Anda di halaman 1dari 24

ISOLASI DNA DARI BEBERAPA ORGANISME DAN AMPLIFIKASI

GEN 16s rRNA

NAMA DOSEN: ARINA FINDO SARI, M. Si


NAMA ASISTEN DOSEN:

• REZA AMALIA PUTRI


• VIRA MAULIDINA
DISUSUN OLEH KELOMPOK 1:

• FRISDA YULIANI (11170950000003)


• WINDY DWIKENCANA (11170950000006)
• CANTIKA OCTAVIANA (11170950000009)
• SYAFITRIANI ARDIASANI (11170950000011)
• MUHAMMAD CHAIRUL (11170950000013)

PROGRAM STUDI BIOLOGI


FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
1441 H/2019 M
1. TUJUAN
Tujuan praktikum kali ini yaitu, mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosomal
bakteri, tanaman, kapang, mukosa/epitel dan leukosit darah (metode salting-out), mahasiswa
mampu melakukaan amplifikasi DNA dengan metode polimerasi berantai / Polymerized Chain
Reaction (PCR) dan visualisasi DNA hasil PCR, mahasiswa mampu melakukan uji kualitatif
DNA dan mampu melakukan uji kuantitatif terhadap DNA melalui metode elektroforesis
horizontal gel agarose.
2. PENDAHULUAN
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia paling penting pada makhluk
hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu
generasi ke generasi selanjutnya (Suryo, 2004). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan
membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional
dalam sel organisme. Pemanfaatan gen 16S rRNA telah digunakan sebagai parameter
sistematik molekular yang universal, representatif, dan praktis untuk mengkonstruksi
kekerabatan filogenetik pada tingkat jenis atau spesies. Hal ini disebabkan karena keberadaan
gen tersebut tidak tergantung pada kondisi pertumbuhan dan media yang digunakan (Case dkk,
2007)
Isolasi DNA merupakan langkah untuk mempelajari DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan
tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain, seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip
utama dalam isolasi DNA ada tiga, yakni penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA
dari bahan padat, seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Fatchiyah dkk, 2011).
Metode yang biasa digunakan untuk mengisolasi DNA tanaman adalah menggunakan
metode Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB). Senyawa CTAB termasuk jenis surfaktan
kationik yang digunakan untuk proses lisis dinding sel tanaman. Metode ini tidak
membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit dan juga
memiliki keakuratan yang tinggi karena mampu memisahkan DNA dari polisakarida dan
senyawa polifenol (Varela dkk, 2006).
Isolasi DNA dari sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, dimana
terdapat DNA didalamnya sedangkan sel darah merah tidak berinti, berbentuk cawan bikonkaf
dan berifat pasif (Faatih, 2009). Isolasi DNA leukosit dengan metode salting out merupakan
teknik konvensional dimana protein diendapkan menggunakan garam konsentrasi tinggi
dengan asumsi bahwa garam dengan konsentrasi tinggi akan mengurangi kelarutan protein
sehingga protein akan mengendap (Corkill dkk, 2008).
Tahap lanjutan dari isolasi DNA adalah amplifikasi DNA dengan Polymerse Chain
Reaction (PCR) (Pierce, 2005). PCR adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA
dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis
(Yusuf, 2010). Komponen-komponen yang harus ada dalam proses PCR antara lain DNA
cetakan yaitu potongan DNA yang akan dilipatgandakan, primer yaitu suatu potongan atau
sequence dari oligonukleotida pendek yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA,
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan enzim DNA
polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA, dan senyawa
buffer (Joko, 2011).
Proses PCR menggunakan menggunakan alat thermocycler (Yusuf, 2010). PCR adalah
suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus
terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda (Handoyo, 2000). Proses pemecahan untai
DNA ganda menjadi untai tunggal disebut denaturasi DNA template, biasanya terjadi pada
suhu 95oC selama 1–2 menit sehingga DNA yang berupa untai ganda (double stranded) akan
terpisah menjadi untai tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan proses penempelan (annealing)
primer pada DNA cetakan dilakukan pada suhu 56oC selama 1 menit. Primer akan membentuk
ikatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer. Tahap selanjutnya
yakni sintesis DNA dimana akan terbentuk DNA baru berdasarkan informasi yang ada pada
DNA cetakan dengan bantuan enzim DNA polimerase. Tahap sintesis ini biasanya terjadi pada
suhu 72oC selama 1– 2 menit. Tahapan-tahapan tersebut diulangi 25–35 siklus. Di akhir proses
PCR maka hasilnya disimpan pada suhu 4oC (Yuwono, 2006).
Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan dua cara yaitu secara
kualitatif dengan metode elektroforesis gel agarose dan secara kuantitatif dengan metode
spektrofotometer UV-Vis. Tahap pengujian DNA secara kualitatif memiliki tujuan guna
mengetahui ada atau tidaknya (keberadaan) DNA dalam larutan sampel. Tahap pengujian DNA
secara kuantitatif dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis yang merupakan suatu
metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa
tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya (Yuwono, 2005).
Uji kuantitatif DNA merupakan analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA
yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan
DNA plasmidnya dalam larutan sampel dengan cara uji kualitatif (Hapsari, 2012). Prinsip dari
kuantifikasi DNA menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis adalah iradiasi sinar ultraviolet
dapat diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan karena adanya basa purin dan
pirimidin. Penyerapan iradiasi sinar UV oleh DNA secara maksimal dicapai pada panjang
gelombang 260 nm sedangkan penyerapan maksimal pada protein pada panjang gelombang
280 nm. Pada panjang gelombang 260 nm kepadatan optic (optical density/OD) sama dengan
satu, maka konsentrasi molekul heliks ganda setara dengan 50 µg/mL atau 40 µg/mL DNA
single heliks atau setara degan 20 µg/mL oligonukleotida untai tunggal. Nilai OD juga dapat
digunakan untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA hasil isolasi melalui nilai rasio antara
OD260 dan OD280. Hasil isolasi DNA berhasil jika nilai rasio OD berkisar antara 1,8-2,0
(Hidayati dkk, 2016).
Keberhasilan isolasi DNA diuji secara kualitatif menggunakan elektroforesis gel agarose
dalam larutan Tris acetat EDTA (TAE). Metode standar yang digunakan untuk identifikasi,
pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA adalah elektoforesis gel agarosa. Molekul DNA yang
bermuatan negatif saat elektroforesis berbanding terbalik dengan konsentrasi gelnya. Migrasi
struktur molekul yang besar akan lebih lambat dibandingkan struktur molekul yang kecil dalam
proses melewati pori-pori gel (Fachtiyah dkk, 2011).
3. METODOLOGI
3.1 ALAT DAN BAHAN
Alat-alat yang digunakan pada percobaan “Amplifikasi gen 16s rRNA dan 18s rRNA dari
beberapa organisme” antara lain mikropipet, microtip (putih/transparant, kuning, biru),
refrigerated sentrifuge, microtube, mortar dan pestle, rak tabung mikro, vortex, inkubator,
freezer, neraca analitik, thermocycler (mesin PCR), tabung PCR, microwave, hotplate, beaker
glass, labu ukur, elektroforesis horizontal, spektrofotometer UV-Vis, kuvet, erlenmeyer dan
transluminator UV.
Adapun bahan yang digunakan antara lain isolat kapang Rhizopus oryzae, sampel darah
manusia, isolat daun sawi muda, isolat sel mukosa, buffer ekstraksi, buffer TAE, Phosphate
Buffered Saline (PBS), etanol 70%, mercapto etanol, Chloroform Isoamyl Alcohol (CIAA),
isopropanol dingin, akuades, InstaGene Matrix, Dream Taq Green Master mix, gel agarose,
marker (penanda ukuran fragmen DNA), primer F, primer R, loading dye, Nuclease Free Water
(NFW).
3.2 CARA KERJA
3.2.1 Isolasi DNA
3.2.1.1 Isolasi DNA Kromosomal Bakteri Escherichia coli
Kultur bakteri sebanyak 1,5 mL disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 1
menit. Kemudian supernatan dibuang, lalu pelet ditambahkan 100 μL InstaGene Matrix.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 56°C selama 30 menit, dan divortex selama 10 detik.
Kemudian micro tube ditempatkan pada air mendidih 100°C selama 8 menit, lalu divortex
selama 10 detik. Kembali disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit. Lalu
diambil supernatannya dan dipindahkan ke tube baru yang selanjutnya disimpan di freezer. 20
μL dari supernatan akan digunakan untuk proses PCR.
3.2.1.2 Isolasi DNA Tanaman Sawi
Daun sawi muda yang segar ditimbang sebanyak 0,3 g, kemudian daun dihaluskan
menggunakan mortar dan pestle, lalu ditambahkan 250 μL buffer TAE dan ditambahkan 100
μL mercapto etanol. Sampel dimasukkan ke microtube dan divortex selama 5 detik.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 60°C dan setiap 10 menitnya divortex. Kemudian
ditambahkan kloroform-isoamilalkohol (24:1) sebanyak 1x volume sampel, dikocok selama 10
menit. Lalu disentrifuge dengan kecepatan 10.000xg selama 5 menit pada suhu 4˚C. Fase air
yang diperoleh dipindahkan ke microtube baru dan ditambahkan isopropanol dingin sebanyak
1x volume sampel. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 50°C selama 5 menit. Disentrifuge
kembali dengan kecepatan 15.000xg selama 5 menit dan supernatan dibuang. Pelet
ditambahkan 100 μL etanol 70 % lalu disentrifuge dengan kecepatan 15.000xg selama 5 menit.
Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Kemudian sampel diresuspensi dengan 30 μL
buffer TE dan disimpan pada suhu -20°C.
3.2.1.3 Isolasi DNA Darah Manusia
Sampel darah dimasukkan sebanyak 3-6 μL ke microtube, ditambah akuades 1 mL lalu
di thawing. Diinkubasi pada suhu ruang, kemudian supernatan dibuang. Lalu ditambahkan 200
μL InstaGene Matrix dan diinkubasi pada suhu 56 °C selama 15-30 menit. Selanjutnya
divortex selama 10 detik dan dipanaskan pada suhu 100°C. Sampel disentrifuge dengan
kecepatan 11.000xg selama 3 menit lalu supernatan dipindahkan ke tube baru dan
dihomogenkan. Supernatan disimpan pada suhu -20°C.
3.2.1.4 Isolasi DNA Mukosa Pipi
Isolat diambil sebanyak 200 μL lalu disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama
1 menit. Lalu supernatan dibuang dan pelet diresuspen sebanyak 1 ml 1x PBS. Disentrifuge
kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Lalu supernatan dibuang dan pelet
diresuspen dengan akuades 100 μL lalu dihomogenisasi. Diambil 10 μL dan ditambahkan 100
μL InstaGene Matrix lalu dihomogenisasi. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 56 °C selama 30
menit dan divortex selama 10 detik. Kemudian diinkubasi pada suhu 100 °C selama 5 menit.
Dihomogenisasi dengan vortex selama 10 detik. Lalu disentrifuge kembali dengan kecepatan
10.000 rpm selama 3 menit. Supernatan diambil dan dipindahkan ke tube baru dan disimpan di
suhu -20°C.
3.2.1.5 Isolasi DNA Kapang Rhizopus oryzae
Isolat cair Rhizopus oryzae disaring kemudian digerus di mortar dan ditambah buffer
ekstraksi 500 μL. Lalu dimasukkan ke microtube dan ditambah buffer ekstraksi 250 μL.
Divortex selama 10 detik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 60°C selama 30 menit dan divortex
selama10 detik. Kemudian ditambah CIAA dengan perbandingan 23:2 sebanyak 1x volume.
Lalu dikocok selama 10 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit
pada suhu 4°C. Fase air (dihitung volume) dipindahkan pada microtube. Lalu ditambah
isopropanol dingin 1x volume sampel. Tabung kemudian dikocok lalu diinkubasi pada suhu
20°C selama 15 menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 15.000 xg selama 5 menit dengan
suhu 4°C. Supernatan dibuang dan pelet ditambah 100 μL etanol 70%. Selanjutnya
disentrifugasi kembali dengan kecepatan 15.000xg selama 5 menit pada suhu 4°C. Supernatan
dibuang dan dikering anginkan. Lalu ditambahkan 30 μL 1x Buffer TE dan disimpan di suhu -
20°C.
3.2.2 Uji Kuantitatif DNA
Spektrofotometer UV-Vis dinyalakan kemudian diatur pada panjang gelombang 260
nm dan 280 nm. Lalu alat disetting untuk blanko dan sampel. Setelah itu masing-masing sampel
dipindahkan ke kuvet lalu dibaca nilai absorbansinya. Lalu kemurnian dan konsentrasi DNA
dihitung sesuai rumus.
Konsentrasi : abs 260 x 50 x Faktor Pengenceran (100 ml)
Kemurnian : abs 260/abs 280
3.2.3 Uji Kualitatif DNA
3.2.3.1 Uji Kualitatif Isolasi DNA Darah Manusia
Gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0,8% dengan pengenceran buffer TAE 1x dan
larutan buffer 50 ml. Kemudian dipanaskan di microwave hingga homogen. Agar dituang ke
cetakan agar yang telah diberi sisir gel dan ditunggu hingga beku. Lalu gel diletakkan di tangki
elektroforesis dan dituangkan buffer TAE hingga gel terendam. Kemudian sampel dimasukkan
ke sumuran dengan komposisi 5 µL DNA darah dan 1 µL loading dye. Lalu dimasukkan
marker. Selanjutnya diatur kecepatan arus sebesar 100 V dan waktu 30 detik. Hasil yang
diperoleh kemudian divisualisasi dengan transluminator UV.
3.2.3.2 Uji Kualitatif Amplikon Bakteri Escherichia coli
Gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 1% dengan pengenceran buffer TAE 1x dan
larutan buffer 50 ml. Kemudian dipanaskan di microwave hingga homogen. Agar dituang ke
cetakan agar yang telah diberi sisir gel dan ditunggu hingga beku. Lalu gel diletakkan di tangki
elektroforesis dan dituangkan buffer TAE hingga gel terendam. Kemudian sampel hasil
amplikon dimasukkan ke sumuran sebanyak 5 µL. Lalu dimasukkan marker serta kontrol
negatif dan positif. Selanjutnya diatur kecepatan arus sebesar 100 V dan waktu 30 detik. Hasil
yang diperoleh kemudian divisualisasi dengan transluminator UV.
2.3.4 Amplifikasi DNA Bakteri Escherichia coli dengan metode PCR
Dibuat larutan campuran total 9 µL dengan komposisi Dream Taq Green Master mix 5
µL, primer F 1 µL, primer R 1 µL, dan NFW 2 µL lalu ditambahkan 1 µL sampel bakteri
Escherichia coli. Kemudian sampel di spindown sebelum dimasukkan ke dalam thermalcycler.
Diatur suhu untuk pradenaturasi 95°C selama 1 menit, denaturasi 95°C selama 30 detik,
annealing 51°C selama 30 detik, elongasi 72°C selama 2 menit, pascaelongasi 72°C selama 10
menit serta heated cover 105°C lalu diatur pula jumlah siklusnya yaitu sebanyak 25x.
4. HASIL
Tabel 1. Genom Kapang

Konsentrasi
Kelompok Abs. 260 Abs. 280 Abs. 230 Kemurnian
(µg/mL)
1 0,085 0,066 0,101 425 1,288
2 0,035 0,028 0,049 175 1,25
3 0,076 0,058 0,082 380 1,31
4 0,079 0,060 0,083 395 1,317
5 0,096 0,077 0,117 480 1,247
6 0,035 0,028 0,040 175 1,25
Tabel 2. Genom Tanaman

Konsentrasi
Kelompok Abs. 260 Abs. 280 Abs. 230 Kemurnian
(µg/mL)
1 0,293 0,140 0,111 1465 2,093
2 1,686 1,620 0,621 8430 1,041
3 1,335 0,731 0,457 6675 1,826
4 0,043 0,026 0,053 215 1,654
5 0,449 0,212 0,514 2245 2,118
6 0,469 0,224 0,524 2345 2,094
Tabel 3. Genom Bakteri

Konsentrasi
Kelompok Abs. 260 Abs. 280 Abs. 230 Kemurnian
(µg/mL)
1 0,142 0,086 0,152 710 1,651
2 0,119 0,070 0,119 595 1,7
3 0,085 0,050 0,091 425 1,7
4 0,088 0,056 0,109 440 1,571
5 0,086 0,053 0,092 430 1,623
6 0,149 0,098 0,154 745 1,52
Tabel 4. Genom Darah

Konsentrasi
Kelompok Abs. 260 Abs. 280 Abs. 230 Kemurnian
(µg/mL)
1 0,029 0,026 0,097 145 1,115
2 0,027 0,023 0,098 135 1,174
3 0,025 0,020 0,094 125 1,25
4 0,037 0,033 0,121 185 1,121
5 0,028 0,025 0,098 140 1,12
6 0,031 0,026 0,092 155 1,192
Tabel 5. Genom Mukosa/Epitel

Konsentrasi
Kelompok Abs. 260 Abs. 280 Abs. 230 Kemurnian
(µg/mL)
1 0,012 0,008 0,016 60 1,5
2 0,012 0,008 0,014 60 1,5
3 0,009 0,005 0,008 45 1,8
4 0,016 0,011 0,021 80 1,455
5 0,008 0,005 0,013 40 1,6
6 0,011 0,007 0,014 55 1,571
Gambar 1. Pola pita elektroforesis DNA kromosom amplikon bakteri E. coli
Keterangan :
M = Marker
K(+) = Kontrol positif
K(-) = Kontrol negatif
Bn = Amplikon bakteri E. coli ke-n

Gambar 2. Pola pita elektroforesis DNA kromosom amplikon Darah Manusia


Keterangan :
M = Marker
Dn = Genom darah ke-n
PEMBAHASAN
Uji Kuantitatif DNA Kapang
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari isolasi DNA yang
bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan yang memiliki
beberapa cara, yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar
dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan
iradiasi. Cara lain, dengan menggunakan kimia.
Penghancuran dengan menggunakan bahan kimiawi seperti penggunaan detergen yang
dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel.
Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase-K untuk melisiskan membran pada
sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel
(Jeewon, dkk 2013). Struktur dinding sel pada kapang terdiri dari glikoprotein, glukan, kitin,
dan polifosfat. Kloroform pada CIAA merupakan pelarut organik yang mampu melarutkan
protein dari bahan genetik untuk diperoleh supernatan berisi DNA yang bebas kontaminan
protein, menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aqueus.
Penambahan kloroform setelah sentrifugasi, bertujuan untuk memisahkan larutan campuran
antara dua fase yaitu fase cair dan padat, dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat
adalah campuran protein dan DNA (Zainuddin, 2009). Penambahan isopropanol dingin dan
perlakuan sentrifuge, yaitu untuk mengendapkan DNA yang akan tampak sebagai benang-
benang halus. Hasil akhirnya berupa pelet yang kemudian dikering-anginkan dan diresuspensi
dengan 100μL buffer TE dan disimpan dalam suhu -20°C. Buffer TE ini berfungsi untuk
menjaga atau mempertahankan DNA agar tidak rusak, memisahkan antara RNA dengan berat
molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi
oleh RNA dan dapat disimpan dalam waktu yang lama. Penyimpan pada suhu -20°C bertujuan
agar DNA tidak mudah terdegradasi (Andayani, 2008).
Ethanol absolut yang digunakan dalam praktikum ini, berfungsi sebagai presipitasi
DNA. Ethanol 70% untuk membersihkan sisa etanol dan kontaminan. Proteinase-K untuk
melisiskan membran pada sel darah dan mendegradasi protein globular maupun rantai
polipeptida dalam komponen. Buffer Ekstraksi/CTAB (Cetyl Trimethylammonium Bromide),
berfungsi untuk melisiskan membran sel, denaturasi protein dan dapat menghambat aktivitas
enzim nuklease (DNase). Komposisi dari CTAB, yiatu NaCl yang berfungsi untuk
menghilangkan polisakarida. EDTA yang berfungsi untuk melepaskan ion Mg2+ yang
berperan dalam mempertahankan struktur membran sel secara keseluruhan. Tris-HCL untuk
merusak dinding dan membran sel serta sebagai buffer. SDS untuk (Kusnadi, 2003).
Berdasarkan hasil uji kuantitatif, didapatkan rasio kemurnian DNA pada kapang
dengan nilai berkisar antara 1,247 - 1,317. Konsentrasi terbesar, terdapat pada kelompok 4
yaitu 480 μg/mL dan konsentrasi terkecil yaitu 175 μg/mL pada kelompok 2 dan 6. Konsentrasi
DNA berpengaruh pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi yang terlalu rendah
akan menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau tidak terlihat secara visual,
sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit
dibedakan antara satu fragmen dengan fragmen lainnya. Pada uji kuantitatif metabolit sekunder
dapat diketahui bahwa kapang endofit pada Rhizopus oryzae berpotensi dalam menghasilkan
senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol (Sumarsih, 2003).

Hasil isolasi DNA, dikatakan murni jika memiliki nilai rasio  260/ 280 antara 1,8
sampai 2,0. Jika nilai rasio  260/ 280 < 1,8 µg/ml, maka hal ini menandakan bahwa isolat
DNA yang dihasilkan menunjukkan adanya kontaminan protein. Jika nilai rasio  260/ 280 >
2,0 maka isolat DNA masih terkontaminan dengan senyawa berat molekul kecil, misalnya
RNA, sehingga diperlukan purifikasi dengan RNAase. Hasil isolasi DNA kapang dari keenam
kelompok, nilai kemurniannya berada di bawah batas normal, yaitu < 1,8. Hal ini menandakan,
bahwa isolat DNA yang dihasilkan menunjukkan adanya kontaminan protein, masih
mengandung kontaminan fenol dan pelarut yang digunakan terlalu banyak, sedangkan DNA
yang diambil terlalu banyak. Faktor lain yang menyebabkan DNA tidak murni adalah adanya
sisa kandungan metabolit sekunder pada organ tanaman yang diekstrak (Hadioetomo, 1993).
Uji Kuantitatif DNA Tanaman
Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA tanaman sawi hijau (Brassica rapa
var.parachinensis) langkah pertama yakni penghancuran (lisis) membran dinding sel pada
daun yang digunakan, ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA tanaman ini digunakan daun yang masih muda hal
ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga
dapat memperbesar kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita
inginkan.
Menurut Zubaidah (2004), pada bagian tanaman banyak memiliki senyawa polifenol
dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA, senyawa
polifenol dan polisakarida juga dapat mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase,
endonuklease restriksi atau enzim yang mengakibatkan DNA tidak digunakan dalam praktikum
Biologi Molekuler. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan
cara fisik seperti menggerus sampel daun dengan menggunakan mortar dan alu dalam nitrogen
cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al, 2005).
Penghancuran bertujuan untuk merusak jaringan yang ada pada sel sehingga
mempermudah bahan-bahan kimia lain yang akan digunakan untuk masuk ke dalam organel-
organel sel, dalam hal untuk mengambil DNA. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali
terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan
flavonoid. Tahap pelisisan sel ditambahkan buffer ekstraksi atau buffer CTAB sebanyak 500
µl dengan komposisinya yang terdiri dari Tris-HCL, NaCl, EDTA, dan CTAB. Tris HCL
berfungsi untuk mendenaturasi protein. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida dan
sebagai bahan penetral pada gula fosfat DNA (Ardiana, 2009). EDTA (Ethylene Diamine
Tetraacetic Acid) berfungsi untuk menginaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi
DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion
Magnesium (Mg) dan Kalsium (Ca) yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse
(Pharmawati, 2009).
Larutan CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide) berfungsi untuk melisiskan
dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Dalam tahap ekstraksi sel, sampel
ditambahkan kloroform : isoamil alkohol (24:1) atau CIAA sebanyak 1x volume sampel.
Fungsi dari CIAA yaitu untuk memisahkan DNA dari kontaminan lainnya terutama untuk
mendenaturasi protein dan memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun
dengan ukuran yang terbatas (20.000–50.000 bp) (Muladno, 2002).
Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan
terbentuk 3 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah, protein dan debris berada
pada lapisan tengah serta DNA dan supernatan berada pada lapisan atas. Namun ada juga yang
berpendapat bahwa terbentuknya 2 fase setelah penambahan CIAA dan disentrifugasi yaitu
fase cair (supernatan) dan fase organik. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Pharmawati,
(2009) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase
organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA
akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan
berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik.
Tahap presipitasi DNA dengan menambahkan etanol absolute dingin yang berfungsi
untuk presipitasi DNA, dimana DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA
danprotein yang masih tersisa sehingga DNA terbebas dari kontaminan (Doyle, 1990). Saaat
penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA tanaman berwarna putih
yang melayang di larutan tersebut. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada
fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pelet setelah
dilakukan sentrifugasi. Menurut Heldt (2005) bahwa presipitasi berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. Setelah itu
ditambahkan etanol 70% yang bertujuan untuk menghilangkan sisa kontaminan-kontaminan
yang masih ada di larutan DNA sehingga akan menghasilkan DNA yang murni. Penggunaan
kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni,
namun dengan ukuran yang terbatas (20.000–50.000 bp). DNA kemudian diikat dari fase
aquoeus dengan presipitasi isopropanol (Muladno, 2002). Setelah proses ekstraksi, DNA yang
didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Umumnya digunakan isopropanol dingin untuk
mengendapkan, melekatkan dan memisahkan DNA dari larutan.
Saat penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA tanaman
berwarna putih yang melayang di larutan tersebut. Kedua senyawa tersebut akan
mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber
dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Menurut Heldt (2005) bahwa presipitasi
berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.
Residu tersebut juga mengalami koagulasi namun tidak membentuk struktur fiber dan berada
dalam bentuk presipitat granular. Saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet
dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.
Proses presipitasi kembali dengan isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat
meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Farrel, 2004). Menurut Donata (2007)
DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang terbebas dari campuran material dan komponen
intraseluler yang mengandung larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat.
Setelah itu ditambahkan 100 μL buffer TE ke dalam tabung yang berisi pelet
Menurut Yuwono, (2008) prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan
kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan
negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air.
Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air, kemudian
disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC. Menurut Ardiana, (2009) menyatakan
bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah
diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Pharmawati, (2009) juga
menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA
yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang
didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam
keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC.
Uji kuantitatif DNA dilakukan untuk mendapatkan informasi mengenai konsentrasi dan
kemurnian DNA. Hal ini sangat diperlukan untuk mengetahui derajat kontaminasi suatu sampel dan
apakah sampel tersebut baik untuk digunakan pada tahap selanjutnya, yaitu dalam analisis karakter
genetika. Oleh karena itu, dilakukan pengukuran terhadap kuantitas baik konsentrasi maupun kemurnian
DNA genom. Selain kemurnian dan konsentrasi DNA, metode ekstraksi rusaknya DNA dan zat pengotor
seperti fenol dan protein lainnya dalam sampel sangat mempengaruhi pengukuran secara kuantitatif
(Birren, 1997). Uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu
metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut
mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer.
Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara
fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Fatchiyah 2011).
Panjang gelombang yang digunakan 260 nm sinar UV untuk pembacaan absorbansi molekul-molekul
DNA, sedang kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya pada panjang gelombang 280 nm.
Kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai
absorbansi 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011).
Dapat dilihat dari tabel nilai kemurnian DNA tertinggi didapatkan oleh kelompok 3
yaitu 1,83 µg/ml . Nilai rata-rata kemurnian DNA yang didapatkan dari tiap sampel dengan
metode spektrofotometer UV-Vis adalah dibawah 1,8 µg/ml yang menunjukkan bahwa masih
terdapat banyak kontaminan dalam sampel isolasi DNA di tiap sampel. Hasil isolasi DNA
dikatakan murni jika nilai rasio  260/ 280 adalah antara 1,8 sampai 2,0. Jika nilai rasio 
260/ 280 kurang dari 1,8 µg/ml maka hal ini menandakan bahwa isolat DNA yang dihasilkan
masih mengandung kontaminan berupa fenol dan pelarut yang digunakan terlalu banyak.
Sedangkan jika nilai rasio  260/ 280 lebih dari 2,0 maka isolat DNA masih terkontaminan
dengan protein dan senyawa lainnya (Sambrook dan Russell, 2001). Larasati (2011) juga
menyebutkan jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan
dari protein membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum
murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang
diambil terlalu sedikit.
Tinggi atau rendahnya konsentrasi DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi dapat
disebabkan oleh beberapa faktor salah satunya faktor inkubasi. Sampel yang telah dicampur
dengan larutan buffer di inkubasi pada suhu tertentu. Larutan tersebut berfungsi untuk
menghancurkan jaringan dan memberan sel, mengeliminasi kontaminan, sehingga yang
didapatkan pada tahapan ini adalah DNA genom yang terdapat dalam sel. Jika suhu inkubasi
terlalu tinggi maka dapat merusak DNA, sedangkan jika suhu terlalu rendah maka membran
serta jaringan sel tidak dapat hancur. jika terlalu lama diinkubasi maka dapat merusak DNA,
sedangkan jika terlalu cepat dapat menghancurkan membran dan jaringan sel. Kombinasi
pengaturan suhu dan lama inkubasi yang tepat dapat memghasilkan konsentrasi isolat DNA
sesuai yang diharapkan.
Pemurnian DNA juga dilakukan dengan metode purifikasi silika. Prinsip dari metode
ini yaitu pengikatan molekul air oleh denaturan dan adanya ikatan hidrogen antara gugus
silanol (SiOH-) pada silika dengan atom oksigen pada gugus fosfat DNA. Metode ini juga
menguntungkan karena tidak memerlukan pelarut organik, mempersingkat waktu pengerjaan,
dan menghemat biaya. Memperoleh hasil DNA kromosom dengan kemurnian tinggi melalui
metode silika ini dapat menghilangkan residu fenol dan kloroform (Tan & Yiap, 2009; Yang
et al., 1998).
Konsentrasi terbesar terdapat pada kelompok 2 yaitu 8430 µg/ml . Perbedaan konsentrasi DNA
ini lah disebabkan karena perlakuan fisik yang diberikan serta kemampuan dari buffer ekstraksi
dalam memecah sel. Proses perusakan sel secara fisik dengan proses penggerusan sampel yang
sempurna dapat mempermudah kerja buffer ekstraksi dalam memecah sel pada sampel.
Disamping itu juga, Buffer ekstraksi yang digunakan dapat menentukan konsentrasi DNA yang
dihasilkan.
Uji Kuantitatif DNA Bakteri Rhizopus oryzae
Tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA yaitu isolasi DNA. DNA dapat
ditemukan di kromosom inti maupun di organel (Fatchiyah, 2011). Percobaan analisis DNA
kromosomal bakteri yang digunakan pada percobaan ini adalah Escherichia coli yang
kemudian diisolasi DNA-nya. Isolasi DNA bakteri digunakan dream taq green 2x master mix
atau yang disebut sebagai InstaGene matrix, merupakan sebuah kit yang sudah diproduksi
secara konvensional yang berfungsi untuk mempercepat proses isolasi DNA. Kandungan yang
terdapat di dalamnya yaitu air dan polystyrene-divinylbenzene iminodiacetate (Bio-Rad, 2015).
Uji kuantitatif DNA merupakan analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah
DNA yang terdapat di dalam suatu sampel. DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang
maksimal 260 nm, sementara protein menyerap kuat pada λ180 nm. Selain itu, asam nukleat
dapat menyerap secara signifikan pada panjang λ280 nm dan sebagian protein dapat menyerap
kuat pada λ260 nm. Sehingga untuk mengukur dengan akurat konsentrasi DNA, RNA, dan
protein dalam suatu campuran yang kompleks bukan hal yang mudah. Pengukuran absorbansi
pada λ260 nm dan λ280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam nukleat dengan
nilai 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA yang mengindikasikan sampel murni. Nilai yang
rendah akan menunjukkan adanya kontaminan lain atau terdapatnya protein (Teare, 2009).
Berdasarkan hasil yang didapat dari analisis kuantitatif DNA bakteri Escherichia
coli dengan menggunakan alat spektrofotometer, nilai kemurnian DNA sampel bakteri tersebut
tidak ada yang mendekati nilai 1,8 sehingga DNA dapat dikatakan memiliki tingkat kemurnian
DNA yang rendah. Hal ini menunjukkan bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan
protein. DNA yang murni memiliki rasio 1,8. Apabila nilai rasio lebih dari 1,8 menunjukkan
adanya RNA, hal ini karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260
- λ280 nm.
Nilai konsentrasi berkisar antara 425-745 µg/mL. Konsentrasi terbesar dimiliki oleh
sampel DNA Kromosomal Bakteri kelompok 6 dan terkecil dimiliki oleh kelompok 3.
konsentrasi DNA akan berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Menurut Haris et
al. (2003), konsentrasi DNA yang terlalu rendah akan menghasilkan fragmen yang sangat tipis
pada gel atau bahkan tidak terlihat secara visual, sebaliknya konsentrasi DNA yang terlalu
tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara satu fragmen
dengan fragmen lainnya. Selain itu menurut Restu et al. (2012) pemurnian yang kurang
maksimal menyebabkan sebagian supernatant yang mengandung DNA genom dapat ikut
terbuang sehingga konsentrasi DNA yang dihasilkan menjadi berkurang. Perbedaan hasil pada
masing-masing sampel tergantung pada banyaknya konsentrasi DNA yang terekstraksi.
Semakin sedikit atau tidak adanya smear pada pita DNA menunjukkan semakin baik kualitas
DNA.
Berdasarkan nilai absorbansi pada λ260 nm dari DNA bakteri Escherichia coli, dapat
dikatakan DNA kromosomal bakteri yang diisolasi memiliki tingkat kemurnian yang rendah
dan kurang bersih. Menurut Restu, dkk (2012), secara teoritis sampel DNA yang dianggap
cukup murni memiliki perbandingan λ260/ λ280 = 1,8-2,0. Tingkat kemurnian DNA yang
rendah dapat dimungkinkan terdapatnya kontaminasi fenol. Rasio λ260/ λ280 < 1,8
menunjukkan adanya kontaminasi fenol atau protein hasil ekstraksi. Umumnya pemurnian
DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol, klorofom, dan isoamil alcohol yang
berfungsi untuk menghilangkan senyawa yang dapat mengkontaminasi DNA (Birren, 1993).
Pemurnian DNA dengan penambahan fenol dan kloroform berguna untuk mengendapkan
protein dengan melalui proses sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan protease
(Thermo Scientific, 2009).
Penyiapan template DNA sampel yang digunakan untuk diamplifikasi dengan PCR,
ekstraksinya dilakukan dengan cara boiling method (Medici, 2003) karena metode ini cukup
efisien dan ekonomis dimana Escherichia coli termasuk bakteri Gram negatif yang memiliki
dinding sel yang tidak terlalu tebal sehingga mudah dilisiskan dengan pemanasan
(Ratchtrachenchai, 2004). Pada dasarnya, metode boiling dengan pemanasan 100oC ini
mempercepat lisis dinding sel bakteri sehingga DNA dapat diekstraksi sekaligus
mempermudah proses denaturasi rantai DNA ketika dilakukan amplifikasi dengan cara PCR
(Radji, 2010).
Prinsip kerja PCR (Polymerase Chain Reaction) yaitu menggunakan reaction
mixture serta memanfaatkan enzim dari DNA polymerase yang bersifat termostabil dan
fragmen DNA yang pendek disebut primer. Primer berfungsi untuk mensintesis secara
langsung sekuens DNA target spesifik dari DNA template. Reaksi sintesis tersebut terus
berulang sehingga membentuk suatu siklus. Produk dari siklus sintesis sebelumnya dapat
berfungsi sebagai template atau cetakan bagi siklus selanjutnya. Hasilnya ialah amplifikasi
eksponensial dari sekuens DNA target. Siklus yang berulang tersebut dapat berlangsung karena
penggunaan Taq polymerase. Taq polymerase ialah sebuah enzim polymerase bersifat
termostabil yang diisolasi dari bakteri termofilik yaitu Thermus aquaticus (Tarigan, 2011).
Komponen – komponen dalam reaction mixture PCR yaitu H2O steril, fungsinya
sebagai pelarut campuran. Bufer berfungsi untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan
optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Bufer biasanya terdiri atas bahan-bahan
kimia. Komponen lainnya yaitu dNTP (deoxynucleoside triphosphate) sebagai pembentuk basa
komplementer dan penyusun DNA, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA,
yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Primer berfungsi untuk menginisiasi sintesis DNA pada
sekuens target yang spesifik dan membatasi reaksi polimerisasi DNA. Primer terdiri dari dua
macam, yaitu primer forward dan primer reverse. Primer forward untuk menginisiasi sintesis
untai DNA dari ujung 5’ ke ujung 3’, sedangkan primer reverse menginisiasi sintesis DNA dari
ujung 3’ ke ujung 5’. Kation divalen terdiri dari ion logam bivalen (umumnya Mg2+) dan ion
logam monovalen (K+), berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion-
ion tersebut enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja (Science biotech.net , 2011) DNA
template adalah DNA yang memiliki sekuens target untuk penempelan primer, berfungsi
sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi. Komponen yang terakhir yaitu enzim DNA
polymerase berfungsi untuk membaca kode DNA serta menghubungkan pasangan nukleotida
dalam menghasilkan salinan DNA (Handoyo, 2001).
Uji Kualitatif DNA Bakteri Rhizopus oryzae
Uji elektroforesis dilakukan untuk mengetahui kualitas DNA hasil isolasi serta ukuran
DNA tersebut. Uji elektroforesis ini menggunakan alat elektroforesi dan marker DNA
berukuran 250-10000bp (Nurwati, 2016). Amplifikasi gen 16 rRNA bertujuan untuk
menggandakan gen target agar dihasilkan copy DNA yang banyak dalam waktu yang singkat.
Keberhasilan dari proses amplifikasi tersebut disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya
penempelan primer pada cetakan genom. Konsentrasi template DNA berhubungan dengan
konsentrasi primer, sehingga perlu dicari optimalisasi rasio antar konsentrasi template DNA
dengan primer (Martida, 2016). Menurut Janda (2007) primer yang digunakan pada proses
amplifikasi DNA bakteri yaitu primer 16SrRNA. Primer 16SrRNA digunakan untuk
mengamplifikasi spesies bakteri karena gen 16SrRNA terdapat di dalam semua
sel bakteri sebagai kelompok multigen atau operon, fungsi dari gen 16S rRNA dalam waktu
yang lama tidak berubah tergantung jarak evolusinya dan gen 16S rRNA memiliki range yang
cukup panjang yaitu 1500 bp.
Berdasarkan hasil visualisasi gel agarose hasil elektroforesis menggunakan sampel
DNA yang telah di amplifikasi dengan metode PCR dapat diketahui bahwa pita fragmen DNA
yang tersinari oleh UV menunjukan adanya pergerakan atau migrasi pada sampel B1, B3, dan
B4 dengan panjang sekitar 1500 bp, sedangkan pada sampel B2, B5 dan B6 tidak mengalami
migrasi. Menurut Padmalatha (2006) dan Harini dkk. (2008) konsentrasi primer yang terlalu
rendah atau yang terlalu tinggi dapat menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi. Rasio rendah
antara primer dan DNA menyebabkan produk yang dihasilkan tidak konsisten (Ali dkk., 2006).
Sampel Eschericia coli menghasilkan fragmen DNA dengan panjang diantara 1.000-1.500 bp.
Menurut Radji dkk. (2010) sampel fragmen DNA dari bakteri Eschericia coli memiliki
panjang berkisar 584 bp, hal ini menandakan bahwa proses amplifikasi dari DNA bakteri E.
coli berhasil teramplifikasi. Sedangkan pada sumuran yang lain yang tidak tampak adanya
hasil pita DNA hal tersebut bisa terjadi dikarenakan konsentrasi DNA cetakan yang terlalu
rendah sehingga tidak akan menghasilkan amplifikasi, adapun faktor lainnya yaituDNA
cetakan terdegradasi akibat freezing dan thawing sehingga ukuran fragmen DNA menjadi
sangat pendek ataupun bisa juga karena terjadinya amplifikasi non spesifik (Weising dkk.,
2005).
Uji Kuantitatif DNA Darah
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA
yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel
atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode
freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi dkk., 2005). Cara lain yaitu dengan kimiawi
maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti menggunakan
detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran
sel (Surzycki,2000). Sedangkan penghancuran sel secara enzimatik menggunakan proteinase
K untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia dkk., 2007) serta mendegradasi
protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown,2010; Surzycki,2000).
Isolasi DNA dari darah dilakukan dengan teknik yang lebih modern atau disebut dengan
teknik KIT. Kelebihan dari penggunaan metode KIT adalah prosedur kerja yang simpel, proses
pengerjaan yang cepat, dan tidak menggunakan bahan kimia berbahaya seperti kloroform dan
memerlukan penanganan yang mudah. Metode KIT tersebut hanya memerlukan satu jenis
reagen dan dua kali inkubasi tanpa proses penggerusan dan sentrifugasi (University of
Queensland, 2003). Isolasi DNA pada darah menggunakan kit komersial instaGene matrix.
InstaGene matrix dinilai lebih efektif dan efisien baik tempat maupun waktu, memberikan hasil
cetakan DNA tidak kurang dari 1 jam, selain itu reagen yang digunakan tidak membutuhkan
banyak pelarut karena kit yang digunakan hanya memiliki satu reaksi. Komposisi dari
InstaGene matrix adalah chelex resin yang membantu dalam mengikat pengganggu dalam
proses PCR dan mencegah hilangnya DNA karena pengikatan DNA yang irreversibel. Tahap
isolasi DNA pertama-tama mengeluarkan DNA dari mitokondria atau nukleus dengan cara
melisiskan DNA dari kontaminan yang lain. Lalu tahap selanjutnya ditambah dengan aquades
1 mL, yang berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan mendapatkan konsentrasi yang
tinggi. Selanjutnya divortex hingga homogen, kemudian dilakukan sentrifugasi untuk
memisahkan DNA dari presipitat berupa protein. Setelah proses sentrifugasi selesai, langkah
berikutnya adalah menambahkan 100μL InstaGene matrix lalu diinkubasi pada suhu 56o C
selama 30 menit. Suhu inkubasi yang terlalu tinggi akan mengakibatkan DNA menjadi
terdenaturasi sedangkan di suhu yang rendah mengakibatkan membran serta jaringan sel tidak
dapat hancur(Yanti, 2017). Pemberian buffer TE saat isolasi di suhu -20oC berfungsi untuk
menjaga DNA agar tidak rusak dan dapat disimpan selama berminggu-minggu (Verkuil dkk.,
2008), serta memisahkan antara RNA dengan berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA
sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan dapat disimpan dalam
waktu yang lama. Penyimpanan di suhu -20oC bertujuan agar DNA toidak mudah terdegradasi
(Andayani, 2008).
Berdasarkan hasil uji kuantitatif, didapatkan konsentrasi terbesar, terdapat pada
kelompok 4 yaitu 185 μg/mL dan konsentasi terkecil pada kelompok 3 yaitu 135 μg/mL.
Konsentrasi DNA berpengaruh pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi yang
teralu rendah akan menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau tidak terlihat secara
visual , sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi menyebabkan fragmen terihat tebal sehingga
sulit dibedakan satu fragmen dengan fragmen lainnya. Nilai dengan panjang gelombang 280
nm menandakan adanya kontaminan DNA. Sedangkan panjang gelombang 260 nm
menyatakan nilai DNA yang diserap oleh panjang gelombang 260 nm. Sehingga tinggi
rendahnya nilai panjang gelombang 260 nm akan sangat berpengaruh terhadap nilai konsentrasi
dan juga kemurnian DNA. Nilai konsentrasi DNA yang tinggi bukan berarti kemurnian yang
diperoleh juga tinggi. Hal ini didasarkan bahwa nilai kemurnian DNA dipengaruhi oleh nilai
Å280 atau nilai kontaminan (Iqbal,2016).
Hasil kemurnian isolasi DNA darah didapat dengan kisaran nilai antara 1,12-1,94. Hasil
isolasi DNA dikatan murni jika memiliki nilai rasio λ260/λ280 antara 1,8 sampai 2,0. Jika nilai
kurang dari 1,8μg/mL, maka dikatakan bahwa isolat DNA yang dihasilkan terdapat kontaminan
berupa fenol sedangkan pada nilai absorbansi 230 nm menunjukan kontaminasi yang berasal
dari komponen sel yang tidak lisis selama prosses pengerjaan ekstraksi DNA (Pratama, 2015).
Sedangkan jika nilai rasio lebih dari 2,0 maka isolat DNA masih terkontaminasi oleh senyawa
berat molekul kecil, misalnya protein membran dan adanya kontaminasi senyawa berat dengan
molekul kecil seperti RNA sehingga diperlukan purifikasi dengan RNAse. Hasil isolat DNA
darah dari keenam kelompok , nilai kemurniannya berada di bawah batas normal, yaitu <1,8.
Hal ini menandakan, bahwa isolat DNA yang dihasilkan menunjukkan adanya kontaminan
fenol dan pelarut yang digunakan terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit.
Menurut Komalasari (2009), banyak sedikitya DNA yang dihasilkan dipengaruhi oleh
beberapa faktor saat proses ekstraksi DNA dan penambahan lisis buffer. Pada saat ekstraksi,
kecekatan termasuk faktor yang paling berpengaruh karena pada tahap lisis sel dan presipitasi
pengambilan supernatan dilakukan per sampel sehingga pada beberapa sampel telah terjadi
pengendapan.

Uji Kualitatif DNA Darah


Uji kualitatif DNA pada darah dilakukan dengan menggunakan metode elektroforesis
horizontal gel agarosa. Uji kualitatif DNA diawali dengan memasuki sampel DNA ke sumuran
gel yang ditempatkan didalam larutan penyangga dan dialiri arus listrik dengan kutub yang
terpisah antara sisi satu dengan sisi yang lainnya (Hapsari,2012). Molekul DNA yang
bermuatan negatif pada rangka gula fosfat akan bermigrasi menuju elektroda positif.
Bahan-bahan yang digunakan dalam proses elektroforesis adalah buffer TAE, dan
loading dye. Buffer TAE (Tris-HCl, asam asetat, EDTA) berfungsi sebagai penyangga dan
media penghantar listrik yang baik. Muatan listrik yang berada pada larutan TAE akan
membawa fragmen-fragmen DNA bergerak melalui matriks-matriks pada gel agarosa. DNA
dengan fragmen pendek akan bermigrasi lebih jauh dibanding DNA dengan fragmen panjang
(Ardhana, 2011). Loading dye berfungsi untuk menambah densitas DNA, sehingga DNA akan
berada di dasar sumuran. Loading dye mengandung pewarna bromphenol blue untuk
memudahkan meletakkan sampel DNA kedalam sumur. Selain itu, loading dye dapat bergerak
ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan (Hapsari,2012).
Sumuran ke 7 pada hasil elektroforesis berupa marker atau DNA Ladder. Marker
merupakan segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk
mengetahui ukuran DNA dari hasil amplifikasi. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen DNA
marker (Nugroho dan Rahayu, 2016). Sumuran lainnya berisi sampel DNA darah yang tidak
diberi perlakuan apapun. Hasil yang di dapat terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari
oleh sinar UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali. Hal yang
menyebabkan genom sampel tidak bermigrasi kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya
penyimpanan untaian DNA setelah isolasi, serta terdapatnya kontaminan yang membuat uji
amplifikasi menjadi tidak spesifik. Kontaminan berukuran sangat kecil sehingga tidak terlihat
dalam hasil gel elektroforesis. Menurut Fabre dkk (2017) ukuran DNA leukosit adalah sekitar
20 kbp.
Uji Kuantitatif DNA Mukosa Pipi
Isolasi DNA genom melalui mukosa pipi dapat dilakukan sebab bagian ini merupakan
sel epitel yang mengandung inti, dimana setiap sumber bahan biologis yang memiliki inti maka
dapat dijadikan sumber isolasi DNA, contoh lainnya misalnya seperti darah, akar, rambut,
tulang, dan lain-lain (Siswanto dkk, 2016). Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam
indentifikasi molekuler. Percobaan ini dilakukan dengan mengisolasi DNA mukosa pipi. Pada
proses isolasi DNA mukosa pipi dilakukan penambahan instagene matrix yang merupakan kit
yang berfungsi untuk memudahkan proses isolasi DNA sehingga proses isolasi berlangsung
cepat dan praktis. Selain itu terdapat juga penambahan Phosphate Buffered Saline (PBS) yang
berfungsi untuk menjaga kondisi pH pada proses isolasi DNA agar keadaannya tetap stabil.
Keberhasilan isolasi DNA mukosa pipi diuji melalui proses uji kuantitatif DNA.
Pengujian ini dilakukan guna mengetahui kemurnian hasil isolasi DNA dari mukosa pipi. Uji
kuantitatif DNA dilakukan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 260
nm dan 280 nm. Prinsip dasar pada spektrofotometri ialah sampel harus jernih dan larut
sempurna. DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV.
Hal inilah yang membuat DNA dapa menyerap cahaya pada panjang gelombang 260 nm,
sedangkan kontaminan protein ataupun fenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Perbedaan
dalam penyerapan cahaya inilah yang membuat kemurnian DNA dapat diukur dengan
menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (Harahap, 2017).
Menurut Fatchiyah (2011) nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0.
Dari hasil pengukuran kemurnian DNA mukosa pipi diperoleh nilai yang berkisar
antara 1,4-1,8. Dari keenam sampel yang ada menunjukkan hanya ada satu sampel yang murni,
dan lima lainnya mengalami kontaminasi. Menurut Putranto dkk (2006) mengemukakan bahwa
nilai kemurnian DNA yang <1,8 menunjukkan adanya kontaminan seperti protein, sedangkan
yang memiliki nilai >2,0 menunjukkan adanya kontaminan seperti RNA. Kemudian
konsentrasi yang dihasilkan berkisar antara 40-80 µg/mL. Konsentrasi terbesar dimiliki oleh
sampel mukosa kelompok 4 dan terkecil dimiliki oleh kelompok 5. Konsentrasi DNA akan
berpengaruh pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi yang terlalu rendah akan
menghasilkan fragmen yang sangat tipis pada gel atau tidak terlihat secara visual, sedangkan
konsentrasi yang terlalu tinggi menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan
antara satu fragmen dengan fragmen lainnya (Haris dkk, 2003).
5. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan didapatkan kesimpulan bahwa
isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti (protein,
lemak, karbohidrat) serta DNA dapat ditemukan di kromosom inti maupun di organel. Prinsip
utama dalam isolasi DNA ada tiga, yakni penghancuran, ekstraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat, serta pemurnian DNA. Berdasarkan hasil uji kuantitatif DNA kapang didapatkan
rasio kemurnian berkisar antara 1,247 - 1,317 dengan konsentrasi terbesar terdapat pada
kelompok 4 yaitu 480 μg/mL, uji kuantitatif DNA tanaman didapatkan rasio kemurnian
berkisar 1,041 – 2,094 dengan konsentrasi terbesar terdapat pada kelompok 2 yaitu 8430
μg/mL, uji kuantitatif DNA bakteri didapatkan rasio kemurnian berkisar 1,52 – 1,623 dengan
konsentrasi terbesar terdapat pada kelompok 6 yaitu 745 μg/mL, uji kuantitatif DNA darah
didapatkan rasio kemurnian berkisar 1,12 – 1,192 dengan konsentrasi terbesar terdapat pada
kelompok 4 yaitu 185 μg/mL, uji kuantitatif DNA mukosa didapatkan rasio kemurnian
berkisar 1,5 – 1,571 dengan konsentrasi terbesar terdapat pada kelompok 4 yaitu 80 μg/ml.
Konsentrasi DNA berpengaruh pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Kemurnian DNA rata-
rata memiliki nilai yang kurang atau melebihi rasio angka 1,8-2,0 yang menandakan
terdapatnya kontaminan di dalam DNA. Konsentrasi yang terlalu rendah akan menghasilkan
fragmen yang sangat tipis pada gel atau tidak terlihat secara visual, sedangkan konsentrasi
yang terlalu tinggi menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara satu
fragmen dengan fragmen lainnya. Uji elektroforesis atau uji kualitatif dilakukan untuk
mengetahui kualitas DNA hasil isolasi serta ukuran DNA tersebut.
6. DAFTAR PUSTAKA
Adzima, V. (2013). Isolasi dan Identifikasi Kapang Penyebab Dermatofisis. Jurnal Medika.
Vol. 4, No. 2, Hal. 158-169.
Ali, B.A., T.H. Huang, H.H. Salem, & Q.D.Xie. (2006). Influence of Thermal Cycler Day-to-
day Reproducibility of Random Amplified Polymorphic DNA
Fingerprints. Biotechnology 5:324 – 329.
Andayani, P.A. (2008). Isolasi Dan Identifikasi Mikroba dari Tempe Sorgum Coklat (Sorghum
bicolor) Serta Potensinya dalam Mendegradasi Pati dan Protein. Jurnal Teknologi
Pertanian. Vol.9, No. 2, Hal. 95-105.
Ardiana, D.W. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman papaya dan jeruk dengan
menggunakan modifikasi buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian 14(1): 12-16.
BIO-RAD. 2015. Safety Data Sheet. OSHA HCS.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field gel electrophoresis: a practical guide. Academic Press,
Inc., San Diego.
Brown, T.A. (2010). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Edisi ke-6. New York
: Chapman and Hall.
Case, R.J., Y. Boucher, I. Dahllöf, C. Holmström, W.F. Doolittle, & S. Kjelleberg. (2007). Use
of 16S rRNA and rpoB Genes as Molecular Markers for Microbial Ecology Studies.
Applied and Environmental Microbiology, 73: 278–288.
Corkill, G., Rapley, R. (2008). The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and
Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook. (edisi kedua). USA: Humana Press,
NJ.
Coyne, Mark S. (1999). Soil Microbiology : An Exploratory Approach. USA : Delmar
Publisher Mine Coins.
Donata. 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta
kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.Erlangga. Jakarta.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow.
12(1):13-15.
Dellman,H.D dan E.M.Brown. (1989). Buku Teks Veteriner I. Terjemahan : R. Hartanto,
Universitas Indonesia Press. Jakarta.
Edy, Jo Siswanto.,Berlian, Tiara., Putricahya, Evira., Panggalo, V Lidya., Yuniani, Luluk.
(2016). Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi Penderita ROP
: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks Kemurnian. Sari Pediatri. Vol 18, No.4,
Hal. 270-277.
Farrel, R.E. 2004. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and
Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-705.
Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurusan Pendidikan Biologi FKIP,
Universitas Muhammadiyah Surakarta. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, Vol. 10,
No. 1, 2009:61-67.
Fabre, A.L., Colotte,M., Luis, A., Tuffet, S., Bonnet, S., and Henerberg, P. (2017). High DNA
Stability in White Blood Cells and Buffy Coat Lysates Stored At Ambient Temperature
Under Anoxic and Anhydrous Atmosphere. PLOS One. Vol 12,No.11.
Fardiaz, M. (2002). Biofermentasi dan Biosintesa Protein. Angkasa, Bandung.
Fatchiyah, Arumingtyas Laras. E, Widyarti Sri, dan Rahayu Sri. (2011). Biologi Molekular
Prinsip Dasar Analis. Erlangga. Jakarta.
Giacomazzi, S., Lerol, F., Joffraud,J.J. (2005). Comparison of Three Methods of DNA
Extraction from Cold-smoked Salmon and Impact of Physical Treatments. Journal of
Applied Microbiology.
Guple, S. (2000). Mikrobiologi Dasar. Binarupa Aksara, Jakarta.
Hadioetomo, R.S. (1993). Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. Gramedia Pustaka Utama : Jakarta.
Harini, S.S., M. Leelombik, M.N.S.Kameshwari, & N.Sathyanarayana. (2008).Optimization of
DNA Isolationand PCR-RAPD Methods forMolecular Analysis of Urgineaindica
Kunth. International Journal of Integrative Biology 2:138 – 144.
Hairinsyah, (2010). Pendugaan parameter genetik dan analisa keragaman genetik kelapa sawit
(Elaeis guineensis Jacq) dengan marka Simple Sequence Repeat (SSR). IPB. Bogor.
Available at http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/ 46891.
Handoyo, D. & R. Ari. (2001). Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction
(PCR). PCR 9: 17-28.
Hapsari, Rizki.(2012). Uji Kuantitatif dan Kualitatif DNS Pule Pandsak (Rauvolfia serpentina
L.). Skripsi. Program Sarjana. Universitas Sebelas Maret. Surakarta.
Harahap, A. S. (2017). Uji Kualitas dan Kuantitas DNA Beberapa Populasi Pohon Kapur
Sumatera. Journal of Animal Science and Agronomy Panca Budi. Vol 2, No. 2.
Haris, N., Hajrial. A., Nurulita, T. M., Agus, P. (2003). Kemiripan Genetik Klon Karet (Hevea
brasiliensis Muell Arg.) Berdasarkan Metode Amplified Fragment Length
Polymorphisms (AFLP). Menara Perkebunan 71(1), 1-15.
Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California.
Hal. 491Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12:
13-15.
Hidayati. Aulawi, T. Widiyati, Y. 2016. Uji Kualitatif dan Kuantitatif Hasil Isolasi DNA dari
Darah, Feces dan Urine Pada Ternak Sapi, Kerbau dan Kambing. Researchgate.
Holme, D.J and Hazel, P. (1998). Analytical Biochemistry. England : Pearson Education
Limited.
Iqbal ,M., I.D. Buwono., dan N, Kurniawati. Analisis Perbandingan Metode Isolasi DNA untuk
Deteksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada Udang Vaname (Litopenaeus
vannamei). Jurnal Perikanan Kelautan Vol 7, No.1, Hal. 54-65.
Janda, M.J, and Abbott, S.L. (2007). 16SrRNA Sequencing for Bacterial Identification in the
Diagnostic Laboratory; Pluses, Perils, and Pitfalls, Microbial Diseases Laboratory,
Division of Communicable Disease Control, California department of Public Health,
Richmond, California Journal of Clinical Microbiology :94804,
Jeewon, R., Itto, J., Mahadeb, D., Jaufeerally, Y., Kai Wang, H., & Rong Liu, A. (2013). DNA
Based Identification and Phylogenetic Characterisation of Endophytic and Saprobic
Fungi
From Antidesma madagascariense, a Medicinal Plant in Mauritius. Journal of Mycology
: 1-10.
Joko, T., Kusumandari, N., & Hartono, S. (2011). Optimasi Metode PCR untuk Deteksi
Pectobacterium carotovorum_, Penyebab Penyakit Busuk Lunak Anggrek. Jurnal
Perlindungan Tanaman Indonesia, 17(2) : 54–59.
Khosravinia,H. Dan Ramesha, K.P. (2007). Influence of EDTA and Magnesium on DNA
Extraction from Blood Samples and Specificity of Polymerase Chain Reaction. African
Journal of Biotechnology. Vol 6,No. 3, Hal. 184-187.
Komalasari, K.(2009). Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer Serta
Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk DNA pada Sapi Frensian Holstein
(FH). Skripsi. Bogor : Institut Pertanian Bogor.
Kusnadi. (2003). Mikrobiologi. UYM Press :Yogyakarta.
Martida, V dan Pharmawati, M. (2016). Pemilihan Primer Rapd ( Random Amplified
olymorphic DNA) Pada PCR ( Polymerase Chain Reaction) Tanaman Kamboja (
Plumeria sp.). Simbiosis, 4(1):16-18.
Medici, L., Croci, E., Delibato, S.D. Pasquale, E. Filetici, L, Toti, (2003) Appl. and
Environmental Microbiol. 69:3456.
Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pusataka Wirausaha Muda. Bogor
Murray, R.K.(2014). Biokimia Harper, Edisi ke-29. Jakarta : ECG Penerbit Buku Kedokteran.
Nicholl DST.(2002). An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge : Cambridge
University Press.
Nugroho, E.D., Rahayu, D.A. (2016). Penentuan Praktikum Bioteknologi. Yogyakarta :
Deepublish.
Nurwati, L., & Nawfa, R. (2015). Identifikasi Spesies Isolat Bakteri Galur D dengan Metode
Analisa Sekuen Fragmen Gen 16SrDNA. J. Sains dan Seni ITS, 4(2) : 2337-3520.
Padmalatha, K. & M.N.V . Prasad. (2006). Optimization of DNA Isolationand PCR Protocol
for RAPD Analysis of Selected Medicinaland Aromatic Plants of Conservation
Concern from Peninsular India. African Journal Biotechnology 5: 230 – 234.
Pelczar, M. (2002). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djembatan, Jakarta.
Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada grevillea spp.
(Proteaceae). Jurnal Biologi 13(1): 12-16.
Pierce A, Neil R. At a glance ilmu bedah. Alih bahasa. Umami V. Jakarta: Erlangga, 2007: 85.
Pratama, P.(2015). Aplikasi Real-Time PCR untuk Mendeteksi Bakteri Salmonella sp. pada
Hasil Perikanan. Skripsi. Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perkanan dan
Ilmu Kelautan, Institust Pertanian Bogor , Bogor.
Putranto, R. A., Santoso, J., Panji, T., Suharyanto., Budianai, A. (2006). Karakterisasi Gen
Penyandi Lipase dari Kapang Rhizopus oryzae dan Absidia corymbifera. Menara
Perkebunan 74(1), 23-31.
Radji, M., Puspaningrum, A., & Sumiati, A.(2010). Deteksi Cepat
Bakteri Escherichia coli dalam Sampel Air Dengan Metode Polymerase Chain Reaction
Menggunakan Primer 16E1 Dan 16E2. MAKARA SAINS VOL. 14, NO.1: 39-43.
Ratchtrachenchai, S. Subpassu, H. Hayashi, W. Ba-Thein, J. (2004) Medical Microbiol.
53:237.
Restu M, Mukrimin dan Gusmiaty. (2012). Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA
Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkan
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). J. Natur. Indonesia.
Ribeiro RA, Lovato MB. 2007. Comparative analysis of different DNA extraction protocols in
fresh and herbarium specimens of the genus Dalbergia. Genet. Mol. Res. 6: 173-187.

Russel P.J. (1990). Genetics. Edisi ke-2. Ilinois : Scott, Foresman and Company.
Siswanto, J. E., Berlian, T., Putricahya, E., Panggalo, L. V., Yuniani, L. (2016). Isolasi DNA
pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi Penderita ROP: Perbandingan
Hasil Uji Konsentrasi dan Indeksi Kemurnian. Sari Pediatri. Vol. 18, No. 4.
Sumarsih, S. (2003). Mikrobiologi Dasar. Universitas Pembangunan Nasional Veteran,
Yogyakarta.
Suryo. 2004. Genetika. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta.
Surzycki,S. (2000). Basic Techniques in Molecular Biology. Germany : Springer Verlag Berlin
Heidelberg
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme
Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen
Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1.
Teare, J.M. et al. (2009). Measurement of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa
QuantTM and the GenequantTM. BioTechniques., 22(6):1170-1171.
Thermo Scientific. 2009. Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook : Featuring
Cell Lysis Reagent and Detergents Vol. 11, No.8.
Varela, A.M., and A. Seif, 2004. A Guide to IPM and Hygiene Standards in Okra Production
in Kenya. ICIPE. Kenya.
Verkuill, E.V.P., Alex Van B., and Joh, P.H. (2008). Principles and Technical Aspect of PCR
Amplification.
Waluyo, L. (2007). Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
Weising, K., H. Nybom, K. Wolff, and G.Kahl. (2005). DNA Fingerprinting in Plants:
Principles, Methods, and Applications. Second Edition. Taylor & Francis Group.
BocaRaton.
Yanti, L. (2017). Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi
Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). Skripsi. Jakarta : Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan.
Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Penerbit Erlangga
Yusuf A. 2010. Teknologi Budaya padi sawah. SLPTT.BPPT. Sumut.
Zainuddin, A. (2009). Cemaran Kapang Pada Pakan dan Pengendaliannya. Jurnal Litbang
Pertanian. Vol. 28, No. 1, Hal. 15-22.
Zubaidah. 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten
Deinococcus radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir.
Bandung.