I.

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan

ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini

ialah irisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda

seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mkron, tapi

dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Metode

parafin ini selain terdapat kelebihan dalam hasil preparat terdapat juga

kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah

patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan

metode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larut

dengan menggunakan metode ini

Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan,

karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan

secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai

elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang

dibuat dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin

adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat

permanen, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan.

Metode paraffin merupakan cara pembuatan preparat permanen dengan

menggunakan paraffin sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang

lebih mencapai 6 µm-8 µm. Metode in imemiliki irisan yang lebih tipis

dibandingkan dengan menggunakan metode beku atau metode seloidin yang

 tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 µm. Prosesnya juga jauh lebih cepat

dibandingkan metode seloidin. Selain itu metode parafin juga memiliki

kejelekan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah, jaringan-

jaringan yang besar menjadi tidak dapat dikerjakan. Berdasarkan uraian di atas,

maka dilakukan praktikum yang berjudul metode parafin hewan.

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada praktikum ini adalah bagaimana cara

pembuatan preparat hewan dengan metode parafin?

C. Tujuan Praktikum

Tujuan yang ingin dicapai dari praktikum ini adalah untuk mengeyahui

cara pembuatan preparat hewan dengan metode parafin.

D. Manfaat Praktikum

Manfaat yang dapat diproleh pada praktikum ini adalah dapat

mengeyahui cara pembuatan preparat hewan dengan metode parafin.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Metode Parafin

Parafin merupakan gabungan dari rantai-rantai lurus alkane CH3-(CH2)-

CH3. Kristalisasi dari rantai CH3 menyebabkan pelepasan panas laten dalam

jumlah yang besar. Panas laten dan titik leleh parafin meningkat dengan

penambahan panjang rantai karbon. Parafin memenuhi syarat sebagai bahan

penyimpan panas laten karena ketersediaannya pada rentang suhu yang

beragam dan mempunyai panas laten yang besar. Metode parafin merupakan

suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di

dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewan maupun

tumbuhan secara tipis. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan metode

ini. Metode parafin banyak digunakan karena hampir semua macam jaringan

dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode paraffin (Lubis, 2017).

Keuntungan menggunakan metode parafin diantaranya Irisan dapat jauh

lebih tipis daripada menggunakan metode beku maupun seloidin, dengan

metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan

yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah. Prosesnya lebih cepat dari

metode lain. Kelemahan dari metode ini adalah jaringan menjadi keras,

mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat

dikerjakan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan

larut dengan metode ini (Sari, 2015).

B. Tahapan Metode Parafin

Langkah-langkah dalam pembuatan preparat parafin ialah testis diambil

segera setelah tikus mati untuk dibuat preparat histologi. Testis selanjutnya

dicuci dengan larutan PBS dan difiksasi dengan Bouin selama 24 jam. Sampel

testis dipotong kecil dan didehidrasi di dalam seri larutan alkohol dengan

konsentrasi bertingkat makin pekat (70% sampai 100%) selama 24 jam.

Sampel selanjutnya dijernihkan dengan xylol selama 6 jam. Setelah proses

penjernihan dilakukan embedding dengan parafin yang telah dicairkan pada 58

– 60 ºC selama 6 jam. Selanjutnya blok parafin dipotong serial pada ketebalan

5 μm dengan menggunakan mikrotom. Potongan tersebut dimasukkan dalam

air hangat dan dipindahkan ke atas slide kaca. Sediaan selanjutnya diwarnai

dengan teknik pewarnaan Hematoxylin-Eosin. Dalam pewarnanaan sediaan

setelah dihilangkan parafinnya dan xylol yang tesisa dihilangkan dengan

menggunakan kertas filter dan berturut-turut dicelupkan beberapa kali ke

dalam alkohol 96%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 30%, akuades, dan

dimasukan dalam Ehrlich’s hematoxylin selama 3-7 detik. Proses selanjutnya

sediaan dicuci dengan air mengalir selama 10 menit. Selanjutnya dicelupkan ke

akuades, alkohol 30%, 50%, 60%, 70% beberapa kali celupan lalu dimasukkan

dalam eosin Y 1-2% dalam alkohol 70% selama 1-2 menit. Setelah itu

dicelupkan ke alkohol 70%, 80%, 90%, 96% beberapa celupan, lalu

dikeringkan di antara kertas filter dan dimasukkan ke dalam xylol selama 10

menit. Selanjutnya sediaan ditetesi dengan entelan dan ditutup dengan cover

glass dan diberi label (Mulyono, 2016).

C. Proses Fiksasi Organ

Fiksasi adalah langkah dasar di balik studi patologi dan sangat penting

untuk mencegah autolisis dan degradasi jaringan serta komponen jaringan

sehingga mereka dapat diamati baik secara anatomis dan mikroskopis. Proses

fiksasi biasanya merupakan tahap pertama dalam pembuatan sediaan

histopatologi. Fiksasi adalah berbagai perlakuan yang dapat melindungi

struktur sel dan komposisi biokimianya.3 Tentu saja kualitas fiksasi adalah

kunci untuk semua tahap selanjutnya yang penting dalam pembuatan sediaan

histopatologik, oleh karena itu pengawetan sel dengan perubahan morfologi

yang minimal dan secara kasat mata tanpa adanya kehilangan molekul sangat

penting dalam pengolahan jaringan. Fiksasi diharapkan dapat melindungi

spesimen biologi dari efek denaturasi dehidrasi dan semua proses pengolahan

jaringan (Musyarifah, 2018).

D. Clearing

Tahapan pembuatan preparat permanen awetan testis diantanya proses

fiksasi, dehidrasi, clearing, infiltrasi parafin. Clearing (penjernihan)

merupakan suatu proses yang bertujuan menjadikan struktur testis terlihat lebih

jelas, jernih, dan transparan saat diamati menggunakan mikroskop. Bahan yang

biasa digunakan dalam proses clearing adalah xylol, toluol, benzol, aceton, dan

minyak cengkeh. Xylol memiliki kelebihan antara lain : dapat diperoleh dengan

mudah karena banyak dijual ditoko bahan kimia, kekurangan xylol antara lain :

harga lebih mahal dari pada toluol, sifatnya mudah terbakar. Toluolmemilki
kelebihan yaitu : sedikit lebih ramah lingkungan karena terbuat dari minyak

bumi mentah yang berasal dari pohon tolu, harganya lebih terjangkau, dan hasil

pembuatan preparat lebih jernih (Lael, 2018).

 III. METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan pada hari Rabu tanggal 27 November 2019 – 9

Desember 2019, Pukul 16.00 WITA – Selesai dan bertempat di Laboratorium

Biologi Unit Zoologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Halu Oleo, Kendari.

B. Bahan Praktikum

Bahan yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 1.

Tabel 1. Bahan dan Kegunaan

No Nama Bahan Kegunaan
1 2 3
1. Ovarium Mencit (Mus Sebagai objek Pengamatan
musculus)
2. Testis Tikus (Rattus novergicus Sebagai objek pengamatan
3. Bensin Untuk membius objek pengamatan
4. Alkohol 70 % Sebagai larutan dehidrasi, hidrasi dan
dealkoholisasi organ
5. Alkohol 80 % Sebagai larutan dehidrasi, hidrasi dan
dealkoholisasi organ
6. Alkohol 90 % Sebagai larutan dehidrasi, hidrasi dan
dealkoholisasi organ
7. Alkohol 96 % Sebagai larutan dehidrasi, hidrasi dan
dealkoholisasi organ
8 Alkohol absolute 1 Sebagai larutan dehidrasi, hidrasi dan
dealkoholisasi organ
9. Alkohol 30 % Sebagai larutan hidrasi dan dehidrasi organ
10. Alkohol 40 % Sebagai larutan hidrasi dan dehidrasi organ
11. Alkohol 50 % Sebagai larutan hidrasi dan dehidrasi organ
12. Alkohol 60 % Sebagai larutan hidrasi dan dehidrasi organ
9. Toluol Sebagai larutan dealkoholisasi
10. Parafin cair Sebagai larutan infiltrasi
11. Parafin padat Sebagai larutan untuk penanaman organ
12. Aquadest Untuk mencuci organ
 Tabel 1. Lanjutan
1 2 3
14. Larutan bouin Sebagai larutan fiksatif
15. Hematoksilin dan Eosin-Y Sebagai larutan pewarna
16. Tissue Untuk membersikan alat
17. Kapas Sebagai medium bensin saat membius hewan
18. Canada balsam Sebagai perekat

C. Alat Praktikum

Alat yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada tabel 2.

Tabel 2. Alat dan Kegunaan

No Nama Alat Kegunaan
1 2 3
1. Toples Sebagai wadah untuk membius objek pengamatan
2. Botol balsam Sebagai tempat perendaman organ
3. Botol rollfilm Sebagai wadah larutan pewarna
4. Botol Gelap Sebagai wadah larutan
5. Pipet tetes Untuk memindahkan larutan
6. Alat bedah Untuk membedah objek pengamatan
7. Cutter/silet Untuk menyayat parafin organ
8. Bakul Sebagai wadah penanaman organ
9. Holder Untuk merekatkan parafin organ
10. Oven Untuk mencairkan parafin
11. Kaca objek Untuk meletakan hasil sayatan organ parafin
12. Kaca Penutup Untuk menutup objek pengamatan
13. Slide warmer Untuk mengeringkan preparat parafin organ
14. Freezer (kulkas) Untuk membekukan parafin organ
15. Mikroskop Untuk mengamati organ parafin hasil sayatan
16. Kamera Untuk mendokumentasikan hasil pengamatan

D. Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada praktikum ini adalah sebagai berikut :

1. Narkose (pembiusan) dengan menggunakan bensin.

2. Membedah tikus dengan mengambil organ testis dan membedah mencit dengan

mengambil organ ovarium.

3. Memasukan organ dalam larutan NaCl 0,9 %

4. Memasukkan organ kedalam botol balsam yang berisi larutan bouin selama 48

jam

5. Mencuci organ dengan alcohol 70 % selama 2 × 45 menit

6. Dehidrasi menggunakan :

 Merendam organ dalam alcohol 70 % selama 1 jam

 Merendam organ dalam alcohol 80 % selama 1 jam

 Merendam organ dalam alcohol 90 % selama 12 jam

 Merendam organ dalam alcohol 96 % selama 1 jam

 Merendam organ dalam alcohol absolute selama 1 jam

7. Melakukan dealkoholisasi dengan merendam organ menggunakan toluol

selama 12 jam

8. Infiltrasi dalam oven dengan suhu 57-600C

 Merendam organ dalam toluol : parafin perbandingan 1:1 selama 45 menit

 Merendam organ dalam toluol : parafin perbandingan 2:4 selama 45 menit

 Merendam organ dalam toluol : parafin perbandingan 3:6 selama 45 menit

9. Tahap embedding (penanaman organ dalam parafin) adalah sebagai berikut :

a. Menyiapakan bakul-bakul untuk tempat penanaman organ

b. Melehkan parafin yang masih berbentuk padat

c. Memasukkan parafin yang telah dilelehkan kedalam bakul hinggah

setengah sampai membentuk substrat bagi organ

d. Memasukkan organ kedalam substrat yang telah terbentuk

e. Tuangkan kembali parafin cair sampai menutupi semua organ

10. Memasukkan parafin organ kedalam freezer agar dapat membeku

11. Menyayat parafin organ yang setipis mungkin, kemudian letakkan diatas kaca

objek

12. Tahap Pewarnaan sebagai berikut :

a. Meneteskan xylol ke kaca objek, selama 15 menit kemudian tarik

menggunakan tissue

b. Hidrasi dengan menggunakan alcohol bertingkat :

 Alcohol absolute selama 1 menit

 Alcohol 96 % selama 1 menit

 Alcohol 90 % selama 1 menit

 Alcohol 80 % selama 1 menit

 Alcohol 70 % selama 1 menit

 Alcohol 60 % selama 1 menit

 Alcohol 50 % selama 1 menit

 Alcohol 40 % selama 1 menit

 Alcohol 30 % selama 1 menit

c. Pewarnaan menggunakan hemaktosilin selama 10 menit

d. Cuci dengan aquades selama 10 menit

e. Meneteskan kembali :

 Alcohol 30 % selama 1 menit

 Alcohol 50 % selama 1 menit

 Alcohol 60 % selama 1 menit

 Alcohol 70 % selama 1 menit

f. Meneteskan Eosyn-Y selama 2 menit

 g. Membilas dengan alcohol bertingkat :

 Alcohol 70 % selama 1 menit

 Alcohol 80 % selama 1 menit

 Alcohol 90 % selama 1 menit

13. Meneteskan xylol ke kaca objek selama 15 menit

14. Mounting dengan menggunakan Canada balsam

15. Keringkan diatas slide warmer dengan suhu 420C selama 2 hari

16. Amati dibawah mikroskop

B. Pembahasan

Praktikum yang telah dilakukan merupakan proses pembuatan preparat organ

hewan dengan menggunakan metode parafin. Metode parafin adalah suatu metode

pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin

untuk menghasilkan preparat tumbuhan yang tipis. Metode parafin biasanya

digunakan untuk membuat preparat histologi. Bahan yang digunakan adalah testis

tikus putih (Ratus norvegicus) dan ovarium mencit (Mus musculus).

Pembuatan preparat organ hewan dengan menggunakan metode parafin

dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan pembedahan pada tikus ataupun

mencit, kemudian diambil organ testis dari tikus dan ovarium dari mencit, setelah

itu organ kemudian difiksasi dalam waktu 48 jam. Tujuan dari fiksasi ini adalah

untuk mengawetkan jaringan sehingga dapat bertahan lama, selain itu juga dengan

proses fiksasi ini akan membuata jaringan dapat lebih mudah teramati. Hal ini

sebagaimana yang diungkapkan oleh Musyarifah (2018) bahwa fiksasi adalah

langkah dasar di balik studi patologi dan sangat penting untuk mencegah autolisis

dan degradasi jaringan serta komponen jaringan sehingga mereka dapat bertahan

lama dan dapat semirip mungkin dengan struktur organ pada saat masih hidup.

Larutan fiksasi yang digunakan adalah larutan FAA. Larutan FAA

merupakan campuran antara etanol, formaldehid dan asam asetat glasial dengan

perbandingan masing-masing adalah 90%, 5% dan 5%. Penggunaan kadar etanol

yang lebih tinggi dalah larutan FAA tersebut karena penetrasi alkohol ke dalam

jaringan dapat berlangsung dengan cepat sehingga pematian dan fiksasi dapat

berjalan dengan cepat, juga merupakan larutan yang stabil dan pengawet yang
baik. Penggunaan formalin juga pada fiksasi ini dikarenakan formalin memiliki

kelebihan dalam proses fiksasi, sebagaimana yang diungkapkan Suprianto (2014)

bahwa formalin telah digunakan sebagai cairan fiksatif rutin dan menjadi gold

standard dalam laboratorium histologi selama beberapa dekade. Formalin

memiliki beberapa kelebihan seperti pH mendekati normal, tidak terbentuknya

pigmen formalin di sediaan serta bisa disimpan dalam waktu yang lama.

Organ yang telah difiksasi kemudian dicuci (Washing) menggunakan

alkohol 70% selama 1 jam. Washing adalah proses pencucian untuk

menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan. Proses washing diusahakan tidak

terdapat molekul-molekul fiksatif yang tertinggal di dalam jaringan. Molekul ini

akan menjadi penghalang untuk proses selanjutnya. Organ kemudian didehidrasi

menggunakan alkohol bertingkat dari alkohol dengan konsentrasi rendah ke

tinggi. Tujuan dari dehidrasi ini adalah untuk menarik molekul air dari dalam

jaringan secara perlahan-lahan sehingga struktur dari jaringan tidak akan rusak

karena bila dehidrasi dilakukan dari konsentrasi tinggi ke rendah maka

dikhawatirkan akan terjadi plasmolisis pada jaringan karena kekurangan air secara

tiba-tiba. Proses dehidrasi ini juga diharapkan organ dapat lebih menyatu dengan

parafin ketika dilakukan penanaman dengan parafin. Hal ini sejalan dengan

penjelasan dari Prahanarendra (2015) bahwa tujuan dari penarikan air adalah

karena air tidak selalu dapat bercampur dengan parafin, sehingga bila masih ada

molekul air yang tertinggal maka parafin tidak akan dapat menembus jaringan

sehingga ketika dipotong, jaringan tidak akan utuh lagi.

 Proses selanjutnya adalah dealkoholisasi. Dealkoholisasi sendiri merupakan

proses penarikan molekul alkohol dari dalam jaringan, karena kandungan alcohol

yang terlalu tinggi didalam jaringan akan sangat mempengaruhi proses

selanjutnya, hal ini sebagaimana diungkapkan oleh Prahanarendra (2015) bahwa

kandungan alkohol yang terlalu tinggi terlebih lagi alkohol absolut akan membuat

jaringan menjadi terlalu keras. Proses dealkoholisasi ini dilakukan dengan

menggunakan larutan alkohol dan xylol dengan perbandingan yang berbeda-beda.

Perbedaan kadar alkohol dan xylol ini selain bertujuan untuk menarik alkohol

secara perlahan-lahan agar jaringan tidak rusak, tetapi sekaligus menjernihkan

jaringan, karena larutan xylol sendiri bersifat menjernihkan jaringan. proses

selanjutnya adalah clearing. proses ini menggunakan larutan xilol murni dimana

larutan ini berfungsi dalam menjernihkan jaringan, hal ini sesuai dengan

pernyataan Lael (2018) bhwa tujuan dari clearing adalah untuk membuat jaringan

jernih dan transparan sehingga lebih muda diamati dibawa mikroskop.

Tahapan selanjutnya adalah infiltrasi. infiltrasi dilakukan dengan

menggunakan xylol dan parafin dengan perbandingan 1 dan 9. infiltrasi

merupakan proses penyelubungan organ menggunakan parafin, dimana bagian-

bagian dari organ yang berlubang atau tidak padat karena proses dehidrasi ataupun

dealkoholisasi akan diisi oleh parafin. Hal ini sejalan dengan pendapata Defianti

(2015) bahwa infiltrasi adalah usaha menyusupkan organ pada media penanaman

(Embedding) dimana dalam proses ini parafin cair akan manyusup langsung ke

dalam jaringan dengan cara parafin akan menggantikan kedudukan dari

dehidran dan bahan penjernih, untuk itulah dalam proses ini masih menggunakan
xilol, karena dengan adanya xilol dengan perbandingan yang jauh lebih kecil

dibanding parafin, maka kandungan xilol yang masih tertingga pada saat proses

dealkoholisasi dan clearing akan tertaring keluar sehingga akan digantikan oleh

parafin.

Tahapan selanjutnya adalah embedding. Proses ini merupakan proses

penanaman organ didalam parafin dengan menggunakan cetakan, sehingga

dengan proses ini akan memudahkan proses penyayatan di mikrotom. Setelah

parafin telah membeku maka langsung dilakukan penyatan setipis mungkin agar

mudah diamati. proses selanjutnya adalah proses pewarnaan dengan terlebih

dahulu melewati beberapa tahapan. Pewarnaan sendiri merupakan proses

pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong sehingga jaringan dapat

dikenali dan memudahkan dalam pengamatan jaringan dengan mikroskop.

Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan hematoksilin eiosin karena

pewarnaan ini dapat digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan

penyambungnya. Hal ini sejalan dengan penjelasan dari Pratiwi (2015) bahwa

pada pulasan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu hematoksilin yang berfungsi

untuk memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik) serta eosin yang

merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk memulas sitoplasma

sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa

yang berbeda. Proses selanjutnya setelah pewarnaan yaitu mounting dengan

menggunakan Canada balsem, sebelum diamati terlebih dahulu organ disimpan

dalam slide warmer selama 48 jam dengan suhu 42˚C. Tujuannya agar parafin
yang masih tersisa karena proses embedding dapat meleleh sehingga organ akan

Nampak jelas bila diamati.

 V. PENUTUP

A. Kesimpulan

kesimpulan pada praktikum ini adalah pembuatan preparat tumbuhan

dengan metode parafin memiliki beberapa tahapan yaitu, fiksasi, washing,

dehidrasi, dealkoholisasi, clearing, infiltrasi, embedding, cutting, pewarnaan,

mounting hingga diamati.

B. Saran

Saran yang dapat saya ajukan pada praktikum ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk laboratorium agar kedepannya praktikum pembuatan preparat

dengan metode parafin dapat dilakukan pada organ hewan yang lain.

2. Untuk asisten pembimbing agar dapat lebih bekerja sama lagi dengan

praktikan.

3. Untuk praktikan agar dapat melaksanakan praktikum lebih baik lagi.

 DAFTAR PUSTAKA

Lael, B.F., Budi, S. dan Tulus, A., 2018, Perbedaan Penggunaan Xylol (Xylene)
dan Toluol (Toluene) pada Proses Clearing terhadap Kualitas Preparat
Awetan Permanen Cimex lectularius, Prosiding Seminar Nasional
Mahasiswa Unimus, Universitas Muhammadiyah Semarang.

Lubis, M.F., 2017, Uji Termofisik Lilin Parafin sebagai Bahan Penyimpan Panas
dan Pemanfaatannya untuk Pemanasan Udara, Skripsi, Institut Pertanian
Bogor, Bandung.

Mulyono, A., Ristiyanto dan Noor, S.H. 2016, Karakteristik Histopatologi Hepar
Tikus Got Rattus norvegicus Infektif Leptospira sp., Jurnal Vektora, 1 (2):
86-87

Musyarifah, Z. dan Salmiah , A., 2018, Proses Fiksasi pada Pemeriksaan

Histopatologik, Jurnal Kesehatan Andalas, 7(3): 444

Sari, P.J., 2015, Studi Awal: Histoteknik, Skripsi, Uin Syarif Hidayatullah,
Jakarta.