Anda di halaman 1dari 4

Uji Serologis dengan Western Blotting dan Enzyme Immunoserbant Assay

(ELISA)
Western Blotting dan ELISA merupakan beberapa contoh metode uji
serologis yang umum dan sering dilakukan di PSSP IPB. Pengujian dilakukan
terhadap sampel, baik yang diambil oleh pihak PSSP sendiri ataupun sampel
penelitian dan sampel rujukan. Sampel yang diuji berasal dari berbagai jenis hewan
dan bahan lainnya. Pengujian sampel dilakukan dengan benar sesuai protokol dan
prosedur pengerjaan.
Metode pengujian serologis western blotting merupakan teknik umum dan
masih dilakukan hingga sekarang di PSSP. Teknik ini merupakan teknik untuk
mendeteksi dan menganalisis keberadaan protein tertentu. sampel uji dapat berupa
jaringan. sel, cairan biologis (darah, saliva), dan lain sebagainya. Secara garis besar
alur kerja metode uji ini sama di seluruh laboratorium. Alur kerja western blotting
dimulai dari preparasi sampel, gel elektroforesis, tranfer protein pada membrane
nitroselulosa, antibody probing, deteksi protein, imaging, dan analisis hasil uji.
Prinsip umum dari metode ini adalah adanya ikatan antibodi spesifik pada
protein yang diujikan. Apabila tidak ada ikatan antibodi dengan protein maka pada
salah satu proses antibodi tersebut akan terbuang, sehingga hanya meninggalkan
antibodi yang berikatan saja, Antibodi yang berikatan inilah yang nantinya
dideteksi dan dianalisis. Di berbagai bidang penelitian, teknik ini digunakan selain
untuk deteksi protein, juga untuk meihat ekspresi protein secara kuantifikasi (Iqbal
dan Ahmad 2017). Salah satu contoh pengerjaan metode ini di PSSP IPB adalah
mendeteksi keberadaan SRV pada primata.
Pengujian dengan metode ini mengharuskan sampel sel protein dalam
keadaan lisis. Proses ini merupakan bentuk dari proses ekstraksi protein, yang
bertujuan unuk mendapatkan sel protein pada sitosol sel. Proses ini harus dilakukan
dalam suhu dingin dengan menggunakan protease untuk mencegah denaturasi
protein terjadi. Setelah diekstraksi, protein selanjutnya diukur konsentrasinya. Hal
ini untuk mengukur massa protein yang dimasukkan dalam tiap sumur plate uji.
Selanjutnya ke dalam sumur dimasukkan pewarna, yang berfungsi sebagai
pemberat sehingga sampel dapat dengan mudah jatuh ke dalam sumur plate uji.
Selain itu penggunaan pewarna ini juga berfungsi untuk memudahkan peneliti
dalam melihat seberapa jauh terpisah. Setelah itu dilakukan proses gel
elektroforesis (Iqbal dan Ahmad 2017).
Gel yang digunakan dalam proses ini adalah agarose gel yang terdiri atas
dua: stacking dan separating gel. Stacking gel umumnya bersifat asam dengan pH
6.8 dan konsentrasi akril amida nya rendah, membuat gel berpori, sedangkan
separating gel merupakan basis gel dengan pH 8.8 dan konsentrasi akril amid nya
tinggi. Pada prinsipnya protein yang berukuran kecil akan terlebih dahulu terpisah
dibandingkan dengan protein yang berukuran besar. Sampel yang berupa protein
memiliki muatan negatif, sehingga pada saat proses elektroforesis protein akan
turun ke bawah dikarenakan muatan listrik yang dialirkan bermuatan positif. Dalam
proses elektroforesis penting untuk mengatur voltase dan waktu pengerjaan. Jika
voltase yang digunakan terlalu tinggi, maka dapat merusak gel sehingga ikatan
protein yang seharusnya ada menjadi rusak (Iqbal dan Ahmad 2017).
Proses selanjutnya yang dilakukan adalah blotting, yaitu proses transfer
protein pada gel ke membran. Adapun membran yang digunakan adalah
polyvinylidene difluoride (PVDF) dan juga nitroselulosa. Proses transfer ini
dilakukan dengan menggunakan aliran listrik, sehingga protein akan pindah pada
membran. Adapun membran ini diletakkan di antara gel, sehingga membentuk
suatu lapisan seperti sandwich. Pada tahap ini terdapat dua hal penting yang harus
diperhatikan sebagaimana dijelaskan oleh Iqbal dan Ahmad (2017), yaitu posisi
membran dengan elektroda positif dan kontak dekat antara gel dan membrane agar
hasil tampak jelas pada membran.
Proses pencucian, blocking, dan pemberian (inkubasi) antibody merupakan
tahapan selanjutnya. Pencucian dan blocking merupakan proses penting dalam
western blotting. Blocking dilakukan dengan menggunakan BSA 5%. Pencucian
dilakukan dengan menggunakan larutan buffer tris buffered saline tween-20
(TBST) sebanyak tiga kali. Inkubasi antibodi primer dilakukan dengan
mencampurkan antibodi tersebut dengan BSA 5%. Inkubasi pada tahap ini
umumnya dilakukan semalaman. Setelah proses pencucian dilakukan maka
selanjutnya antibodi sekunder (konjugat) diberikan dan diinkubasikan selama 1 jam
dan setelah itu dicuci kembali menggunakan TBST sebanyak tiga kali. Hasil yang
telah didapatkan selanjutnya dianalisis dengan melihat munculnya target protein
yang diinginkan. Protein yang muncul ditandai dengan adanya garis pita pada
membrane. Hasil ditunjukkan dan disesuaikan dengan mencocokkan berat massa
pita protein yang muncul dengan pita protein target (Iqbal dan Ahmad 2017).
Prosedur uji yang dilakukan oleh PSSP IPB tidak jauh berbeda dengan yang
disebutkan pada literatur. Namun beberapa reagen ada yang berbeda. PSSP
menggunakan phosphate buffer saline-tween 20 (PBST). Keduanya merupakan
larutan buffer yang umum digunakan di laboratorium. Penggunaan buffer ini
umumnya tidak memiliki perbedaan yang jauh. Selain itu gel yang digunakan di
PSSP IPB berupa gradient gel. Gel jenis ini memiliki fungsi yang sama dengan
stacking gel. Gradient gel dibuat dengan menggunakan prinsip konsentrasi akril
amida yang bertingkat. Pada bagian bawah gel, konsentrasi akril amida nya lebih
tinggi, sedangkan pada bagian atas konsentrasinya paling rendah. Konsentrasi yang
rendah akan membentuk pori-pori besar pada gel, sedangkan konsentrasi tinggi
membentuk pori-pori yang kecil. Protein yang dideteksi akan masuk ke dalam pori-
pori gel tersebut. Protein dengan massa molekul yang besar (berat) akan lebih
mudah masuk ke dalam pori-pori yang besar, begitu pula sebaliknya. Gradient gel
digunakan karena memiliki prinsip konsentrasi bertingkat, sehingga diharapakan
semua protein yang berasal dari sampel dapat terdeteksi dengan jelas.
Uji serologis lain yang juga dilakukan di PSSP IPB adalah Enzyme Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan uji yang banyak digunakan pada
laboratorium diagnostik. Teknik ini dapat memeriksa keberadaan antigen
(identifikasi Ag) maupun antibodi baik secara kualitatif (positif/negatif) maupun
kuantitatif (titer). ELISA merupakan salah satu teknik immunoassay yang
prinsipnya adalah reaksi antigen-antibodi, dapat dideteksi dengan penambahan
konjugat dilabel enzim aktif yang bereaksi dengan substrat menghasilkan warna
spesifik (Levinson dan Jawet 2000). Menurut Wagner dan Martinez (2004), ELISA
menggunakan konjugasi yang berisi enzim (antibodi sekunder) yang bisa
memproses warna substrat yang mengandung target enzim dan kromagen ke warna
ikatan produk yang ada di FC region. Ketika molekul antibodi primer diikat oleh
antigen maka enzim akan terikat juga ke fragment constan (FC) region, dan jika
ikatan antigen dan antibodi kompleks diinkubasi dengan substrat yang tepat untuk
pengikatan enzim maka pembentukan warna bisa digunakan sebagai pembuktian
terdapatnya antibodi. Menurut Crowther (2001) ada beberapa aspek penting yang
harus diperhatikan dalam proses pengujian ELISA yaitu:

a. Fase padat (solid phase) adalah sumur mikrotiter yang terdapat dalam satu plate
yang bisa terbuat dari bahan plastik, nitroselulosa, agarosa, selulosa dan lain
sebagainya, umumnya berjumlah 96 sumur.
b. Antigen adalah protein atau karbohidrat yang disuntikkan ke hewan dan akan
mempengaruhi terbentuknya antibodi.
c. Antibodi adalah sesuatu yang dihasilkan oleh tubuh mamalia sebagai respon
dari antigen.
d. Konjugat enzim adalah enzim yang berikatan secara tetap ke protein seperti
antibodi.
e. Substrat adalah senyawa kimia yang mengandung kromogen dan target enzim
sehingga berikatan dengan enzim secara spesifik yang digunakan untuk
mengasilkan tanda yang dibaca sebagai reaksi warna, jika terlalu lama
membiarkan reaksi antara substrat dan enzim akan mempertinggi intensitas
warna (Rose et al. 1992).
f. Larutan basa atau asam kuat yang digunakan untuk menghentikan aksi enzim
dalam substrat

Gambar Skema metode indirect ELISA

Uji ELISA mempunyai dua fungsi, yaitu pertama sebagai sarana untuk
mengidentifikasi jenis antigen tertentu dengan mereaksikannya dengan antibodi
yang telah diketahui dan yang kedua ialah untuk mengetahui jenis antibodi dan
titernya, dengan cara mereaksikan serum yang ingin diketahui jenis antibodinya
dengan antigen standar yáng telah diketahui. Ada tiga dasar metode pengujian
ELISA yaitu Indirect ELISA, Sandwich ELISA dan Direct ELISA. Pengujian
ELISA yang digunakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi
Satwa Primata (PSSP) merupakan metode Indirect ELISA.
Indirect ELISA atau ELISA tidak langsung merupakan konfigurasi yang paling
sederhana yang dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi. Prinsip dari metode
ELISA tidak langsung adalah menghubungkan antara antigen, antibodi primer dan
konjugat (antibodi sekunder). Sampel uji mengandung antibodi yang bisa berikatan
dengan masing-masing antigen target yang telah menempel pada fase padat.
Penambahan konjugat sebagai antibodi antispesies yang dilabel enzim akan
menghasilkan perubahan warna jika bereaksi dengan substrat yang mengandung
target enzim dan kromogen (Crowther 2001). Keuntungan dari metode ini adalah
beberapa jumlah antiserum bisa diujikan selama mengikat ke antigen yang
menggunakan konjugat antispesies single. Sedangkan kelemahan dari metode ini
adalah bervariasinya ikatan nonspesifik dalam serum individual sehingga
memperlebar dispersi pada hasil pengujian (Crowther 2001). Pada metode ini
ditambahkan blocking agent untuk mencegah terjadinya ikatan nonspesifik antara
antibodi dengan antigen bukan target yang mempunyai afinitas yang rendah (Rose
et al. 1992).

Crowther JR. 2001.The ELISA Guidebook : Methods in Molecular Biology. New


Jersey: Humana Press Inc.
Iqbal J dan Ahmad R. 2017. Western blot: protein separating technique , protocol,
theory, and trouble shooting. Journal of Bacteriology and Mycology. 4 (2):
1-6.
Levinson W, Jawetz E. 2000. Medical Microbiology and Immunology: Examination
and Board Review 6th Edition. USA: The McGraw-Hill Co.
Rose NR, de Macario EC, dan Fahey JL. 1992. Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 4th Edition. Washington DC: American Society for
Microbiology.
Wagner KE dan Martinez HJ. 2004. Basic Virology, Second Edition. USA :
Blackwell Publishing.