3 ± 7.78 mM H2O2 terdeteksi pada hari kedua.
Disamping itu, H2O2 pada resin control tidak terdeteksi pada hari kedua. Hasilnya
mengindikasikan bahwa EDTA menekan penurunan H2O2 dan mendukung spekulasi bahwa
aktivitas metal chelating dari MRP mungkin merupakan efek antibakteri dari resin gigi yang
mengandung H2O2.
Glass ionomer secara luas dikenal sebagai bahan yang lebih cocok untuk perawatan ART.
Pertama kami mencoba untuk membuat H2O2 mengandung semen glass ionomer. Namun, kami
menemukan bahwa H2O2 dengan kandungan glass ionomer sangat mudah pecah setelah inkubasi
selama 3 hari dengan kelembapan 100% (data tidak ditunjukkan). Lalu, kami berpendapat bahwa
semen glass ionomer tidak cocok dalam penelitian ini dan resin komposit lebih cocok untuk
percobaan kami.
Resin gigi secara terus-menerus tak terlindung dari bakteri pada kavitas dan memiliki resiko
tinggi penyebab terjadinya karies sekunder dan periodontitis. Aplikasi resin gigi yang
mengandung MRP dan H2O2 pada karies gigi dapat menjadi alternatif perawatan atau diberikan
sebagai perawatan antibakteri untuk meminimalkan invasi.