ENUMERASI BAKTERI

I.PENDAHULUAN
Proses pemisahan mikroba dari makhluk hidup lainnya dikenal dengan istilah isolasi.Mikroba dapat di
isolasi dari berbagai sumber,seperti: tanah,air,udara,makanan,makhluk hidup dan lain-lain.
Adapun cara pengujian mikroba di laboratorium,yg pertama perlu dilakukan adalah pembuatan
suspense/pengenceran dari sejumlah sampel dengan berbagai tingkatan.Tujuan dari pengenceran adalah
untuk mendapatkan jumlah koloni pada media padat yg dapat dihitung jika dilakukan dalam tempat
terbatas,sehingga koloni tidak terlalu menumpuk (crowded).
Isolat murni dapat diperoleh,bila dilakukan isolasi secara bertahap menggunakan media yg tepat,missal :
Nutrient Agar untuk bakteri dan Potato Dextrose Agar untuk mengisolasi khamir dan kapang.Setiap
pertumbuhan kolono yg menunjukan kenampakan berbeda harus ditumbuhkan ulang pada media agar
baru dan dilakukan isolasi kembali (reisolasi).

II.TUJUAN
-Untuk mengetahui metode isolasi mikroba dengan beberapa metode (Streak Plate,Pour Plate,Spread
Plate).
-Untuk melakukan berbagai Teknik transfer kultur secara aseptis.

III.DASAR TEORI
Isolasi adalah proses/kegiatan untuk memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapatkan kultur
murni.Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa
mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari
suatu kultur bakteri secara kuantitatif.
A.Pembuatan Suspensi/Pengenceran
Terdapat perbedaan untuk menyiapkan sampel padat dan cair.Apabila sampel padat,sampel harus
dilarutkan terlebih dahulu kedalam aquades steril ataupun pelarut lain sesuai tujuan penumbuhan
mikroba.
B.Penanaman Kultur
Metode Cawan Gores (Streak Plate)
Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga
mempermudah proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril yang telah
disiapkan diletakkan pada sumber isolat , kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi
media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose disterilkan
lagi dengan api bunsen. Setelah kering, ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya
pada sisi cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.

Metode Cawan Sebar (Spread Plate)

Teknik spread plate (cawan sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di
dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau menghapuskannya di atas media
agar yang telah memadat, sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belom
memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian
permukaan agar.

Metode Agar Tuang (Pour Plate)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat dan dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan
petri dan dihomogenkan lalu dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebabkan sel-sel bakteri tidak hanya
terdapat pada permukaan agar saja tapi juga di dalam atau dasar agar sehingga bisa diketahui sel yang
dapat tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak
mengandung O2. Prosedur kerjanya adalah petridish, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media
padat yang masih cair disiapkan. Kemudian 1 ml suspensi bakteri diteteskan secara aseptis ke dalam
cawan kosong· Lalu medium yang masih cair dituang ke dalam petridish lalu petridish di putar
membentuk angka 8 agar suspensi bakteri dan media homogen, kemudian diinkubasi.
Pada spread plate diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml dan pada pour plate diteteskan sebanyak 1 ml
karena spread plate bertujuan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour
plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari
pada spread plate.
IV.ALAT dan BAHAN
Alat Bahan
-Botol Kaca - Sampel Air
-Mikro Pipet -Sampel Kultur pada media padat
-Petridis -Aquadest
-Tabung Reaksi -Media PCA
-Lampu Spiritus -E.Coli
-Kawat Ose
-Inkubator
-Vortex
-Batang L

V.PROSEDUR KERJA
A.Strake Plate
1.Diaseptis terlebih dahulu cawan petri (2 cawan petri).
2.Dituangkan PCA sambil di aseprtis.
3.Didinginkan,ditunggu sampai PCA beku.
4.Diberi garis ,T dan 5 sisi pada cawan petri.
5.Dipanaskan Ose lalu didinginkan.
6.Dicelupkan Ose kedalam sampel E.Coli dan di goreskan ke PAC beku dalam cawan petri tersebut
sesuai garis T.
7.Diulangi pada cawan petri yg 5 sisi.
8.Diinkubasi selama 24 jam pada incubator.

B.Pour Plate
1.Diambil sampel air sumur sebanyak 1 ml.
2.Dimasukan kedalam tabung reaksi yg sudah berisi Aquadest sebanyak 9 ml (tabung reaksi pertama
dengan pengenceran 10 -1).
3.Diaduk/Dikocok dengan alat Vortex selama 5 Detik.
4.Diambil sampel tabung pertama sebanyak 1 ml lalu dituang kedalam cawan petri pertama.
5.Ditambahkan PAC cair kedalam cawan petri pertama lalu diaduk perlahan membentuk huruf S.
6.Diambil sampel ditabung reaksi pertama sebanyak 1 ml lalu dituang kedalam tabung reaksi ke 2.
7.Diaduk kembali menggunakan Vortex.
8.Diambil sebanyak 1 ml,dituang kedalam cawan petri yg kedua.
9.Dituang PAC cair kedalam cawan petri yg kedua,lalu diaduk membentuk S.
10.Dilakukan kembali pada tabung reaksi ke 3,4,5.
11.Disimpan agar koloni/mikroba di dalam inkubator.

C.Spread Plate
1.Diaseptis cawan petri terlebih dahulu.
2.Dituang PAC dan ditunggu dingin lalu dibekukan.
3.Diambil sampel didalam tabung reaksi pour plate ke 5 sebanyak 1 ml,lalu dituang dalam cawan petri
berisi PAC beku tadi.
4.Diratakan/Disebar dengan menggunakan Batang L lalu ditutup dan diinkubasi selama 24 jam pada
inkubator.

VI.HASIL PENGAMATAN
A.Strake Plate
Dari hasil penggoresan pada agar (PCA) dilakukan kurang merata,sehingga tumbuh sebanyak 2 koloni.
B.Pour Plate
NO Pengenceran Jumlah Koloni
1 10-1 101
2 10-2 50
3 10-3 80
4 10-4 62
5 10-5 20

Sampel Pengenceran Koloni CFU/gr

10-3 10-5 103 105
1 80 20 80 x 103 20 x 105 80 x 103

-Pada pengenceran 10-1 didapatkan koloni sebanyak 101.

-Pada pengenceran 10-2 didapatkan koloni sebanyak 50.
-Pada pengenceran 10-3 didapatkan koloni sebanyak 80.
-Pada pengenceran 10-4 didapatkan koloni sebanyak 62.
-Pada pengenceran 10-5 didapatkan koloni sebanyak 20.

C.Spread Plate
Pada pengenceran ini,bakteri yg ditanam adalah bakteri hasil pengenceran 10-5 yg ditanam pada media
PCA didapatkan sebanyak 10 Koloni.