ABSTRACT

Ciclodextrina glucanotransferasa del bacalus sp. El G-825-6 convierte el almidón

principalmente en ciclodextrina (CD8). Se utilizó una combinación de PCR propensa a
errores y barajado de ADN para obtener variantes de esta enzima con una mayor
especificidad del producto para CD8 y un amplio rango de actividad de pH. La variante S54
con siete sustituciones de aminoácidos mostró un aumento de 1,2 veces en la actividad de
síntesis de CD8 y la relación de producto de CD7: CD8 se cambió a 1: 7 en comparación
con 1: 3 de la enzima de tipo salvaje. Se realizaron nueve sustituciones de aminoácidos de
la ciclodextrina glucanotransferasa para generar la variante S35 activa en un rango de pH
de 4.0-10.0. En comparación con la enzima de tipo salvaje que está inactiva por debajo de
pH 6.0, S35 retuvo el 70% de su actividad de síntesis de CD8 a pH 4.0.
Ciclodextrina glucanotransferasa del bacalus sp. El G-825-6 convierte el almidón
principalmente en ciclodextrina (CD8). Se utilizó una combinación de PCR propensa a
errores y barajado de ADN para obtener variantes de esta enzima con una mayor
especificidad del producto para CD8 y un amplio rango de actividad de pH. La variante S54
con siete sustituciones de aminoácidos mostró un aumento de 1,2 veces en la actividad de
síntesis de CD8 y la relación de producto de CD7: CD8 se cambió a 1: 7 en comparación
con 1: 3 de la enzima de tipo salvaje. Se realizaron nueve sustituciones de aminoácidos de
la ciclodextrina glucanotransferasa para generar la variante S35 activa en un rango de pH
de 4.0-10.0. En comparación con la enzima de tipo salvaje que está inactiva por debajo de
pH 6.0, S35 retuvo el 70% de su actividad de síntesis de CD8 a pH 4.0.

INTRODUCCIÓN

Las ciclodextrinas (CD) son moléculas cíclicas compuestas por 6 + n a-1,4 residuos de
glucosa enlazados. CD6, CD7 y CD8, que consisten en 6, 7 y 8 residuos de glucosa, se
producen comercialmente y también se designan como a-CD, b-CD y c-CD [1]. La cavidad
hidrófoba de CD permite la formación de complejos de inclusión con moléculas huésped
con varias aplicaciones, p. en la industria alimentaria [2] y farmacéutica [2–5]. Los CD se
sintetizan mediante ciclodextrina glucanotransferasas (CGTases, EC 2.4.1.19) a partir de
almidón [6]. Se han clasificado como a-CGTase, b-CGTase y c-CGTase de acuerdo con el
producto principal de CD formado. Sin embargo, todos los CGTases conocidos producen
una mezcla de CD de diferentes tamaños que requieren pasos de separación costosos y
que requieren mucho tiempo para obtener un solo CD de un tamaño específico requerido
para muchas aplicaciones [7]. Por lo tanto, las CGTases que forman CD de un solo tamaño
son deseables para los procesos industriales de producción de CD.

Una comparación de la temperatura y el pH óptimo de varias CGTases ha indicado que la

mayoría de las a-CGTases mostraron su mayor actividad en condiciones de pH bajo y a
temperaturas más altas [8,9], mientras que las b-CGTases mostraron su actividad óptima
de baja a neutral pH en un amplio rango de temperatura [10–13]. Por el contrario, las c-
CGTasas, frecuentemente detectadas en bacterias alcalifílicas, fueron principalmente
activas en condiciones de pH alto. Las CGTases monoméricas están compuestas por cinco
dominios (A a E) [19]. El dominio A forma una estructura de 8 barriles (b / a). El dominio B
consiste en un bucle entre la hoja B 3 y la hélice 3 del dominio A. Cerca del centro activo,
se han identificado sitios de unión a carbohidratos secundarios (subsitios) [19,20]. El sitio
catalítico y los subsitios están ubicados dentro de los dominios A / B. Los dominios C y E
contienen sitios de unión al almidón, mientras que la función del dominio D no se ha
dilucidado completamente [21,22]. La tríada catalítica que consta de dos Asp y un residuo
de Glu se localiza en el dominio A y está altamente conservada en todas las a-amilasas. El
centro catalítico forma un surco profundo para permitir una interacción con sustratos de
oligo y polisacáridos.

La ingeniería de proteínas de CGTases se ha realizado previamente para mejorar su

especificidad de sustrato y producto, así como su termoestabilidad [23]. Por mutagénesis
dirigida al sitio, la especificidad del producto de a- [24-26], b- [27,28] y c-CGTases [29-31]
se ha mejorado con éxito. El reemplazo de los aminoácidos en el subsitio 3 [25,27,31], 6
[24] y 7 [26] dio como resultado cambios en el espectro del producto de CD y la actividad
enzimática. Por mutagénesis dirigida al sitio, se ha obtenido una variante de CGTasa con
termoestabilidad mejorada mediante la introducción de un puente salino adicional [32].
Sin embargo, aún no se ha informado de una mejora en el rango de actividad del pH de las
CGTases mediante ingeniería de proteínas.
En este estudio, se describe la modificación del rango de actividad del pH y la especificidad
del producto de una cCGTasa utilizando una estrategia de mutagénesis aleatoria por
etapas.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

2.1. Mutagénesis y cribado de variantes aleatorias de cgtS

Mediante rondas repetidas de mutaciones de baja frecuencia (dos PCR propensas a
errores seguidas de barajado de ADN) con selección repetida, se pudieron identificar
variantes de CGTasa con mayor actividad de sintetización de CD8 en comparación con la
enzima de tipo salvaje. Usando condiciones altamente mutagénicas, solo se obtuvieron
variantes no funcionales. Las mutaciones creadas se distribuyeron uniformemente dentro
de la secuencia de la CGTasa (Fig. 1A, Tabla 1). Por etapas, la mutagénesis aleatoria del
gen cgtS, se obtuvieron 15.000 clones y posteriormente se examinó la actividad
sintetizadora de CD8 en placas de agar congeladas que contenían 1% de almidón soluble.
Congored es un colorante diazo secundario soluble en agua y de color rojo a pH 5.2 y
superior. En presencia de c-CGTasa, CD8 se produce por la conversión de almidón. El tinte
forma un complejo con CD8 y se vuelve incoloro, dando como resultado un halo alrededor
de la colonia en la placa [33]. El ensayo es altamente selectivo para CD8, ya que no se
formaron halos con CD6, CD7, CD9, CD10 o una mezcla de CD de anillo grande (CD22-
CDn). Se detectaron más de 50 clones productores de halo, 21 de ellos con las áreas de
halo más grandes se usaron para un análisis adicional de su actividad y especificidad de
síntesis de CD8.

2.2. Rango de actividad del pH de las variantes de CGTasa.

Si bien la actividad de síntesis de CD8 de la c-CGTasa de tipo salvaje se detectó entre pH
6,8 y 9,5, cinco de las 21 variantes barajadas analizadas (S32, S33, S35, S80 y S84)
mostraron actividad en un rango de pH más amplio (Fig.2 ). Las variantes S80 y S35
(activas entre pH 4.0 y 9.5) retuvieron el 14% y el 70% de su actividad de síntesis de CD8 a
pH 4.0, respectivamente. Las variantes S32 (activas entre pH 6,8 y 11,25) y S84 retuvieron
el 34% y el 10% de su actividad a pH 11,25, respectivamente. La variante S33 retuvo
incluso el 65% de su actividad a pH 5,8. Por mutagénesis aleatoria por etapas, se podría
crear una c-CGTasa con actividad de síntesis de CD8 a bajo pH como una propiedad
novedosa e inusual de la enzima. Para una producción industrial de CD a partir de almidón
pretratado con una a-amilasa a un pH de 6,0 a 6,5, una etapa de ajuste de pH podría
eliminarse mediante el empleo de una CGTasa activa en este rango de pH.
Los residuos de aminoácidos D245, E273 y D343 (B. sp. G825-6 numeración CGTasa)
forman la tríada catalítica de la CGTasa [1]. Los residuos E273 y D245 están implicados en
la escisión inicial del sustrato glucooleigosacárido con enlaces a-1,4 [34,35]. En el primer
paso de la reacción de síntesis de CD, E273 protona el oxígeno del enlace glicosídico del
sustrato para formar un intermedio [36]. El estado protonado de E273 está formado por
un enlace de hidrógeno con D245 [37]. Tras la unión del sustrato, el enlace de hidrógeno
se abre y E273 se desprotona. En el segundo paso de la reacción, el grupo hidroxilo de
E273 se activa por la desprotonación de una molécula aceptora. D343 realiza un ataque
nucleófilo en el átomo de C1 anomérico de la molécula donante [38]. Como se mostró
anteriormente para la CGTasa de Thermoanaerobacterium thermosulfurigenesis EM1
[27], se puede esperar que las mutaciones cerca de estos residuos catalíticos afecten el
rango de actividad del pH de la enzima. La variante S32 mostró un aumento de la actividad
de síntesis de CD8 en el alto rango de pH, reteniendo más del 30% de su actividad a pH
11.0. La sustitución F158L de S32 está ubicada cerca del sitio activo en una región
altamente conservada entre los dominios A1-B y en el vecindario directo a D245. Las
CGTases de Bacillus agaradhaerens y Bacillus sp. BL31 CGTase también tiene un residuo
Leu en esta posición
La variante S35 mostró una alta actividad en el rango de pH bajo hasta pH 4.0. Todas las
nueve sustituciones de aminoácidos de S35 se ubicaron distantes del sitio activo. K39
también se encuentra en varias b-CGTases, p. Bacillus sp. G1 [39] y Brevibacillus brevis
CD162 [40]. Ambos b-CGTases son estables en un rango de pH 6.0 y 5.5 a pH 9.0 y 10.0,
respectivamente. Las sustituciones T66S y L71P están ubicadas en regiones de bobina
aleatorias a solo 13 Å de distancia del sitio activo. Varios CGTases tienen Ala, Asp, Glu, Gly,
Asn, Pro, Gln y Ser en la posición 66. El residuo L71 se conserva en casi todos [14,27,31,39-
57] con la excepción de la CGTase de Paenibacillus sp. P22 [51] mostrando un Lys en esta
posición. L71P está ubicado a 15 Å de distancia del sitio activo y en vecindad directa a T72,
un residuo que forma parte del subsitio 3
El residuo I101 se conserva en todas las 30 CGTases examinadas para comparación [40].
En la variante S35, la sustitución I101L es con una distancia de solo 11–14 Å ubicada muy
cerca del sitio activo. Las sustituciones S461G y E472G están ubicadas en el dominio C,
mientras que V605A, N606K y R648H están en el dominio E y, por lo tanto, mucho más
lejos del sitio activo. Sin embargo, estas sustituciones también contribuyeron obviamente
a los cambios observados en la actividad del pH de la CGTasa (Fig. 2). La importancia de
estos residuos que influyen en la actividad del pH de una CGTasa no se ha informado
previamente y sigue sin dilucidarse. Los efectos de los intercambios de aminoácidos en la
actividad del pH se observaron tanto en condiciones bajas (dos sustituciones de
aminoácidos) como en condiciones mutagénicas medias (nueve sustituciones). Un cambio
en el rango de actividad del pH de una a-amilasa por experimentos de mutagénesis se ha
informado previamente [56]. De una biblioteca de mutagénesis aleatoria propensa a
errores que contiene 7200 clones, se pudieron identificar dos variantes que muestran esta
característica. Las mutaciones se posicionaron tanto en residuos conservados como no
conservados, lo que respalda nuestros resultados de que el rango de actividad del pH de la
CGTasa está determinado por los aminoácidos ubicados en diferentes ubicaciones en la
enzima. Por mutagénesis dirigida al sitio en cinco posiciones basadas en comparaciones de
secuencias de celulasas con diferentes pH óptimos, la actividad del pH de una
celobiohidrolasa del hongo filamentoso Trichoderma reesei podría cambiar al rango de pH
alcalino [58]. Al utilizar la combinación aleatoria de ADN y las mutaciones combinatorias
en diferentes posiciones de aminoácidos, la actividad del pH de una luciferasa de Photinus
pyralis y de una xilanasa de Themobifida fusca [59] también podría manipularse con éxito.
Estos resultados respaldan aún más la validez de nuestro enfoque para emplear la
combinación aleatoria de ADN y la PCR propensa a errores como métodos adecuados para
cambiar el rango de actividad del pH de las CGTasas u otras enzimas sin información
estructural detallada sobre la enzima.

2.3. Especificidad del producto de las variantes CGTase.

Se determinó la relación de CD7: CD8 sintetizada por las variantes de c-CGTasa. Mientras
que la CGTasa de tipo salvaje sintetizó CD7 y CD8 en una proporción de 1: 3 sin la
formación de CD6, varias de las variantes mostraron cambios drásticos en las relaciones
de los dos productos de CD (Tabla 1). La sustitución de Ser por Gly en la posición 184 en la
variante S80 provocó un cambio en la relación CD7: CD8 de 1: 3 a 1: 2. Sin embargo, en
comparación con la enzima de tipo salvaje, los rendimientos totales obtenidos con estas
variantes fueron menores. Las variantes S42, S44 y S54 también mostraron un cambio en
la relación del producto de CD hacia CD8 con aproximadamente 80% de CD8 y 20% de CD7
producido concomitante con un aumento de 1.2 a 1.3 veces en la actividad de
sintetización de CD8. La variante S77 mostró con 91% la mayor especificidad de producto
para CD8, sin embargo, con una actividad de sintetización de CD8 muy reducida de
aproximadamente 4% en comparación con la CGTasa de tipo salvaje. Se ha informado
previamente que las mutaciones que afectan la especificidad del producto para CD8
producen una disminución de las actividades enzimáticas [1–3,59]. En este estudio, S42,
S44 y S54 mostraron tanto un aumento en la especificidad del producto como mostró
tanto un aumento en la especificidad del producto como en la actividad de sintetización
de CD8. Estas tres variantes comparten las sustituciones N187D, A248V y V252E. Las otras
30 variantes tenían Thr, Gln, Pro, Ser, Arg, Ala en la posición 187, pero no Asp. A248V y
V252E están ubicados en una región de bucle altamente conservada que forma parte del
subsitio aceptor +1 y +2. Los residuos catalíticos D245 y E273 también se encuentran en
esta región (Fig. 1B) [37]. El residuo A248 se ha encontrado predominantemente en c-
CGTases, mientras que otras CGTases tienen un Lys en esta posición. Las mutaciones
A248V y V252E están cerca del sitio catalítico y están más probablemente involucradas en
el aumento detectado en la actividad de sintetización de CD8 y en la especificidad del
producto de CD8 [40] de las tres variantes. La sustitución con valina como otro
aminoácido apolar en la posición 248 podría ser una modificación significativa que
contribuya al aumento de la actividad detectada, ya que se encuentra al lado de H249, un
residuo que desempeña un papel importante en la actividad de ciclación [60]. Los cambios
debidos a la introducción de V248 pueden haber influido en la conformación de H249 de
una manera que aumentó la actividad de sintetización de CD8. El grupo propilo más
hidrófobo de Val también puede haber contribuido a este efecto debido a una mejor
exclusión de agua del sitio activo. Esto podría dar como resultado un aumento en los
rendimientos de CD8 ya que menos moléculas de agua podrían actuar como aceptadores
de los intermedios de sustrato unidos covalentemente en una reacción de hidrólisis de la
CGTasa. Además, Val puede tener una influencia positiva en la conformación del
intermedio del sustrato al funcionar indirectamente como una barrera estérica que ayuda
al extremo no reductor del intermedio del sustrato a unirse en la posición +1 del subsitio
receptor [37,61]. Se realizó una mutación de saturación de sitio en esta posición con la c-
CGTasa de Bacillus clarkii 7364 [28]. Los cambios no incluyeron sustituciones con
aminoácidos apolares como Val. El reemplazo de Ala por Arg o Lys en esta posición resultó
en una mayor especificidad del producto para CD8 sin reducir la actividad de síntesis de la
enzima [28]. Por el contrario, la actividad sintetizadora de la CGTasa de
Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 disminuyó cuando se introdujo la
correspondiente sustitución [62]. La sustitución A246V (correspondiente a la numeración
en la CGTasa G825-6) en la CGTasa de Bacillus circulans 251 produjo una disminución de la
ciclación y un aumento de las actividades de hidrólisis de la enzima [61]. Se encontró que
el Ala en esta posición se conservaba en todas las CGTases comparadas
La posición del aminoácido 225 no está altamente conservada en CGTases. Las variantes
S63 S64, S69 y S77 mostraron una disminución de la actividad de síntesis de CD8. Todos
llevaban las sustituciones E145K, R225C y S461G. Si bien E145 es típico de c-CGTases [40],
otros CGTases también tienen Ala, Asp, Asn, Ser y Thr en esta posición. En lugar de un Arg
en la posición 225 Ala, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr y Val pero no Cys se encuentran en
diferentes CGTases en esta posición. S461G es una sustitución que también se produce en
muchas CGTases, incluida la c-CGTase de B. clarkii [40]. Por lo tanto, es poco probable que
la mutación S461G produzca un efecto negativo en la actividad de síntesis de CD8. Por lo
tanto, es probable que E145K y R225C, localizados en a-hélices alejadas del sitio activo,
sean responsables de la disminución en la actividad de síntesis de CD8 detectada de estas
variantes.
Otras mutaciones que afectan al subsitio 3 son G114D, F116L y D388E encontradas en la
variante S45 [63]. El subsitio 3 está formado por residuos de aminoácidos ubicados en
cuatro bucles dentro de la región de la bobina aleatoria de la proteína. Uno de estos
bucles está formado por 112-HPGGFAS-118, una secuencia que se encuentra típicamente
en c-CGTases. D386 se encuentra en un bucle adicional y también es parte del subsitio 3.
La mutación D388E puede haber afectado a D386 junto con G114D y F116L dando como
resultado una variante con una actividad de sintetización de CD8 reducida en un 78%. Se
ha demostrado que el subsitio 3 contribuye a la especificidad del producto de CD en
CGTases [2,3]. La relación de producto CD7: CD8 de S45 se desplazó ligeramente hacia
CD7 con una relación de 1: 1.
La sustitución N194D en S42, ubicada directamente en frente del subsitio 6, no afectó la
actividad de síntesis de CD8, pero puede haber desempeñado un papel en el aumento
detectado de la especificidad del producto para CD8. Otras CGTases tienen Asn o Tyr en
esta posición, mientras que Phe se encontró en esta posición en la a-CGTase de
Anaerobranca gottschalkii [40].
El residuo Y174 también se conserva en CGTases [40]. Mientras que la sustitución con His
en S34 no afectó la actividad de síntesis de CD8, su relación de producto CD7: CD8 se
desplazó hacia CD7 en 1: 1. Esta variante también llevó la sustitución D151N. Muchos
CGTases tienen un Gly en esta posición, mientras que Asp se encuentra en la mayoría de
los c-CGTases. En contraste, la a-CGTasa de B. macerans [51] y la cCGTasa de Bacillus sp.
1011 [48] tienen a Asn en esta posición. Además, D151 N está ubicado lejos de las
estructuras del subsitio y, por lo tanto, es poco probable que esté involucrado en influir en
la especificidad del producto de la enzima para CD8.

CONCLUSIONES
Las variantes de CGTasa se obtuvieron mediante mutagénesis aleatoria con intercambios
de aminoácidos en subsitios cercanos y alejados del sitio catalítico. Las variantes
mostraron una mayor especificidad de producto CD8 y una
rango de actividad de pH cambiado. Los CGTases que producen CD8 como el producto
principal y que muestran actividad en el rango de pH bajo son biocatólogos útiles para la
producción industrial de CD más grandes a costos competitivos.

MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Cepas y plásmidos bacterianos.

Se usaron Escherichia coli BL21 (DE3) y pET-20b (+) para la expresión de proteínas
recombinantes de la CGTasa de tipo salvaje. E. coli One Shot Top 10 (Invitrogen) y el
vector pBADTOPO se usaron para la producción de proteínas CGTasa mutantes.

4.2. Amplificación y clonación de cgtS.

El gen cgtS de la c-CGTasa de Bacillus sp. G-825-6 [14] fue sintetizado y codón optimizado
para E. coli y Bacillus subtilis por Geneart (Regensburg, Alemania). La reacción en cadena
de la polimerasa estándar (PCR) se realizó con la ADN polimerasa DreamTaqTM (Fa.
Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Utilizando el programa del ciclo: {pre-
desnaturalización} 5 min a 95 ° C, 29 (45 s a 95 ° C , 30 s a 61 ° C y 90 s a 72 ° C) y
{extensión final} 72 ° C durante 5 min. El gen cgtS se amplificó con el par de cebadores fw-
primer 50-TTGATA TCATGATTCGCCGCCTGAGC-30 y rev-primer 50 -TTGAGCTCGACT
GGTTATAATTCACTTCCACAATGC-30 (Metabion, Martinsried, Alemania). Los sitios de
restricción EcoRV y SacI (subrayados) se agregaron al extremo 50 del cebador,
respectivamente. El codón de parada del gen se eliminó con el cebador inverso y el
fragmento de PCR se clonó en el vector de expresión pET20b (+) (Novagen, Darmstadt,
Alemania) utilizando los sitios de restricción EcoRV y SacI. El marco de lectura abierto
resultante consistía en una secuencia de codificación de 50 pelB, el fragmento cgtS-EcoRV
/ SacI y una secuencia de codificación de la etiqueta 30 His6. La construcción se clonó en
células azules de E. coli XL-1. La secuenciación del ADN confirmó la correcta construcción
del pET20b (+): cgtS y se realizó por GATC Biotech (Konstanz, Alemania). El vector pET20b
(+): cgtS se clonó luego en la cepa de expresión E. coli BL21 (DE3).

4.3. Mutagénesis aleatoria paso a paso

Dos pasos de mutagénesis se realizaron por PCR propensa a errores. La mutagénesis
aleatoria se realizó de acuerdo con el manual del proveedor utilizando un kit de
mutagénesis aleatoria Diversify PCR (Fa. Clontech, Mountain View, EE. UU.). Se utilizaron
tasas de mutación de 2,7 mutaciones / kb y 3,5 mutaciones / kb. Para un tercer paso, se
realizó un procedimiento de barajado de ADN. Se seleccionó el ADN de la plantilla de la
segunda PCR propensa a errores con una identidad del 98-99% y se digirió con DNaseI (1 U
/ ll, sin ARNasa, Thermo Scientific, Waltham, MA USA) en fragmentos de 200–500 bp. Los
fragmentos purificados en gel de agarosa sirvieron como plantilla en una PCR de mezcla
sin cebador con las siguientes condiciones: desnaturalización durante 90 s a 95 ° C,
recocido heterólogo (45 ) durante 30 s a 95 ° C, 90 s a 65 ° C, 90s a 62 ° C, 90s a 59 ° C, 90s
a 56 ° C, 90 s a 53 ° C, 90s a 50 ° C, 90s a 47 ° C, 90s a 44 ° C, 90s a 41 ° C ° C, 90 s a 72 ° C y
alargamiento terminal durante 420 s a 72 ° C. El producto amplificado se usó directamente
en una segunda PCR con la adición de cebadores inversos y de avance específicos. El
marco de lectura abierto completo y las regiones flanqueantes fueron secuenciados por
GATC Biotech (Konstanz, Alemania).

4.4. Producción recombinante y purificación de la c-CGTasa y sus variantes.

El cultivo por lotes de E. coli recombinante se realizó en 3 l de medio Luria-Bertani (medio
LB, DSM 381) suplementado con 100 lg / ml de ampicilina a 37 ° C. La producción de
proteínas recombinantes se indujo a una densidad óptica de 1 (600 nm) al agregar
isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Las células
se recolectaron por centrifugación (4 ° C, 10.000 g, 10 min), se resuspendieron en tampón
acetato de sodio / citrato / borato 100 mM (pH 8.5) y se rompieron por sonicación en
hielo en 3 ciclos en 1 min, 120 W. 50% de pulso y 50% de potencia (homogeneizador
ultrasónico Sonoplus equipado con un cabezal ultrasónico UW 2200 KE76, Bandelin,
Berlín, Alemania). La c-CGTasa en la fracción de extracto crudo soluble se purificó
mediante cromatografía de afinidad con 1 ml de columnas de crudo His TrapTM FF (GE
Healthcare, Munich, Alemania). Los resultados de la purificación se analizaron mediante
electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida [64] después de la
determinación de la concentración de proteína

4.5. Determinación de la actividad hidrolizante del almidón.

La hidrólisis del almidón por las enzimas se determinó como se describió anteriormente
con almidón soluble al 1% (p / v) a pH 9.5 y 50 ° C [66]. Una unidad de actividad se definió
como la cantidad de enzima que hidroliza 1 mg de almidón por 10 min.
4.6. Determinación de la actividad sintetizadora de CD8 y relaciones CD7: CD8
Los clones obtenidos de los experimentos de mutagénesis aleatoria se seleccionaron para
la síntesis de CD8 en placas de agar que contenían 10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto
de levadura, 10 g / l de almidón soluble, 5 g / l de NaCl, 0,1 g / l de colorante combinado. y
0,01 g / l de xilencyanol (pH 7,0) [33]. Los clones positivos mostraron halos claros
alrededor del área de crecimiento.
Los productos de CD sintetizados enzimáticamente se analizaron mediante cromatografía
de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada. El
almidón soluble (1%, 500 ml) en tampón fosfato 50 mM con un pH de 2,5 a 13,3 se incubó
con c-CGTasa purificada (40 lg / ml) durante 4 horas a 50ºC. La reacción se detuvo
calentando a 100ºC y la solución se ajustó a pH 6,0. Se añadió glucoamilasa (250 mU / ml)
(Sorachim, Lausanne, Suiza) y la solución se incubó durante 16 horas a 60 ° C para
convertir los oligosacáridos lineales y el almidón restante en glucosa. Se utilizó un sistema
ICS-3000 (Dionex, Sunnyvale, EE. UU.) Equipado con una columna CarboPac-PA100 (4
250 mm). El tampón de eluyente (A) contenía NaOH 150 mM y el tampón de gradiente (B)
NaOH 150 mM y nitrato de sodio 200 mM. Se utilizó el siguiente programa: equilibrio con
100% de A durante 10 min (1 ml / min), inyección a 1,7 min, gradiente I (0 a 12 min) A de
96% / 4% B, gradiente II (12– 30 min) 88% A / 12% B, gradiente III (30–31 min) 53% A /
47% B y gradiente IV (31–32 min) 100% B. Las cantidades de CD7 y CD8 sintetizadas se
calcularon utilizando la calibración Curvas (0,1–25 lg / ml CD) preparadas con los
estándares CD7 y CD8 (Wacker-Chemie GmbH, Burghausen, Alemania). A partir de las
áreas de pico obtenidas, las concentraciones de CD7 y CD8 se calcularon en base a tres
experimentos independientes. Cada determinación se realizó por duplicado. La actividad
de síntesis de CD8 de la c-CGTasa de tipo salvaje fue de 6,1 ± 0,45 nmol / min y su relación
CD7: CD8 fue de 1: 3

4.7. Alineamientos de secuencias de aminoácidos y modelado de estructura de

proteínas
La secuencia de aminoácidos de la c-CGTasa G835-6 de tipo salvaje se comparó con otras
30 secuencias de CGTase. Las secuencias con los números de acceso WP_003323850.1,
CAA01436.1, BAH14968.1, AAP31242.1, ABN14270.1, CAH61550.1, AEL33336.1,
WP_022587620.1, AGT45478, P31746.1, P27036.2, O30565. 1, AEO89319.1, AAV38118.2,
ADY17981.1, BAA02380.1, AAV38117.1, AAD00555.1, P26827.2, P14014.1, AAC04359.1,
AGR66230.1, P42279.1, Paenibacillus sp. La secuencia T16, ETT36448.1, X66106.1,
WP_021879762.1, WP_007544393.1, P05618.1, CAO05752.1, M19880.1 se obtuvieron del
servidor NCBI. La alineación se realizó con MEGA 5.1 [67] y el algoritmo CLUSTALW con la
configuración predeterminada (Tabla S1). Los modelos de la c-CGTase G825–6 y sus
variantes se generaron utilizando SWISS-MODEL [68] con el archivo de base de datos de
proteínas 1cygA (estructura de rayos X de Geobacillus stearothermophilus CGTase en
resolución de 2,5 Å) como la estructura de la plantilla. Para la visualización de las
estructuras, se utilizó el sistema de gráficos moleculares PyMol (v0.99, Schrödinger, LCC).
Las moléculas de sustrato superpuestas se obtuvieron del archivo de base de datos de
proteínas 1cxkA (estructura de rayos X de la cepa 251 CGT de B. circulans a una resolución
de 2,5 Å)