Anda di halaman 1dari 7

Estimasi Usia Luka Dengan Deteksi Simultan 9 Sitokin Pada Manusia Luka Kulit Dengan

Immunoassay Berbasis Multipel: Estimasi Metode Menggunakan Pemeriksaan Sumber Lain


Masataka Takamiya a, * , Hitoshi Biwasaka b, 1 , Kiyoshi Saigusa c, 2 , Nori Nakayashiki a , Yasuhiro Aoki a
sebuah Departemen Hukum Kedokteran, Iwate Kedokteran University School of Medicine, 19-1 Uchimaru, Morioka, Iwate 020-8505, Jepang
b Laboratorium Investigasi Ilmiah, Markas Besar Kepolisian Prefektur Iwate, 3-40 Uchimaru, Morioka, Iwate 020-0822, Jepang
c Departemen Biologi, Pusat Seni dan Sains Liberal Universitas Kedokteran Iwate, 2-1-1 Nishitokuta, Yahaba, Iwate 028-3694, Jepang

artikel info Abstrak

Sejarah artikel: Estimasi usia luka untuk luka kulit manusia dilakukan berdasarkan kuantifikasi
Diterima 20 Januari 2009 interleukin 1b (IL 1b), IL 5, IL 7, IL 12 p70, IL 13, IL 17, faktor perangsang
Diterima dalam bentuk revisi 14 Maret koloni granulosit (G-CSF), protein moattractant 1 (MCP 1), dan protein
2009
inflamasi makrofag 1b (MIP 1b). IL 5, IL 12 p 70, IL 13, dan IL 17 meningkat
Diterima 17 Maret 2009
Tersedia online 5 Mei 2009
dari fase awal, MCP 1 secara eksklusif di fase tengah, dan IL 1b, G-CSF, dan
MIP 1b dari fase tengah ke fase akhir. IL 7 menurun dari fase awal. Di antara
Kata kunci: sitokin yang dianalisis dalam penelitian ini, MCP 1 adalah sitokin yang paling
Luka penuaan banyak. Selain itu, pemeriksaan , yang dapat tersedia untuk setiap lembaga
Penyembuhan luka forensik, dilakukan dalam dua kasus untuk konfirmasi tujuan. Banyak faktor
Kulit telah diusulkan sebagai penanda untuk estimasi usia luka dermal, tetapi
Sitokin himpunan sitokin yang dipilih untuk pemeriksaan outsourcing dalam luka
Immunoassay berbasis manik penelitian ini bermanfaat dalam forensik harian praktek.
© 2009 Elsevier Ireland Ltd. Semua hak dilindungi undang-undang.

multipleks, yang dapat tersedia di lembaga forensik


apa pun. Untuk mencapai ini, kuantitatif analisis
ekspresi tergantung
1. Pendahuluan
waktu dari 9 sitokin lain di Jepang luka kulit manusia -
Usia luka dermal memberi ahli patologi forensik
interleukin 1b (IL 1b), IL 5, IL 7, IL 12 p 70, IL 13, IL 17,
informasi berharga untuk rekonstruksi TKP dan
faktor stimulasi koloni granulosit (G-CSF), monosit protein
penentuan penyebab kematian. Selama penyembuhan
chemoattractant 1 (MCP 1), dan makrofag protein inflamasi
luka kulit, fase awal terdiri dari respons yang relatif
1b (MIP 1b) - dilakukan untuk mengevaluasi kegunaannya
cepat, seperti perubahan dalam tonus pembuluh darah
untuk estimasi umur luka. Selain itu, pemeriksaan sumber lain
dan koagulasi. Fase akhir biasanya dijelaskan
dilakukan dalam dua kasus untuk tujuan konfirmasi.
perekrutan dan aktivitas selanjutnya dari berbagai
peradangan.sel tory [1] . Oleh karena itu, dinamika sel
inflamasi telah cocok untuk penuaan luka kulit [2]. 2. Bahan-bahan dan metode-metode
Selain itu, ekspresi sitokin di kulit murine dan deteksi
imunohistokimia di kulit manusia telah dilaporkan, dan 2.1. Konstruksi data fundamental
kegunaannya untuk estimasi usia luka telah disarankan
[3–7]. Ketersediaan sitokin hingga 72 jam postmortem 2.1.1. Sampel
telah ditunjukkan [3,8], meskipun harus diperhatikan Karena tujuan pertama penelitian ini adalah untuk menguji
dipekerjakan dalam dekomposisi sampel forensik
selama postmor-Interval tem. Dalam laporan ekspresi 9 sitokin selama penyembuhan luka kulit untuk
sebelumnya, kami melakukan kuantifikasi 8 sitokin penguatan data fundamental, sampel yang sama yang
menggunakan luka kulit manusia [9]. Meski banyak
faktor telah diusulkan untuk estimasi usia luka [10] , digunakan dalam laporan sebelumnya dianalisis. Kami
ujian semua dari mereka adalah tidak praktis. Selain mengumpulkan sampel kulit manusia dari salah satu luka
itu, metode beton ods, yaitu set faktor praktis, belum
termasuk luka iris, luka tusuk, laserasi, dan memar. Sampel
diperlihatkan.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengusulkan kulit 0,5 x 0,5 cm diambil sejajar dengan
metode usia luka estimasi berdasarkan analisis sitokin

1/6
ekspresi dermal IL 2, IL 5, dan IL 13
kertas [9]. Spesimen dikategorikan ke dalam 10 berikut
sangat rendah dibandingkan dengan
kelompok sesuai dengan usia luka:
rentang penentuan. Karena itu, IL 1b, IL
0,1–0,5 jam ( n = 17), 1–1,92 jam ( n = 15), 2–2,75
jam ( n = 13), 3–4,5 jam 4, IL 6, IL 8, IL 10, G-CSF, GM-CSF,
( n = 14), 6–7 jam ( n = 11), 9 jam ( n = 8), 12– IFN c , MCP 1, dan TNF a dikirim untuk
14,75 jam ( n = 10), 33–49 jam analisis. Meskipun Sistem Array
( n = 5), 71–116,5 jam ( n = 6), 246–744
Penangguhan Bio-Plex bisa mendeteksi
jam ( n = 5), dan jaringan kontrol utuh 17 sitokin dalam spesimen 5 x 5mm,
menggugat ( n = 16). yang di-outsourcing-kan pemeriksaan
membutuhkan tiga spesimen ukuran itu.
2.1.2. Ekstraksi protein total
Protein diekstraksi dari jaringan seperti yang Protein dulu diekstraksi seperti dijelaskan

dilaporkan sebelumnya [9], dan konsentrasi ditentukan di atas. Mempertimbangkan rentang

dengan metode Bradford [11], menggunakan kit uji pemeriksaan sampel diencerkan seperti

komersial (Laboratorium Bio-Rad, Hercules, CA). yang ditunjukkan pada Tabel 1. Setelah

Konsentrasi protein setiap sampel disesuaikan dengan itu, mereka diajukan ke perusahaan

500 l g / ml dengan larutan lysing (Kit Lisis Sel Bio- outsourcing (Mitsubishi Chemical

Plex, Bio-Rad Laboratorium). Medience Corporation, Tokyo, Jepang). Total


protein diperiksa dalam sistem untuk cairan
serebrospinal, karena rentang dinamis
2.1.3. Analisis multipleks
kesesuaian. Hasilnya dikembalikan dalam 1
Kit uji konvensional Bio-Plex untuk 9 sitokin (IL 1b, bulan, dengan biaya 50,000 yen (sekitar 300
IL 5, IL 7, IL 12 p 70, IL 13, IL 17, G-CSF, MCP 1, Euro pada saat penulisan) per kasus.

MIP-1b) dijalankan mengikuti instruksi pabrik (Bio- 2.2.2. Garis besar kasus
2.2.2.1. Kasus 1. Seorang pria berusia 81 tahun
Rad Laboratories). Menggunakan Bio-Sistem Susunan
dengan riwayat hipertensi dan infark otak
Suspensi Plex (Laboratorium Bio-Rad), semua sampel kehilangan kendali atas sepeda motor, dan
bertabrakan dengan van stasioner yang diparkir
dianalisis dalam rangkap dua. Metode tersebut di samping jalan. Tidak ada com- signifikan
dijelaskan secara rinci dalam makalah sebelumnya [9] . keluhan dicatat saat masuk ke rumah sakit,
setelah itu

2.1.4. Evaluasi Tabel 1


Rasio ekspresi sitokin terhadap protein total dan sitokin Persiapan sampel untuk ujian alih daya (Mitsubishi
konsentrasi dalam jaringan kulit dianalisis. Selanjutnya, Chemical Medience
berbeda- ekspresi sitokin antara kontrol dan masing- Perusahaan).
masing jaringan jured dianalisis secara statistic
menggunakan uji Dunnet, dan nilai P 0,05 atau kurang Faktor (volume
dianggap signifikan secara statistik. Supernatan Menambah yang
2.2. Aplikasi kasus ( l l) kan lysing dikirimkan: l l)
solusi ( l l)
Conto
2.2.1. Analisis
h1 200 1300 IL 10 (300)
Tujuan kedua dari penelitian ini adalah untuk GM CSF (500)
menciptakan metode untuk beberapa analisis Total protein
(500)
sitokin tiplex menggunakan pemeriksaan yang Conto
dilakukan oleh pihak luar. Sana-kedepan, ekspresi h2 200 1600 IL 4 (300)
G-CSF (500)
sitokin dari dua kasus tambahan juga dianalisis. MCP 1 (300)
Untuk mengidentifikasi sel yang menyusup ke Total protein
(500)
dalam kulit, nostaining dilakukan [9] .
Conto
Kuantifikasi sitokin juga dilakukan dengan h3 200 2700 IL 1b (500)
menggunakan pemeriksaan yang dilakukan oleh IL 6 (500)
IL 8 (300)
pihak luar (Mitsubishi Chemical Medience IFN c (500)
Corporation, Tokyo, Jepang). Di antara 17 sitokin TNF a (300)
dianalisis dalam [9] studi sebelumnya dan Total protein (500)
sekarang, pemeriksaan untuk IL 7, IL 12 p70, IL
17, dan MIP 1b tidak tersedia di Jepang, dan
masing-masing. Organ visceral adalah anemia. ulang hyoid, 3. Hasil
tiroid tulang rawan, dan tulang rusuk patah. Kematian
3.1. Ekspresi sitokin per protein total
dikaitkan dengan trauma syok matic terutama karena
pendarahan. Spesimen dermal adalah a memar kaki kanan Ekspresi sitokin tergantung-waktu per protein total
bawah. ditunjukkan pada Gambar. 1 . IL 5, IL 12 p 70, IL 13, dan
IL 17 meningkat dari fase awal penyembuhan luka kulit.
2.2.2.2. Kasus 2. Kenaikan signifikan IL 12 p 70 hingga 0,5 jam, dan dari IL
Seorang pria berusia 27 tahun tanpa riwayat medis yang
5, IL 13, dan IL 17 hingga 1,92 jam terlihat, masing-
signifikan. Mereka kehilangan kendali atas sebuah kendaraan,
masing. Sitokin ini aktif di seluruh proses penyembuhan.
dan menabrak pagar pembatas di jalan raya. Dia diangkut ke
Puncak IL 5 dan IL 13 pada 9 jam, IL 17 pada 33-49 jam,
rumah sakit, di mana dia dinyatakan meninggal 10 jam setelah
dan IL 12 p 70 pada 71-116,5 jam diamati di tengah dan
kecelakaan. Otopsi dilakukan 22 jam pasca masuk juri, dan
fase lanjut, meskipun ada sedikit penurunan IL 17 pada 6-
kematian dikaitkan dengan cedera tulang belakang leher. Itu 7, dan pada jam 9 pagi. MCP 1 diekspresikan secara
spesimen kulit adalah memar dari kepala posterior. eksklusif di tengah fase, dan memuncak pada 9 jam. IL 1b,
G-CSF, dan MIP 1b terutama terlihat dari fase tengah ke
Penelitian yang dijelaskan dalam laporan ini dilakukan sesuai fase akhir. Ekspresi puncak IL 1b, G-CSF, dan MIP 1b
menari dengan pedoman untuk eksperimen forensik dari Jepang terlihat pada jam 9. Ekspresi IL 7 ditekan dari fase awal. Di
Perhimpunan Kedokteran Hukum. antara sitokin dianalisis dalam penelitian ini, MCP 1 adalah
yang paling kuat menyatakan.

3.2. Ekspresi sitokin per berat jaringan

Ekspresi sitokin per berat jaringan mirip dengan yang


ada per total protein ( Gbr. 1). Peningkatan IL 12 p 70
hingga 0,5 jam, dan IL 5, IL 13, dan IL 17 hingga 1,92
jam terdeteksi. Puncak IL 12 p 70 pada 6-7 jam, IL 13
pada 9 jam, dan IL 17 pada 33-49 jam diamati pada fase
tengah dan akhir. MCP 1 memuncak pada 12-14,75 jam.
IL 1b,
2/6
Gambar. 1. Perjalanan waktu ekspresi sitokin per protein total (sitokin / protein) dan per berat jaringan (sitokin / jaringan)
selama penyembuhan luka kulit. Hasilnya mewakili

3/6
3.3. Aplikasi kasus
ledakan [16] , IL 8 dalam keratinosit [17] dan
Dalam analisis histologis Kasus 1 dan Kasus 2, fibroblas [16,18], dan G-CSF dalam fibroblas [18].
neutrofil dan
Karena itu, asosiasi ini dengan awal dan sitokin yang
makrofag diinfiltrasi cukup. Limfosit T dan B
tidak terdeteksi, sedangkan fibroblast diekspresikan belakangan dalam penelitian
sebelumnya [9] dan sekarang ies menyarankan peran
menunjukkan sedikit prolifera-tion.
pengaturan IL 17 di seluruh penyembuhan luka pada
Hasil analisis sitokin ditunjukkan pada
kulit. MCP 1, yang merupakan sitokin paling banyak
Tabel 2 .
di masa kini. Penelitian selanjutnya, terutama

4. Diskusi terlokalisasi pada keratinosit [19] dan makrofag [20] .


Injeksi MCP 1 intradermal menyebabkan perbedaan
Tujuan pertama dari penelitian ini adalah infiltrasi makrofag dan limfosit [21] .
untuk memperkuat data fundamental sitokin Dalam penelitian ini, analisis sitokin dari dua kasus
utama selama penyembuhan luka dermal. forensic dicoba menggunakan pemeriksaan outsourcing,
dengan asumsi tion bahwa kuantifikasi sitokin akan
Sebagai tambahannya orang-orang dari 8 sitokin
diterapkan untuk forensic kasus di masing-masing
sebelumnya [9], dinamika tambahan lembaga. Infiltrasi sel inflamasi sama
9 sitokin diperiksa. Dalam penelitian ini, direproduksi
perubahan tergantung waktu dari 9 ekspresi sitokin
diamati, Meja 2
dan itu menunjukkan bahwa analisis kuantitatif sitokin Aplikasi kasus.
ini
Sitokin /
dalam ekstrak jaringan dapat berkontribusi pada Sitokin / protein jaringan (pg
perkiraan usia luka kulit tion. Parameter potensial (pg / mg) / mg)
Kasus 1
adalah IL 5, IL 7, IL 12 p 70, IL 13, dan IL 17 pada (4.3 jam)
fase awal penyembuhan luka kulit, MCP 1 di fase IL 1b 10.79 0,4368
IL 4 1.251 0,05384
tengah, dan IL 1b, G-CSF, dan MIP 1b di tengah dan IL 6 9,930 0,4019
fase terlambat. Mengenai data sebelumnya diperoleh IL 8 27.91 1.130
IL 10 2.692 0,1055
dari penelitian eksperimental pada hewan dan analisis
G-CSF 29.30 1.261
imunohistokimia sampel manusia, pola ekspresi IL 1b GM CSF 9.446 0,3702
[12] dan MCP 1 [8] adalah dekat dengan yang dicatat IFN c 50.19 2.032
MCP 1 683.1 29.40
dalam analisis ini. Sejak kepala sitokin dianalisis TNF a 162.9 6.594
dalam studi [9] sebelumnya dan sekarang, Kasus 2
(10 jam)
keseluruhan tren ekspresi sitokin selama IL 1b 63.85 2.034
penyembuhan luka kulit adalah dijelaskan ( Gbr. 2 ). IL 4 1.765 0,05883
IL 6 41.15 1.311
IL 1b dikeluarkan dari makrofag, dan di-melipat IL 8 1.117 0,03558
ekspresi IL 6 [13] . IL 17, yang memainkan peranan IL 10 4.923 0,1097
G-CSF 22.21 0,7404
penting peran dalam regulasi respon imun [14] ,
GM CSF 5.819 0,1297
menunjukkan biphasic tentu saja IL 17 menginduksi IFN c 40.00 1.274
TNF- a dalam makrofag [15] , IL 1b dalam fibro- MCP 1 976.5 32.55
TNF a 611.1 19.47
Gambar 2. Tren ekspresi sitokin selama penyembuhan luka kulit. Sitokin
dianalisis dalam [9] sebelumnya dan penelitian ini diklasifikasikan menjadi 4 kelompok.

alent dalam kedua kasus. Dalam kasus 1 (4.3 jam), ekspresi Referensi
per protein total IL 1b, IL 4, IL 6, IL 8, IL 10, IFN c , dan [1] Hart J. Inflammation 1: Its role in the healing of acute wounds. J
TNF a tidak konsisten dengan data fundamental, sedangkan Wound Care 2002;11:205–9.
G-CSF, GM-CSF, dan MCP 1 dipromosikan. Dalam kasus [2] Betz P. Histological and enzyme histochemical parameters for the age
estimation of human skin wounds. Int J Legal Med 1994;107:60–8.
2 (10 jam), perbedaan dalam ekspresi Sions per protein total
[3] Hayashi T, Ishida Y, Kimura A, Takayasu T, Eisenmenger W, Kondo T.
IL 1b, IL 4, G-CSF, GM-CSF, IFN c , MCP 1, dan TNF a Forensic application of VEGF expression to skin wound age
tidak terdeteksi. Namun, peningkatan IL 10, dan penurunan determination. Int J Legal Med 2004;118:320–5.
IL 6 dan IL 8 diamati. The Bio-Plex Suspen-sion Array [4] Kondo T. Timing of skin wounds. Leg Med 2007;9:109–14.
System (Laboratorium Bio-Rad) dimaksudkan untuk [5] Ohshima T. Forensic wound examination. Forensic Sci Int
penelitian, dan tidak cocok untuk praktik forensik harian. 2000;113:153–64.
Namun, outsourcing pemeriksaan akan memberikan setiap [6] Takamiya M, Saigusa K, Nakayashiki N, Aoki Y. Studies on mRNA
laboratorium akses ke data sitokin dengan investasi expression of basic fibroblast growth factor in wound healing for wound
minimum tenaga kerja. Penghancuran kulit adalah fitur isi age determination. Int J Legal Med 2003;117:46–50.
[7] Takamiya M, Kumagai R, Nakayashiki N, Aoki Y. A study on mRNA
dengan lesung dan alu, dan persiapan bahan-bahan mahal
expressions of fibronectin in dermal and cerebral wound healing for wound
agen, seperti antibodi, tidak perlu. Selain itu, mutlak age estimation. Leg Med 2006;8:214–9.
kuantifikasi lebih objektif daripada kualifikasi [8] Kondo T, Ohshima T, Mori R, Guan DW, Ohshima K, Eisenmenger W.
imunohistokimia analisis kualitatif dan semi kuantitatif. Immunohistochemical detection of chemokines in human skin wounds and
Meskipun banyak factor telah diusulkan untuk estimasi usia its application to wound age determination. Int J Legal Med 2002;116:87–
luka [10] , 10 sitokin ditunjukkan dalam penelitian ini akan 91.
berguna untuk praktek forensik. [9] Takamiya M, Fujita S, Saigusa K, Aoki Y. Simultaneous detection of
eight cytokines in human dermal wounds with a multiplex bead-based
Jika memungkinkan, dimasukkannya 7 sitokin lain dalam immunoassay for wound age estimation. Int J Legal Med 2008: 122; 143–
pemeriksaan Inasi juga sangat disarankan. Di samping itu, 148.
metode yang ada seperti yang dijelaskan akan menunjukkan [10] Hernandez-Cueto C, Girela E, Sweet DJ. Advances in the diagnosis of
wound vitality: a review. Am J Forensic Med Pathol 2000;21:21–31.
tidak konkret usia luka, tetapi interval yang konsisten. [11] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
Untuk mengatasi masalah ini, lanjut investigasi dengan binding. Anal Biochem 1976;72:248–54.
[12] Kondo T, Ohshima T. The dynamics of inflammatory cytokines in the
sampel lebih banyak dan klasifikasi terperinci usia, jenis healing process of mouse skin wound: a preliminary study for possible
wound age determination. Int J Legal Med 1996;108:231–6.
kelamin, jenis luka, diperlukan. Sampai saat itu, [13] Dinarello CA. Interleukin-1beta. Crit Care Med 2005;33:S460–2.
[14] Kolls JK, Linden A. Interleukin-17 family members and
kombinasinya metode histologis [2], metode inflammation. Immunity 2004;21:467–76.
[15] Jovanovic DV, Di Battista JA, Martel-Pelletier J, Jolicoeur FC, He Y,
imunohistokimia [4] , dan metode sekarang akan lebih Zhang M, et al. IL-17 stimulates the production and expression of
proinflammatory cytokines, IL-beta and TNF-alpha, by human
disukai dalam praktik forensik. macrophages. J Immunol 1998;160:3513–21.
[16] Katz Y, Nadiv O, Beer Y. Interleukin-17 enhances tumor necrosis
Pengakuan factor alphainduced synthesis of interleukins 1, 6, and 8 in skin and
synovial fibroblasts: a possible role as a ‘‘fine-tuning cytokine” in
Penelitian ini didukung oleh dana bantuan untuk General inflammation processes. Arthritis Rheum 2001;44:2176–84.
[17] Teunissen MB, Koomen CW, de Waal Malefyt R, Wierenga EA, Bos
Scientific Penelitian (YA dan MT; 18590642) dari JD. Interleukin-17 and interferon-gamma synergize in the enhancement of
proinflammatory cytokine production by human keratinocytes. J Invest
kementerian Pendidikan tion, Sains, Olahraga, dan Budaya Dermatol 1998;111:645–9.
Jepang. [18] Fossiez F, Djossou O, Chomarat P, Flores-Romo L, Ait-Yahia
S, Maat C, et al. T cell interleukin-17 induces stromal cells to
produce proinflammatory and hematopoietic cytokines. J Exp Med [21] Yamashiro S, Takeya M, Kuratsu J, Ushio Y, Takahashi K, Yoshimura
1996;183:2593–603. T. Intradermal injection of monocyte chemoattractant protein-1 induces
[19] Jackman SH, Yoak MB, Keerthy S, Beaver BL. Differential emigration and differentiation of
expression of chemokines in a mouse model of wound healing.
Ann Clin Lab Sci 2000;30:201–7.
[20] DiPietro LA, Polverini PJ, Rahbe SM, Kovacs EJ.
Modulation of JE/MCP-1 expression in dermal wound repair. Am
J Pathol 1995;146:868–75.