LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM

OLEH :
ISABELLA CAROLINE
1141620018
KELOMPOK 8

TEKNIK KIMIA
INSTITUT TEKNOLOGI INDONESIA
2018
 PEWARNAAN GRAM

I. TUJUAN
1. Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram.
2. Mengelompokkan bakteri gram positif atau bakteri gram negative pada
sampel.

II. DASAR TEORI

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang
yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan
spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna
kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat
berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan
struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik
dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat
dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain
dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba
disebut teknik pewarnaan diferensial.
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938)
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan
kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol
sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin
akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram
negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan
secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di
berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah
berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat
mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam),
bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya
memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. Berikut adalah
gambar Pewarnaan gram pada basillus subtilis:

Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram

negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di
dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan
melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli
merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare
lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat
dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta
mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi.
(Mikrolibrary, 2008). Berikut adalah gambar Pewarnaan gram pada E.coli:
III. ALAT DAN BAHAN
 Alat
1. Mikroskop
2. Objek Glass
3. Jarum Inokulasi
4. Busen
5. Penjepit
6. Pipet Tetes

 Bahan
1. Biakan bakteri murni (E. Coli dan Basilus Subtilis)
2. Gram A (Kristal violet)
3. Gram B (Iodium)
4. Gram C (Alkohol)
5. Gram D (Safranin)
6. Air
7. Kertas Hisap

IV. CARA KERJA

Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70%
↓
Ditambahkan 1 tetes aquadest
↓
Kemudian, diambil biakan murni menggunakan ose dan diratakan seulas
1 cm2
↓
Dikeringkan (fiksasi diatas nyala api) dan di angin-anginkan
↓
Celup dalam gram A selama 60 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
 Celup dalam gram B selama 60 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
Celup dalam gram C selama 30 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
Celup dalam gram D selama 30 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
Diamati warna yang terbentuk pada biakan dibawah Mikroskop

V. DATA PENGAMATAN
Dari percobaan yang telah dilakukan, didapatkan hasil :

No. Jenis Bakteri Bentuk Bakteri Warna Gambar

1. Escherichia coli Basil/Batang, Gram
morfologi negatif –
bentuk basil merah
yang muda
memanjang
kurus dan
kecil-kecil.

2. Basilus Subtilis Basil/Batang, Gram

morfologi positif -
bentuk basil ungu
yang
memanjang
kurus dan
kecil-kecil.
VI. PEMBAHASAN

Dalam praktikum pewarnaan gram kali ini memiliki tujuan untuk mengetahui
dan memahami prosedur pewarnaan gram, serta mengelompokkan bakteri gram
positif atau bakteri gram negative pada sampel.
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme atau latar belakangnya.
Sebagaimana fungsi dari mikroskop yakni merupakan alat yang digunakan untuk
melihat jasad renik yang sangat kecil yang tidak dapat dilihat mata dan salah satunya
adalah dalam pengamatan bakteri, kita dapat melakukannya dengan cara pewarnaan
atau pengecatan. Kecuali untuk bakteri tertentu yang jumlahnya sangat terbatas sel
mikroba bersifat tembus cahaya. Sehingga sukar untuk dilihat atau diteliti di bawah
alat pembesaran yang sudah ada. Ini disebabkan karena banyaknya mikroba yang
tidak mempunyai butir warna.
Pengecatan Gram atau pewarnaan gram merupakan salah satu teknik
pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan
identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang
diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram)
dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil
yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap
tinta safranin atau Kristal violet.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun
mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik.
Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan
pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi
untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan
pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini
dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan
biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades
pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca
obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu
banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-
tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan
bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala
api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek
sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga
agar tidak terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene
blue) dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk
mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk
mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan lugol. Gram B
merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat
warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat,
memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada
pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya
persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna methylene
blue akan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit
untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka
pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk
melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari
komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid
sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru karena
mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsi untuk melarutkan lipida pada
membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar
sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue. Perlakuan ini
dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk
melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) dan diamkan
selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna
pada bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada
dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan
warna bakteri berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan
oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin
dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai
pembeda terhadap zat warna kristal violet. Kemudian cuci dengan air mengalir dan
kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau
kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat
sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian
preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di
bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna
biru. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah
 didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum
pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar
permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan
sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram
positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut,
daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak
dapat masuk sehingga sel berwarna biru.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan
membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang
dari sel.
Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan, pewarnaan pada
bakteri Escherichia coli menunjukkan bentuk batang (basil) dengan warna merah
muda, dan tergolong dalam bakteri gram negatif. Warna ini berasal dari pewarna
kristal violet yang bersifat basa dan bermuatan positif yang mudah terikat dengan
bakteri Escherichia coli yang dinding selnya muatannya negatif menghasilkan
pewarnaan pada bakteri yang lebih kontras dibanding sekelilingnya , sehingga
bentuk bakteri lebih mudah diamati.
Pewarnaan pada bakteri Bacillus subtilis menunjukkan bentuk batang (basilus)
dengan warna ungu, dan tergolong dalam bakteri gram positif. Warna ini berasal dari
pewarna kristal violet yang bersifat basa yang bermuatan positif yang mudah
berikatan dengan dinding bakteri Bacillus subtilis bermuatan negatif sehingga
menghasilkan pewarnaan pada bakteri yang lebih kontras dibanding sekelilingnya,
sehingga bentuk bakteri lebih mudah diamati.
Hasil pengamatan tersebut dapat dinyatakan berhasil dan benar, karena
berdasarkan literatur yang ada bakteri Escherichia coli merupakan golongan bakteri
gram negative dan bakteri Bacillus subtilis merupakan golongan bakteri gram positif .

VII. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan
sebagai berikut :
1. Pada pengecatan sederhana, pewarna yang diberikan pada biakan bakteri
yaitu methylen blue dimana Escherichia coli terlihat berbentuk batang (basillus)
dan bakteri Bacillus subtilis juga menunjukkan bentuk batang (basillus).
2. Pada pengecatan gram, bakteri yang termasuk gram negatif adalah
bakteri Eschericia coli karena sewaktu pewarnaan bakteri menunjukkan warna
 merah muda. Sedangkan bakteri yang termasuk gram positif adalah
bakteri Bacillus subtilis, karena dalam dalam pewarnaan bakteri berwarna
ungu .

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Lud Waluyo, 1994, Mikrobiologi Umum, UMM-Press, Jakarta
Lay W. Bibiana, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT RajaGrafindo
Persada, Jakarta
Hadiotomo, Ratna Siri., 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt
Gramedia.
Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
Mucheanna.2013.pewarnaan-gram.
http://mucheanna.blogspot.co.id/2013/10/v-behaviorurldefaultvmlo.html :
diakses pada 25 februari 2018
Rusmaariyani.2013.praktikum-pewarnaan-gram.
http://rusmaariyani.blogspot.co.id/2015/01/laporan-praktikum-
pewarnaan-gram.html : diakses pada 25 februari 2018