1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Imunologi adalah ilmu yang mempelajari sistem imunitas tubuh manusia

maupun hewan, merupakan disiplin ilmu yang dalam perkembangannya berakar dari
pencegahan dan pengobatan penyakit infeksi. Sedangkan Serologi ialah ilmu yang
mempelajari reaksi antigen antibody secara invitro.Pemeriksaan serologik sering
dilakukan sebagai upaya menegakkan diagnosis. Walaupun saat ini pemeriksaan
serologik tidak terbatas pada penyakit infeksi, namun untuk menunjang diagnosis
penyakit infeksi memang hal yang sering dilkukan. memungkinkan dilakukannya
pengamatan secara in vitro terhadap perubahan kompleks antigen-antibodi (Ag-Ab).

Enzim-Linked immune sorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa Indonesianya

disebut sebagai uji penentuan kadar immunosorben taut-enzim, merupakan teknik
pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan antigen.
Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk
mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam
pendeteksian antibodi IgM, IgG, dan IgA pada saat terjadi infeksi. Namun seiring
dengan perkembangan ilmu pengetahuan,teknik ELISA juga diaplikasikan dalam
bidang patologi tumbuhan, kedokteran, dll (Andini, 2016) .

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann
dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi
(ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di
dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu
enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal (Lequin, 2005). ELISA adalah
suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk
mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah
digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga
 2

berbagai bidang industri. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi

dengan spesifitas yang lebih tinggi dibandingkan metode imun lainnya, (Engvall,
2010).
Berdasarkan uraian diatas maka penulis akan membahas tentang ELISA.
1.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang ada maka rumusan masalah yang dibahas dalam
makala ini adalah :
1.2.1. Apa itu ELISA?
1.2.2. Bagaimana prinsip dasar ELISA ?
1.2.3. Bagaimana prosedur umum ELISA ?
1.2.4. Bagaimana tipe-tipe ELISA ?
1.2.5. Bagaimana komponen perangkat ELISA?
1.2.6. Bagaimana aplikasi penggunaan ELISA
1.3. Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah yang ada maka tujuan dari makalah ini adalah :
1.3.1. Untuk mengetahui pengertian ELISA.
1.3.2. Untuk mengetahui prinsip dasar ELISA.
1.3.3. Untuk mengetahui prosedur umum ELISA.
1.3.4. Untuk mengetahui tipe- tipe ELISA
1.3.5. Untuk mengetahui komponen perangkat ELISA
1.3.6. Untuk mengetahui aplikasi penggunaan ELISA
 3

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengertian ELISA
ELISA adalah uji biokimia yang menggunakan antibody dan perubahan warna
yang dimediasi enzim untuk mendeteksi adanya antigen (protein, peptida, hormon, dll.)
atau antibodi dalam sampel yang diberikan (Gan & Patel, 2013). Dalam ELISA,
antigen harus diimobilisasi ke permukaan padat dan kemudian dikomplekskan dengan
antibodi yang terkait dengan enzim. Deteksi dilakukan dengan menilai aktivitas enzim
terkonjugasi melalui inkubasi dengan substrat untuk menghasilkan produk yang
terukur. Elemen paling penting dari strategi deteksi adalah interaksi antibodi-antigen
yang sangat spesifik (Madan, 2006).

ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall
untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel
dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (Lequin, 2005).

Pemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam tubuh

manusia maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam pemeriksaan ELISA.Tes ini

dapat dilakukan dengan kit yang sudah jadi atau dapat juga dilakukan dengan

menggunakan antigen yang diracik sendiri. ELISA tradisional secara khusus memiliki

reporter dan substrat yang menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat

diamati untuk mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA

terbaru seperti teknik flurogenic,electro chemiluminescent, dan real-time PCR dibuat

untuk mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai

keuntungan diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing (Leng et al.,

2008).
 4

2.2. Prinsip Dasar ELISA

ELISA menggunakan konsep imunologi dasar dari antigen yang mengikat
antibodi spesifiknya, yang memungkinkan pendeteksian sejumlah kecil antigen seperti
protein, peptida, hormon, atau antibodi dalam sampel cairan (Gan & Patel, 2013).
Sebagai teknik serologi, prinsip dasar ELISA adalah reaksi antara antigen (Ag) dengan
antibody (Ab) menjadi molekul Ag-Ab yang lebih besar dan mudah mengendap.
Perbedaannya, penggamatan hasil reaksi pada serologi biasa berdasarkan endapan
molekul Ag-Ab, sedangkan pada ELISA berdasarkan perubahan warna yang terjadi
pada substrat pereaksi sesuai dengan label atau imunoprob (immuno probe) konjugat
Ab-enzim. Perubahan warna terjadi akibat hidrolisa enzimatik pada reaksi antara
konjugat Abenzim dengan substratnya, sehingga hasil ELISA lebih peka dan dapat
dikuantifikasi (Suryadi et al., 2016).

Gambar 1. Prisip umum ELISA

 5

2.3. Prosedur Umum ELISA

Tahapan umum ELISA meliputi penempelan (trapping) Ag atau Ab pada media
reaksi (solid phase), seperti cawan ELISA, diikuti penambahan konjugat Abenzim, dan
diakhiri dengan penambahan substrat serta bufer penghenti reaksi (blocking buffer).
(Randles, Hodgson, & Wefels, 1996).
Kecuali menggunakan kit dengan pelat yang sudah dilapisi antibodi, ELISA
dimulai dengan langkah pelapisan, di mana lapisan pertama, yang terdiri dari antigen
target atau antibodi, diadsorpsi ke dalam pelat polistiren 96-sumur. Ini diikuti oleh
langkah pemblokiran di mana semua situs tidak terikat dilapisi dengan agen
pemblokiran. Setelah serangkaian pencucian, piring diinkubasi dengan antibodi yang
terkonjugasi enzim. Serangkaian pencucian lainnya menghilangkan semua antibodi
yang tidak terikat. Substrat kemudian ditambahkan, menghasilkan sinyal kalorimetri.
kemudian plate dibaca (Madan, 2006).
Karena pengujian menggunakan pengikatan permukaan untuk pemisahan,
beberapa pencucian diulang dalam setiap langkah ELISA untuk menghilangkan bahan
yang tidak terikat. Selama proses ini, sangat penting bahwa kelebihan cairan
dihilangkan untuk mencegah pengenceran larutan yang ditambahkan pada langkah
pengujian berikutnya. Untuk memastikan keseragaman, pencuci plate khusus sering
digunakan (Madan, 2006).

Gambar 2. tahapan umum ELISA

 6

2.4. Tipe – Tipe ELISA

Tahapan umum ELISA meliputi penempelan (trapping) Ag atau Ab pada
media reaksi (solid phase), seperti cawan ELISA, diikuti penambahan konjugat
Abenzim, dan diakhiri dengan penambahan substrat serta bufer penghenti reaksi
(blocking buffer).. Langkah kunci, imobilisasi antigen yang menarik, dapat dilakukan
dengan adsorpsi langsung ke pelat uji atau secara tidak langsung melalui antibodi
tangkap yang telah melekat pada lempeng. Antigen kemudian dideteksi baik secara
langsung (antibodi primer berlabel enzim) atau tidak langsung (antibodi sekunder
berlabel enzim). Antibodi pendeteksian biasanya diberi label dengan alkaline
phosphatase (AP) atau horseradish peroxidase (HRP). Sejumlah besar substrat tersedia
untuk melakukan ELISA dengan konjugat HRP atau AP. Pilihan substrat tergantung
pada sensitivitas uji yang diperlukan dan instrumentasi yang tersedia untuk deteksi

sinyal (spektrofotometer, fluorometer atau luminometer)(Madan, 2006).

Gambar 3. jeni-jenis tipe Elisa
2.4.1. ELISA Direct
Direct Elisa dapat dianggap sebagai bentuk yang paling sederhana dari
ELISA. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur
konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibody
spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan
 7

pada sampel yang diuji. Teknik ini diilustrasikan pada gambar 4 dan 5 dibawah
ini.

Gambar 4. direct ELISA

Antigen melekat pada fase padat dengan adsorpsi pasif. Setelah dicuci,
antibodi berlabel enzim ditambahkan. Setelah masa inkubasi dan pencucian,
sistem substrat ditambahkan dan warna dibiarkan berkembang (Crowther,
2009).
 8

Gambar 5. Tahapan direct ELISA

Antigen diencerkan dalam buffer (tahap i), umumnya pH tinggi(9.6)
penyangga karbonat atau bikarbonat atau fosfatebuffered netral saline (PBS).
Kuncinya adalah bahwa buffer mengandung protein lain yang mungkin
bersaing dengan antigen target untuk menempel pada fase padat plastik.
Antigen utama adalah protein di alam dan akan menempel secara pasif pada
plastik selama suatu periode inkubasi. Suhu dan waktu inkubasi tidak sama
sangat kritis, tetapi standarisasi kondisi sangat penting, dan penggunaannya
inkubator pada suhu 37 ° C (karena tersedia secara luas di laboratorium).
Setelah inkubasi, setiap antigen berlebih dihilangkan dengan langkah mencuci
(tahap ii), dengan membanjiri dan mengosongkan sumur, menggunakan solusi
buffered netral (mis., PBS). Antibodi terkonjugasi dengan enzim sekarang
dapat ditambahkan (tahap iii), dan diarahkan khusus terhadap situs antigenik
pada phase bound padat reagen. Antibodi terkonjugasi diencerkan dalam buffer
yang mengandung beberapa zat yang menghambat adsorpsi pasif protein, tetapi
itu masih memungkinkan pengikatan imunologis. Zat seperti itu keduanya
adalah protein lain, yang ditambahkan pada konsentrasi tinggi untuk bersaing
 9

untuk situs fase padat dengan antibody protein, atau deterjen pada konsentrasi
rendah disebut pemblokiran agen, dan buffer yang mereka bantu formulasikan,
yang diistilahkan memblokir buffer (Crowther, 2009).
Pada inkubasi, antibodi berikatan dengan antigen. Sekali lagi, langkah
pencucian sederhana kemudian digunakan untuk menghilangkan antibodi yang
tidak terikat (tahap iv). Tahap v melibatkan penambahan substrat yang sesuai
atau kombinasi substrat / kromogen untuk enzim tertentu melekat pada
antibodi. Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan dari reaksi
warna melalui katalisis enzimatik. Reaksinya adalah diizinkan untuk
berkembang selama periode yang ditentukan, setelah itu reaksi dihentikan
(tahap vi) dengan mengubah pH sistem, atau dengan menambahkan reaktan
penghambat. Akhirnya, warna dikuantifikasi oleh penggunaan pembacaan
spektrofotometer (tahap vii) pada saat yang tepat panjang gelombang untuk
warna yang dihasilkan (Crowther, 2009).
Keuntungan ELISA direct yaitu: Cepat karena hanya satu antibodi dan
lebih sedikit langkah yang digunakan, reaktivitas silang dari antibodi sekunder
dihilangkan. Meskipun demikian ELISA direct juga memiliki kekurangan,
seperti: Imunoreaktivitas antibodi primer dapat dipengaruhi oleh pelabelan
dengan enzim atau label, pelabelan antibodi primer untuk setiap sistem ELISA
spesifik memakan waktu dan mahal, tidak ada fleksibilitas dalam pemilihan
label antibodi primer dari satu percobaan ke eksperimen lainnya dan juga
amplifikasi sinyal minimal (Madan, 2006).
2.4.2. ELISA Indirect
Sistem indirect ELISA mirip dengan sistem direct ELISA dalam hal
antigen secara langsung melekat pada fase padat dan ditargetkan oleh
penambahan antibodi (pendeteksi antibodi). Namun, ini ditambahkan antibodi
tidak dilabeli dengan enzim tetapi ditargetkan sendiri oleh antibodi terkait
dengan enzim. Antibodi tersebut diproduksi terhadap imunoglobulin dari
spesies di mana antibodi pendeteksi diproduksi dan disebut anti-spesies
 10

konjugat. Jadi, jika antibodi pendeteksi diproduksi di kelinci, antibodi berlabel

enzim harus antirabbit Igs di alam. Ini memungkinkan fleksibilitas besar dalam
penggunaan konjugat anti-spesies dalam spesifisitas konjugat yang berbeda
dapat digunakan untuk mendeteksi ikatan imunoglobulin tertentu pada suatu
pengujian, dan ada ribuan konjugat yang tersedia secara komersial. Misalnya,
konjugat anti-spesies bias anti-IgM, anti-IgG 1, anti-IgG 2, dan sebagainya
(Crowther, 2009).

Gambar 5. ELISA Indirect

Antibodi dari spesies tertentu bereaksi dengan antigen yang menempel
pada fase padat. Setiap antibodi yang terikat terdeteksi oleh penambahan
 11

antiserum anti-spesies yang ditandai dengan enzim. Ini banyak digunakan

dalam diagnosis.

Diagram 6. Tahapan Indirect ELISA

Tahapan (i) dan (ii) mirip dengan sistem Direct. Tahap (iii) melibatkan
penambahan antibodi pendeteksi tidak berlabel, yang diencerkan dalam buffer
untuk mencegah perlekatan spesifik protein dalam antiserum fase padat
(blocking buffer). Ini diikuti oleh inkubasi dan membersihkan antibodi berlebih
(tidak terikat), untuk mencapai spesifik mengikat (tahap iv). Tahap (v) adalah
penambahan konjugat (diberi enzim), antibodi anti-spesies, sekali lagi
diencerkan dalam buffer penyangga diikuti oleh inkubasi dan pencucian untuk
mencapai pengikatan konjugat (tahap vi). Substrat/ kromofor kemudian
ditambahkan ke konjugat terikat (stadium vii) dan warna berkembang, yang
kemudian berhenti (tahap viii) dan membaca (tahap ix) dalam spektrofotometer
(Crowther, 2009).
ELISA indirect memiliki beberapa keuntungan, antara lain:
 Berbagai macam antibodi sekunder berlabel tersedia secara komersial.
 12

 Serbaguna karena banyak antibodi primer dapat dibuat dalam satu spesies dan
antibodi sekunder berlabel yang sama dapat digunakan untuk deteksi.
 Imunoreaktivitas maksimum dari antibodi primer dipertahankan karena tidak
diberi label.
 Sensitivitas meningkat karena setiap antibodi primer mengandung beberapa
epitop yang dapat diikat oleh antibodi sekunder berlabel, yang memungkinkan
penguatan sinyal (Madan, 2006).
Sedangkan kelemahan dari indirect ELISA antara lain :
 Reaktivitas silang dapat terjadi dengan antibodi sekunder, menghasilkan
sinyal tidak spesifik.
 Langkah inkubasi tambahan diperlukan dalam prosedur ini (Madan, 2006).
2.4.3. Sandwich ELISA
Sandwich ELISA telah menjadi sangat populer ketika menggunakan
sampel protein kompleks karena hanya antigen spesifik yang menjadi tidak
bergerak daripada seluruh sampel protein. Semakin banyak antigen yang
diimobilisasi, semakin tinggi pula sensitivitas potensial pengujian (TIP, 2010).
Sandwich ELISA biasanya membutuhkan penggunaan pasangan antibodi yang
cocok, di mana masing-masing antibodi spesifik untuk bagian epitop antigen
yang berbeda dan tidak tumpang tindih (Madan, 2006). Antibodi monoklonal
atau poliklonal dapat digunakan sebagai antibodi penangkapan dan deteksi
dalam sisitem Sandwich ELISA. Antibodi monoklonal mengenali epitop
tunggal yang memungkinkan deteksi halus dan kuantifikasi perbedaan kecil
dalam antigen. Poliklonal sering digunakan sebagai antibodi penangkap untuk
menarik sebanyak mungkin antigen (abcam, 2000).
Sandwich ELISA dapat dibagi menjadi dua sistem, yang telah dinamai
sandwich ELISA direct dan sandwich ELISA indirect (Crowther, 2009).
 13

2.4.3.1. Sandwich ELISA Direct

Sandwich ELISA direct dapat diilustrasikan pada gambar 7 dan 8.
Sistem ini mengeksploitasi antibodi yang melekat pada fase padat untuk
menangkap antigen. Antigen kemudian dideteksi menggunakan serum spesifik
untuk antigen. Antibodi pendeteksi dilabeli dengan enzim. Antibodi penangkap
dan antibodi pendeteksi dapat berupa serum yang sama atau dari hewan berbeda
dari spesies yang sama atau dari spesies berbeda. Antigen harus memiliki
setidaknya dua situs yang berbeda (Crowther, 2009).

Gambar 7. Sandwich elisa Direct

 14

Sandwich ELISA direct melibatkan perlekatan pasif antibodi ke fase

padat (tahap i dan ii). Antibodi ini (antibodi tangkap) kemudian mengikat
antigen yang ditambahkan pada tahap iii. Antigen dilarutkan dalam buffer
blocking untuk menghindari perlekatan yang tidak spesifik pada fase padat. Di
sini, komponen buffer penyumbat tidak boleh mengandung antigen apa pun
yang mungkin mengikat antibodi penangkap. Setelah inkubasi dan pencucian,
kompleks anti-tubuh-antigen melekat pada fase padat (tahap iv).
Antigen yang ditangkap kemudian dideteksi dengan penambahan
antibodi spesifik berlabel enzim dalam memblokir penyangga (tahap v). Jadi,
ini adalah pengikatan konjugat langsung dengan target antigenik pada antigen
yang terikat. Antibodi kedua ini bisa sama dengan yang digunakan untuk
penangkapan, atau berbeda dalam hal sumber hewan tertentu atau spesies di
mana ia diproduksi. Setelah inkubasi dan pencucian (tahap vi), enzim terikat
dikembangkan dengan penambahan substrat / kromogen (tahap vii), kemudian
dihentikan (tahap viii), dan akhirnya dibaca menggunakan spektrofotometer
(tahap ix) (Crowther, 2009).

Gambar 8. Tahapan Sandwich E;LISA direct.

 15

2.4.3.2. Sandwich ELISA Indirect

Sandwich ELISA indirect dapat diilustrasikan pada gambar 9 dan 10
berikut. Antigen ditangkap oleh antibodi fase padat. Antigen kemudian
dideteksi menggunakan anti-benda dari spesies lain. Ini pada gilirannya terikat
oleh konjugat anti-spesies. Dengan demikian, spesies serum untuk melapisi dan
mendeteksi antibodi harus berbeda; konjugat anti-spesies tidak dapat bereaksi
dengan antibodi pelapis (Crowther, 2009).

Gambar 9. Sandwich ELISA indirect

Dalam uji sandwich ELISA indirect, tahap i-iv sangat mirip dengan
ELISA sandwich langsung. Dengan demikian, antibodi secara pasif melekat
 16

pada fase padat dan antigen ditangkap. Namun, tahap v melibatkan

penambahan deteksi antibodi. Dalam hal ini, antibodi tidak diberi label dengan
enzim. Setelah inkubasi dan pencucian (tahap vi), antibodi pendeteksi sendiri
dideteksi dengan penambahan dan inkubasi dengan konjugat enzim anti-spesies
(tahap vii). Konjugat terikat kemudian diproses seperti yang dijelaskan dalam
sistem lain (tahap xiii-ix).

Gamabr 10. Tahapan Sandwich ELISA Indirect.

ELISA sandwich memiliki beberapa kelebihan, tara lain:
 Spesifisitas tinggi: antigen / analit secara khusus ditangkap dan dideteksi
 Cocok untuk sampel kompleks (atau kasar / tidak murni): antigen tidak
memerlukan pemurnian sebelum pengukuran
 Fleksibilitas dan sensitivitas: metode deteksi langsung atau tidak langsung
dapat digunakan (Madan, 2006).
 17

2.4.4. ELISA Competitiv

ELISA kompetitif adalah proses reaksi kompetitif antara antigen sampel
dan antigen yang terikat pada sumur-sumur pelat mikrotiter dengan antibodi
primer. Pertama, antibodi primer diinkubasi dengan sampel antigen dan
kompleks antibodi-antigen yang dihasilkan ditambahkan ke sumur yang telah
dilapisi dengan antigen yang sama. Setelah masa inkubasi, setiap antibodi yang
tidak terikat dibersihkan. Semakin banyak antigen dalam sampel, semakin
banyak antibodi primer akan terikat pada antigen sampel. Oleh karena itu, akan
ada sejumlah kecil antibodi primer yang tersedia untuk mengikat antigen yang
dilapisi pada sumur, menghasilkan pengurangan sinyal. Keuntungan utama dari
jenis ELISA ini muncul dari sensitivitasnya yang tinggi terhadap perbedaan
komposisi dalam campuran antigen kompleks, bahkan ketika antibodi
pendeteksi spesifik hadir dalam jumlah yang relatif kecil (Madan, 2006).

Gambar 11. Tahapan ELISA Copetitiv

 18

2.5. KOMPONEN PERANGKAT ELISA

Komponen utama perangkat ELISA terdiri atas Ab, Ag, imunoprob, substrat,
reagen penghenti reaksi (blocking reagent), bufer, dan cawan ELISA (Suryadi et al.,
2016).
2.5.1. Plat ELISA
2.5.1.1. Plate Format
Pelat berdasar rata, 96-sumur, terbuat dari polistirena atau polivinil
klorida, digunakan di sebagian besar pengujian ELISA. Atau pelat sumur strip
dapat digunakan. Ini adalah bingkai dalam ukuran pelat 96-sumur yang diisi
dengan strip 8-sumur atau 12-sumur sebanyak yang dibutuhkan pada
percobaan. Varian selanjutnya adalah pelat 384-well dan 1536-well; ini
memiliki jejak yang sama dengan pelat 96-sumur tradisional tetapi mampu
memproses lebih banyak sampel per piring. Untuk penggunaan optimal mereka
memerlukan penanganan otomatis dan karenanya secara eksklusif digunakan
dalam penyaringan throughput tinggi. Beberapa substrat enzim, seperti yang
menghasilkan sinyal fluoresen atau chemiluminescent mungkin memerlukan
pelat buram untuk hasil yang optimal (Bio-Rad & Laboratories, 2017).
2.5.1.2. Karakteristik Plat
Penting untuk menggunakan pelat yang dirancang untuk ELISA karena
dibuat untuk menjaga konsistensi, meminimalkan efek tepi dan menyediakan
kondisi optik yang optimal untuk pengumpulan data. Merupakan ide yang baik
untuk menguji pelat dari beberapa pabrikan untuk variabilitas batch-ke-batch
dan plat-ke-plat, terutama jika pengujian sedang dikembangkan untuk
penggunaan komersial, diagnostik, atau kontrol kualitas. Harapan yang biasa
adalah variasi 5% atau lebih rendah pada kontrol umum di 2 pelat. Pelat ELISA
polystyrene standar jatuh ke dalam jenis ikatan rendah ke sedang, yang berarti
bahwa mereka akan menangkap sekitar 100-200 ng IgG / cm2 (Bio-Rad &
Laboratories, 2017).
 19

2.5.2. Buffer
Beberapa buffer berbeda digunakan selama ELISA: satu untuk
pelapisan, yang lain untuk pemblokiran, yang lain untuk mencuci, dan mungkin
yang lain untuk sampel dan pengenceran antibodi. Buffer dapat diproduksi di
rumah atau bersumber dari berbagai antibodi komersial dan pemasok reagen
(Bio-Rad & Laboratories, 2017). Bufer dasar yang paling sering digunakan
dalam ELISA adalah bufer fosfat (Phosphate-Buffered Saline, PBS) dan bu- fer
karbonat. Bufer lain seperti bufer ekstraksi, bufer pencuci, bufer Ab, bufer
konjugat, dan bufer substrat dibuat dengan menambahkan senyawa kimia
tertentu seperti Tween-20, polyvinylpirrolidone (PVP), dan 2-mercaptoethanol
pada bufer dasar. Senyawa yang sering digunakan untuk blocking reagents
adalah bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OA), gelatin, susu skim,
NaOH, dan asam sulfat (H2SO4) (Suryadi et al., 2016).
2.5.3. Substrat
Senyawa kimia yang digunakan sebagai media (substrate) untuk reaksi
enzimatik berbeda-beda, bergantung pada enzim yang dugunakan. Enzim AP
memerlukan p-nitrophenyl phosphate (PNPP) yang dilarutkan dalam
diethanola- mine 10%. Substrat ini dihidrolisis oleh enzim menjadi p-
nitrophenyl (PNP) yang berwarna kuning. Enzim HRP menggunakan substrat
tetramethyl benzidine (TMB) yang dilarutkan dalam dimethylsulsulfoxide
(DMSO), substrat ini dihidrolisis menjadi enzim men- jadi produk berwarna
biru (Suryadi et al., 2016).
2.5.4. Antibodi
Ab adalah immunoglobulin (Ig) dari hewan yang diimunisasi Ag
patogen sasaran (AgP). Berdasarkan teknik produksi dan spesifisitas reaksinya,
Ab dibedakan menjadi Ab poliklonal (PAb) dan Ab monoklonal (MAb),
sedangkan menurut bentuk molekulnya dibedakan menjadi Ab dan F(ab’)2. Ab
juga dibedakan menjadi Ab primer (AbP) dan Ab sekunder (AbS). AbP adalah
Ab yang homolog atau bereaksi dengan AgP, diproduksi dengan
 20

mengimunisasi hewan, seperti mencit dan kelinci, dengan AgP. AbS atau anti-
AbP adalah Ab yang diproduksi dengan mengimunisasi hewan lain seperti
kambing (goat) dengan AbP (Suryadi et al., 2016).
Antibodi yang digunakan dalam tes ELISA dapat berupa monoklonal,
poliklonal, atau kombinasi keduanya. Setiap jenis antibodi menawarkan
keuntungan yang berbeda dalam pengembangan ELISA, sehingga penting
untuk menghargai perbedaan di antara mereka dan bagaimana ini dapat
digunakan untuk memperoleh keuntungan selama pengembangan ELISA (Bio-
Rad & Laboratories, 2017).
2.5.5. Antigen
Ag yang digunakan sebagai AgP pada teknik ELISA adalah partikel
virus, sel bakteri, propagul jamur, atau senyawa protein dan polisakarida
patogen yang antigenik, dapat merangsang timbulnya Ab pada hewan yang
diimunisasi. AgP digunakan sebagai kon- trol positif pada uji ELISA (Suryadi
et al., 2016).
2.5.6. Imunoprob (Immunoprobe)
Imunoprob untuk ELISA dibuat dengan mengkonjugasikan Ab dengan
suatu enzim menjadi ‛konjugat Ab-enzim’. Konjugat ini dapat dibuat dengan
mengkonjugasikan AbP atau AbS dengan enzim tertentu. Enzim yang
digunakan untuk membuat konjugat beragam, yang paling umum adalah
Alkaline Phosphatase (AP) dan Horse-radish Peroxidase (HRP) (Suryadi et al.,
2016).
2.6. Penggunaan Aplikasi ELISA
Karena ELISA dapat dilakukan untuk mengevaluasi keberadaan antigen atau
keberadaan antibodi dalam sampel, maka alat dapat digunakan untuk menentukan
konsentrasi antibodi serum, seperti dengan tes HIV (A.Sharma, 2008). Dalam industri
makanan ELISA digunakan untuk mendeteksi alergen makanan potensial, seperti susu,
kacang tanah, kacang kenari, almond, dan telur. Sri Rachmawati dkk telah
mengembangkan ELISA kit yang dapat digunakan untuk monitoring kandungan
 21

alfatoksin B1 pada pakan dan jagung (Rachmawati, Lee, Murdiati, & Kennedy, 2004).
ELISA dapat digunakan sebagai tes darah serologis untuk penyakit celiac (Porcelli,
Ferretti, Vindigni, & Terzuoli, 2016). Dr Dennis E Bidwell dan Alister Voller
menciptakan tes ELISA untuk mendeteksi berbagai jenis penyakit, seperti demam
berdarah, malaria, penyakit Chagas, penyakit Johne, dan lainnya (Griffin et al., 2005).
Tes ELISA juga digunakan sebagai diagnostik in vitro di laboratorium medis.
Kegunaan lain dari ELISA meliputi:
 deteksi antibodi Mycobacterium pada tuberculosis
 deteksi rotavirus dalam tinja
 deteksi penanda hepatitis B dalam serum
 deteksi penanda hepatitis C dalam serum
 deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja
 deteksi antibodi HIV dalam sampel darah
 22

BAB III
SIMPULAN DAN SARAN
3.1. SIMPULAN
Berdasarkan pembahasan tersebut maka didapat simpulan sebagai berikut:

3.1.1. ELISA adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang
imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu
sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis,
patologi tumbuhan, dan jug
3.1.2. a berbagai bidang industri. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu
antibodi dengan spesifitas yang lebih tinggi dibandingkan metode imun lainnya.
3.1.3. Prinsip ELISA menggunakan konsep imunologi dasar dari antigen yang
mengikat antibodi spesifiknya, yang memungkinkan pendeteksian sejumlah
kecil antigen seperti protein, peptida, hormon, atau antibodi dalam sampel
cairan.
3.1.4. Tahapan umum ELISA meliputi penempelan (trapping) Ag atau Ab pada media
reaksi (solid phase), seperti cawan ELISA, diikuti penambahan konjugat
Abenzim, dan diakhiri dengan penambahan substrat serta bufer penghenti
reaksi (blocking buffer).
3.1.5. Tipe- tipe ELISA meliputi: Direct ELISA, Indirect ELISA, Sandwich ELISA,
Competitive ELISA
3.1.6. Komponen utama perangkat ELISA terdiri atas Ab, Ag, imunoprob, substrat,
reagen penghenti reaksi (blocking reagent), bufer, dan cawan ELISA.

3.2. SARAN

Penulis menyadari bahwa penyusunan makalah ini memiliki banyak

kekurangan sehingga diharapkan bagi para pembaca agar bisa memberikan masukan
untuk melengkapi makalah in.
 23

DAFTAR PUSTAKA

A.Sharma, Y. . M. (2008). Resident ’ s Page Laboratory diagnosis of HIV WHEN TO

OFFER HUMAN. Sexually Transmitted Diseases, 29(1), 5–8.
abcam. (2000). General Procedure :Sandwich ELISA. Abcam, 8–9.
Andini, S. T. (2016). Titer Anti-Hbs Dengan Variasi Waktu Pembacaan Absorbansi
Pada Elisa Reader. Unimus, 1(1), 1–46.
Bio-Rad, & Laboratories, I. (2017). ELISA Basics Guide. 43. Retrieved from
https://www.bio-rad-antibodies.com/static/2017/an-introduction-to-elisa/elisa-
basics-guide.pdf
Crowther, J. (2009). The ELISA Guidebook Series Editor. In Methods in Molecular
Biology. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-254-4
Engvall, E. (2010). The ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical
Chemistry, 56(2), 319–320. https://doi.org/10.1373/clinchem.2009.127803
Gan, S. D., & Patel, K. R. (2013). Enzyme immunoassay and enzyme-linked
immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology, 133(9), 1–3.
https://doi.org/10.1038/jid.2013.287
Griffin, J. F. T., Spittle, E., Rodgers, C. R., Liggett, S., Cooper, M., Bakker, D., &
Bannantine, J. P. (2005). Immunoglobulin G1 Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay for Diagnosis of Johne’s Disease in Red Deer (Cervus elaphus). Clinical
and Vaccine Immunology, 12(12), 1401–1409.
https://doi.org/10.1128/cdli.12.12.1401-1409.2005
Leng, S. X., McElhaney, J. E., Walston, J. D., Xie, D., Kuchel, G. A., & Fedarko, N.
S. (2008). ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in
Inflammation and Aging Research. The Journals of Gerontology Series A:
Biological Sciences and Medical Sciences, 63(8), 879–884.
https://doi.org/10.1093/gerona/63.8.879
Lequin, R. M. (2005). Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Clinical Chemistry, 51(12), 2415–2418.
https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.051532
Madan, A. C. (2006). ELISA HandbooMadan, A. C. (2006). ELISA Handbook.
Bulletin of the American Geographical Society, 39(2), 122.
https://doi.org/10.2307/198393k. Bulletin of the American Geographical Society,
39(2), 122. https://doi.org/10.2307/198393
Porcelli, B., Ferretti, F., Vindigni, C., & Terzuoli, L. (2016). Assessment of a Test for
 24

the Screening and Diagnosis of Celiac Disease. Journal of Clinical Laboratory

Analysis, 30(1), 65–70. https://doi.org/10.1002/jcla.21816
Rachmawati, S., Lee, A., Murdiati, T. B., & Kennedy, I. (2004). Pengembangan
enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) teknik untuk analisis aflatoksin
B1 pada pakan ternak. Pros. Seminar Parasitologi Dan Toksikologi Veteriner,
(February), 143–160.
Randles, J. W., Hodgson, R. A. J., & Wefels, E. (1996). The rapid and sensitive
detection of plant pathogens by molecular methods. Australasian Plant
Pathology, 25(2), 71–85. https://doi.org/10.1071/AP96014
Suryadi, Y., Manzila, I., & Machmud, M. (2016). Potensi Pemanfaatan Perangkat
Diagnostik ELISA serta Variannya untuk Deteksi Patogen Tanaman. Jurnal
AgroBiogen, 5(1), 39. https://doi.org/10.21082/jbio.v5n1.2009.p39-48
TIP, T. (2010). ELISA technical guide and protocols. Thermo Fisher Scientific Inc.
USA., 0747(815).