Journal Reading

EKSPRESI EMPAT GEN SITOKIN/KEMOKIN PADA SEL MONONUKLEAR

DARAH TEPI YANG TERINFEKSI VIRUS DENGUE

Oleh

Ulfah Latifah

1840312454

Preseptor

Dr. dr. Rinang Mariko, Sp. A (K)

BAGIAN ILMU KESEHATAN ANAK

RSUP DR M DJAMIL PADANG
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ANDALAS

2019
EKSPRESI EMPAT GEN SITOKIN/KEMOKIN PADA SEL MONONUKLEAR
DARAH TEPI YANG TERINFEKSI VIRUS DENGUE

ABSTRAK

Produksi sitokin pro-inflamasi berlebihan pada infeksi virus dengue (DENV) yang
dihubungkan dengan terjadinya kebocoran plasma pada endotel vaskular telah diteliti
dengan hasil yang bervariasi. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi ekspresi empat
gen sitokin atau kemokin pada sel mononuklear darah tepi yang terinfeksi virus dengue
serotipe-2 (DENV-2). Sel mononuklear darah tepi (PBMC) diisolasi dari donor sehat
dengan menggunakan metode sentrifugasi gradien Ficoll. Sel disimpan dalam media
kultur dan ekstraksi RNA dilakukan terhadap sel mononuklear darah tepi, kemudian
sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakan primer oligo d(T) dan sistem enzim
reverse transcriptase. Secara quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-
PCR) berbasis SYBR-Green, ekspresi gen IL-6, IL-8, IL-10 dan MIP-1β dibandingkan
antara sel yang terinfeksi dan tidak terinfeksi virus dengue serotipe-2. Observasi
dilakukan pada waktu pengamatan jam ke-6 dan waktu pengamatan ke-18 setelah
infeksi. Pada pengamatan ini ditemukan profil ekspresi sitokin/kemokin yang berbeda.
Ekspresi gen IL-8 dan IL-10 ditemukan lebih tinggi, sebaliknya ekspresi gen IL-6 dan
MIP-1β lebih rendah pada sel mononuklear darah tepi yang terinfeksi virus dengue
serotipe-2 dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sitokin IL-8 dan IL-10 merupakan
sitokin yang bersifat kemotaktik yang memicu kemotaksis dari sel netrofil, basofil,dan
limfosit sebagai respon inflamasi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekspresi
kedua gen kemokin yang meningkat setelah infeksi virus dengue serotipe-2 mungkin
berperan pada patogenesis terjadinya kebocoran plasma pada infeksi virus dengue.

Kata Kunci: dengue, ekspresi gen, sitokin, kemokin, PMBC

Fakultas Kedokteran Universitas Andalas 2

PENDAHULUAN
Infeksi yang disebabkan oleh virus dengue masih menjadi penyebab mayoritas
demam febril akut di dunia, terutama daerah tropikal dan subtropikal, termasuk kawasan
Asia Tenggara.1 Penyebaran yang luas dari virus dengue (DENV) dan vektor nyamuk
Aedes kini telah menjadi masalah besar, dan lebih dari 125 negara telah diketahui
menjadi daerah endemik dengue, termasuk Indonesia.2 Ekspansi DENV yang tinggi
berkaitan dengan perubahan iklim, efek globalisasi, komunitas perjalanan, sosial
ekonomi, pemukiman dan evolusi virus. 2 Dengue merupakan penyakit kompleks yang
disebabkan oleh virus RNA, melibatkan empat antigen yang mirip namun berbeda
serotipe secara imunologis (DENV-1 hingga DENV-4).3,4 Infeksi serotipe spesifik
DENV memberikan kekebalan seumur hidup dengan kekebalan perlindungan secara
parsial untuk serotipe lain sehingga penduduk di daerah endemik dapat terinfeksi hingga
empat kali oleh DENV yang berbeda. 5 Manifestasi klinis bervariasi dari tanpa gejala
hingga gejala berat yang mengancam nyawa. 6 Mayoritas manifestasi klinis dengue
ringan, tanpa gejala atau demam ringan. Sebagian kecil insiden menunjukkan gejala
berat berupa Demam Berdarah Dengue (DBD) dengan berbagai derajat dan Sindrom
Syok Dengue dimana tingkat kematian dapat melebihi 5% dalam populasi khusus. 4,5
Perburukan sindrom dengue atau sindrom dengue yang tidak biasa dengan angka
kematian yang tinggi dapat muncul tanpa tanda kebocoran plasma yang menjadi
penanda derajat berat dengue.7
Patogenesis dengue secara rinci belum sepenuhnya dipahami. Keberadaan sitokin
yang menginduksi disfungsi endotel pada infeksi DENV telah dipublikasi selama
beberapa dekade terkahir.8 Pelepasan sitokin yang berlebihan (storm-cytokine) dianggap
sebagai mekanisme yang mendasari terjadinya kebocoran plasma pada infeksi DENV. 9
Beragam peran sitokin dan kemokin setelah diamati pada gejala yang lebih berat dari
demam berdarah kemungkinan berkolerasi dengan serotipe DENV yang menginfeksi. 10
Pada fase yang berbeda, profil sitokin/kemokin ditemukan meningkat saat fase febril.11
Beberapa penelitian juga melaporkan peningkatan ekspresi sitokin/kemokin secara in
vitro pada monosit manusia12 atau sel epitel13, atau secara in vivo pada serum pasien
dengue.14 Peran ganda antara bawaan dan jalur inflamasi diaktifkan pada penyakit
dengue dan melibatkan beberapa mediator imun. 14 Melalui sampel sel manusia yang

Fakultas Kedokteran Universitas Andalas 3

terinfeksi, profil ekspresi gen sitokin/kemokin yang teregulasi selama infeksi serotipe
DENV telah dijelaskan dan diantaranya IL-6, IL-8 dan IL-10.13 Penelitian lain
melaporkan adanya induksi MIP-1β oleh virus dengue.15 Dalam penelitian ini, kami
melaporkan profil ekspresi empat gen yang mengkode sitokin dan kemokin pada sel
mononuklear darah tepi pada warga Indonesia yang terinfeksi dengan isolate DENV-2.

BAHAN DAN METODE

Pertimbangan Etis
Pertimbangan etis dari penelitian ini telah ditinjau dan disetujui oleh Dewan
Peninjauan Institusi Universitas Udayana, Bali, Indonesia (No. Dokumen
2072/UN.14.2/KEP/2017).
Pengumpulan Sampel Darah dan Isolasi Sel Mononuklear Darah Tepi
Tiga puluh mililiter darah vena diambil dari donor sehat dan mengisolasi PBMC
menggunakan Ficoll Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) melalui
sentrifugasi densitas secara bertahap. PBMC yang terisolasi dipertahankan dalam satu
media RPMI yang dilengkapi dengan 100% serum janin sapi (FBS), 1%
antibiotik/antimikrotik dan 2mM L-glutamin (semua dari Gibco-Thermo Fisher
Scientific, Carlsbad, CA). Sel diunggulkan pada 1 106 sel/sampel pada 24 sampel yang
baik (Corning, NY). Sel yang unggul dibiarkan istirahat selama inkubasi semalaman
pada inkubator 37°C dengan suplementasi CO2 5%.
Infeksi DENV
Strain virus DENV-2 SMG-SE001 diisolasi dari pasien demam berdarah yang berat
di Semarang pada 201216 (koleksi Eijkman). Sel yang diinfeksikan DENV-2
menggunakan multiplisitas infeksi (MOI) 1 (teoritis kalkulasi satu virus PFU per sel),
disiapkan pada 1 RPMI medium-2% FBS, dan diduplikasi. Untuk mencapai MOI 1
(secara teoritis satu partikel virus menginfeksi satu sel), sejumlah 106 Plaque Forming
Unit (PFU) DENV-2 diinokulasi ke dalam 106 sel PBMC. Titer DENV PFU diukur
menggunakan metode uji plak standar seperti yang dijelaskan pada penelitian lain16,
sementara sel kontrol yang tidak terinfeksi diinokulasikan menggunakan penambahan
medium saja. Sampel kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C, CO2 5%

Fakultas Kedokteran Universitas Andalas 4

untuk memfasilitasi infeksi virus. Masa inkubasi dilanjutkan dan sel yang telah siap
pada 0, 6 dan 18 jam setelah diinfeksi dapat mewakili fase awal penyakit dengue.
Total Ekstraksi RNA dan qRT-PCR
Sel yang terinfeksi disimpan pada titik waktu yang ditentukan dan diekstraksi total
RNA menggunakan kit Isolasi RNA miRCURY - Sel dan Tanaman (Exiqon, Vedbaek,
Denmark), seperti yang dijelaskan dalam instruksi manufaktur. Kuantitas total RNA
diukur menggunakan Qubit 3.0 fluorometer dan Qubit RNA BR Assay Kit (Teknologi
Life-Thermo Fisher Scientific, Eugene, OR). Sejumlah 100 ng dari total RNA
digunakan dalam sintesis cDNA menggunakan oligo d (T) primer dan GoScript Reverse
Transcription System (Promega, Madison, WI). cDNA yang dihasilkan kemudian
diamplifikasi dengan qRT-PCR menggunakan GoTaq qPCR Master Mix (Promega) dan
primer seperti yang tercantum pada Tabel 1. Ekspresi gen relatif dianalisis
menggunakan persamaan 2-δδCt dari nilai Ct yang dinormalisasi untuk β-aktin manusia.

HASIL DAN DISKUSI

Peningkatan ekspresi gen IL-8 dan IL-10 yang diamati pada infeksi DENV-2
dengan kadar tertinggi tampak pada 18 jam setelah infeksi (Gambar 1). Sebaliknya,
ekspresi gen IL-6 dan MIP-1β relatif berkurang selama fase infeksi. Peningkatan
regulasi IL-8 dan IL-10 mencapai lebih dari dua kali lipat pada 18 jam setelah infeksi,
relatif terhadap kelompok kontrol yang tidak terinfeksi. Penurunan ekspresi gen IL-6
dan MIP-1β hampir setengah kali lipat terlihat pada titik waktu yang sama.

Fakultas Kedokteran Universitas Andalas 5

 Gambar 1. Relativitas ekspresi gen sitokin/kemokin yang terinfeksi DENV-2
pada PMBC dalam tiga titik waktu setelah infeksi

Pengamatan kami menunjukkan peningkatan IL-8 dan IL-10 pada sel mononuklear
darah tepi yang terinfeksi DENV-2 dan relatif tidak terinfeksi pada kelompok kontrol.
IL-8 merupakan sitokin pro-inflamasi, salah satu kelompok kemokin CXCL dan faktor
kemoktasis neutrofil dimana banyak diselidiki dan ditemukan meningkat pada kadar
protein.17 Sitokin IL-8 merupakan kemoatraktan neutrofil yang diproduksi oleh
makrofag dan jenis sel lainnya, seperti sel endotel, fibroblas dan sel sinovial. 17 Telah
dilaporkan bahwa peningkatan kadar sitokin IL-8 dalam serum pasien dengue
berkorelasi dengan derajat keparahan demam berdarah. 18 Kadar IL-8 secara signifikan
lebih tinggi pada sampel dari kasus demam berdarah yang berat dan lebih rendah pada
kasus demam berdarah tanpa gejala klinis dibandingkan dengan kelompok kontrol yang
sehat. Sampel yang positif untuk antibodi anti-DV IgG memiliki kadar IL-8 yang lebih
tinggi.18
IL-10 merupakan salah satu kemokin CC-motif dalam merespon interferon-γ pada
penyakit infeksi.18 Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan ekspresi yang diinduksi
dari kemokin IL-10 telah didokumentasikan dengan baik pada sel dendritik dan garis
keturunan sel primer lainnya sebagai respons terhadap infeksi dengue in vitro 19 serta
pada sel mononuklear darah tepi pasien dengue. 20 Kadar IL-10 telah ditemukan
meningkat dalam serum pasien yang terinfeksi dengue dalam penelitian di Venezuela

Fakultas Kedokteran Universitas Andalas 6

dan Singapura.21 Selain itu, peningkatan kadar sitokin / kemokin IL-8 dan IP-10 juga
diamati pada sel epitel paru-paru manusia A549 yang terinfeksi DENV.13
Kami mengamati trend reduksi pada ekspresi gen IL-6 dan MIP-1β selama infeksi
DENV-2 pada PBMCs. Peningkatan kadar IL-6 telah dilaporkan pada pasien dengue.22
Selain itu, peningkatan kadar IL-6 menunjukkan korelasi derajat keparahan penyakit
dengan kadar yang lebih tinggi diamati dalam bentuk manifestasi demam berdarah yang
berat, melalui pengaturan respon inflamasi pada makrofag dan induksi pematangan sel
B.23 Protein Dengue NS1 ditemukan secara signifikan meningkatkan produksi IL-6 dan
aktivasi secara menyeluruh TLR-2 dan TLR-6 di PBMC yang terinfeksi DENV.24
Ekspresi MIP-1β yang lebih tinggi dilaporkan pada PBMC dari pasien yang terinfeksi
DENV.11 Namun, dalam penelitian ini kami tidak menemukan peningkatan kadar
ekspresi gen untuk IL-6 dan MIP-1β dalam waktu 18 jam infeksi DENV. Sebuah
penelitian tinjauan sistematis penanda keparahan penyakit dengue mengungkapkan
bahwa peningkatan kadar IL-6 dan MIP-1β telah diamati pada sampel yang diambil
lebih dari 48 jam setelah timbulnya demam. 25 Hasil dari penelitian ini mungkin terkait
dengan perbedaan dalam pengaturan eksperimental analisis ekspresi gen dan periode
pengumpulan sampel yang ditunjuk untuk mewakili fase awal pengembangan penyakit
dengue selama 18 jam infeksi virus. Namun, penurunan kadar IL-6 dan MIP-1β telah
diamati pada demam berdarah dengan gejala klinis selama perkembangan penyakit dari
fase demam ke fase pemulihan. Hasil penelitian saat ini sesuai dengan hasil penelitian
sebelumnya dimana peningkatan kadar IL-6 dan IL-8 serum terdeteksi pada pasien
dengan demam berdarah dengue.26 Diperlukan penelitian yang lebih mendalam untuk
mempelajari kinetika sitokin ini selama infeksi dengue.

KESIMPULAN
Telah dilaporkan dinamika empat sitokin terkait dengan fase awal infeksi DENV.
Peningkatan regulasi IL-8 dan IL-10 sebagai kemokin dengan profil yang sangat
berkorelasi dengan demam dengue daripada penyakit demam lainnya dan memiliki
potensi untuk digunakan sebagai biomarker demam berdarah karena ekspresi sitokin
yang tinggi pada fase awal dalam pengamatan penelitian ini.

Fakultas Kedokteran Universitas Andalas 7

UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didukung oleh Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas
Warmadewa. Kami mengucapkan terima kasih kepada Prof. Aryati, Prof. Yoes Prijatna
Dachlan, Dr. Sunaryo, Dr. H. Muchlis A. Udji, dan Dr. Gondo Mastutik, atas masukan
dan saran kritisnya untuk penelitian ini.

KONFLIK KEPENTINGAN
Penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan tertentu.

Fakultas Kedokteran Universitas Andalas 8