2 METODE

Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar Universitas,

IPB University, dari tanggal 20 Agustus hingga 29 Agustus 2019 pukul 11.00-16.00
WIB.
Bahan dan Alat

Alat yang digunakan pada percobaan ini antara lain,sentrifus, micropippete,

tabung eppendorf, corong eppendorf, vaccume dry, microwave, freezer dan set alat
elektroforesis. Bahan yang digunakan adalah kultur E.coli DH5α yang mengandung
plasmid PGEM-TEasy, solution I, solution II, solution III, larutan PCI
(phenol:chlorofom:isopropanol), EtOH 100% etanol 70%, ddH2O, Rnase.

Prosedur Percobaan

Isolasi DNA Plasmid

Kultur bakteri yang digunakan, yaitu Escherichia coli yang mengandung

plasmid PGEM-Teasy. Sebanyak 1.5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf 1.5 ml. Kemudian dipisahkan antara media dengan kultur bakteri dengan
sentrifugasi 10000 rpm, 4°C selama 10 menit. Selanjutnya kultur bakteri yang
terdapat pada pelet disuspensikan ke dalam 100 µl solution buffer I/buffer suspensi
(Tris HCl pH 7.5 + EDTA) dan dihomogenkan dengan vortex. Kemudian
ditambahkan 200 µl solution buffer II/buffer lisis (0.2M NaOH, 1% SDS).
Suspensi dihomogenkan dengan membolak-balik tabung secara perlahan
kurang lebih 10 kali dan didiamkan selama 5 menit dalam es. Selanjutnya
ditambahkan solution buffer III/buffer netralisasi (1.32 M Na-asetat pH 4.8)
ditambahkan sebanyak 150 µl dan diamkan selama 10 menit dalam es. Kemudian
dihomogenkan lagi dengan membolak-balik tabung. Setelah itu, disentrifugasi
10000 rpm, 20°C selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh kurang lebih 350 µl
dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambahkan dengan PCI (Phenol-
chloroform-isoamylalkohol) sebanyak 1x volume supernatan yang diambil.
Selanjutnya disentrifugasi 10000 rpm, 20°C selama 10 menit. Fase atas yang
mengandung DNA plasmid ditambahkan EtOH 100% sebanyak 1000 µl dan
dibolak-balik perlahan.
Presipitasi DNA plasmid disimpan pada freezer semalaman, kemudian
disentrifugasi 10000 rpm, 4°C selama 25 menit. Selanjutnya pelet yang diperoleh
ditambahkan 500 µl EtOH 70% dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10000
rpm, 4°C selama 5 menit. Pelet DNA plasmid kemudian dikeringkan dalam oven
60°C selama 20-25 menit. Kemudian ditambahkan 15-20 µl dH2O dan RNAse
sebanyak 0.2 x volume (1 mg/mL). Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C selama
10 menit. DNA plasmid yang berhasil diisolasi dianalisis kemurnian dan
konsentrasinya dengan elektroforesis dan spektrofotometer.
Pembuatan Agarose

Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan 0.35 gram agarose ke dalam

buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8.3 40 mM, asam asetat pekat 1.98 mM, EDTA 1
mM), dipanaskan pada microwave 100oC hingga jernih selama 1 sampai 2 menit.
Setelah suhu gel agarose tidak terlalu panas, gel dicetak dengan menggunakan gel
tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran. Setelah gel
mengeras, sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electroforesis chamber
yang sudah diisi dengan buffer TAE.

Elektroforesis DNA Plasmid

Sebanyak 5 µl DNA plasmid dicampur dengan 1 µl larutan loading dye.

Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker λ) dipipet
sebanyak 6 µl kedalam masing-masing sumur pada gel agarosa. Selanjutnya
running dengan tegangan 100 volt selama 28 menit (DNA bergerak dari muatan
negatif ke positif). Setelah itu gel direndam dalam larutan ETBR (Etidium
Bromide) selama 10 menit. Setelah itu, dibilas dengan akuades. Gel hasil
elektroforesis diamati dibawah GelDoc/Transluminator. Jumlah DNA plasmid
dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang
dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda (marka λ). Bentuk DNA plasmid
ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel.

Kuantifikasi DNA Plasmid dengan Spektrofotometer

Suspensi DNA plasmid yang diperoleh, sebanyak 3 µl ditambahkan dengan

697 µl ddH2O. Suspensi DNA plasmid kemudian dibaca absorbansinya pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang
260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 µg/ml. Kemurnian
DNA diketahui melalui nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai
absorbansi 280 nm, DNA dikatakan murni apabila tingkat kemurniannya berada
diantara 1.8 – 2.0.
g
Konsentrasi DNA =Abs. λ 260×50 µg/mL ×faktor pengenceran
ml
Abs.λ 260
Kemurnian DNA=
Abs.λ 280