LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI

TEKNIK-TEKNIK DASAR MIKROBIOLOGI

KELAS A2C

NAMA KELOMPOK:

1. A.A. Ayu Nintya Diva Cahya (171200195)

2. Cening Intan Sri Delvy (171200196)
3. Dewa Ayu Pradnya Dewi (171200197)
4. Gede Agus Erawan (171200198)
5. Gusti A Ag Delia Paramitha W (171200199)
6. I Gusti Ngurah Adi Prayoga (171200200)
7. I Kadek Surya Pradnya Putra (171200201)
8. I Komang Darma Santikayana (171200202)
9. I Made Putra Gangga (171200203)
10. I Nyoman Angga Wisnu Wardhana (171200204)

PROGRAM STUDI FARMASI KLINIS

INSTITUT ILMU KESEHATAN

MEDIKA PERSADA BALI

DENPASAR

2018
 PRAKTIKUM II
TEKNIK-TEKNIK DASAR MIKROBIOLOGI

I. TUJUAN
1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media
untuk pertumbuhan mikroba.
2. Mempelajari teknik-teknik pemindahan mikroba secara aseptis.
3. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.

II. DASAR TEORI

Dalam melakukan diagnosa Mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan baik alat

maupun medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau bahan bebas dari mikroba
baik dalam bentuk vegetative maupun spora. Untuk itu sebagai pemula dalam Mikrobiologi
sangat perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman
(Dwidjoseputro, 1994).
Secara umum sterilisasi merupakan proses pemusnahan kehidupan khususnya
mikroba dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium. Sterilisasi dalam Mikrobiologi
adalah suatu proses untuk mematikan semua mikroorgansime yang terdapat pada atau
didalam suatu benda. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu
penggunaan panas, penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas
digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa
kelembaban maka disebut sterilisasi kering (Dwidjoseputro, 1994).
Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat
yang disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum digunakaan harus dalam
keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan agar mikroba
dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan baik di dalam medium, maka diperlukan syarat
tertentu yang diantaranya bahwa didalam medium harus terkandung semua unsur hara yang
diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba kemudian susunan makanannya,
tekanan osmosis, derajat, keasaman (pH), dan temperatur (Hadietomo, 1990).
Dalam bidang penelitian mikroorganisme ini, tentunya menggunakan teknik atau
cara-cara khusus untuk mempelajarinya dan bekerja pada skala laboratorium untuk meneliti
mikroorganisme ini baik sifat dan karakteristiknya, tentu diperlukan pula tentang bagamana
caranya menumbuhkan suatu mikroba ke dalam suatu media, karena kita tahu bahwa
beragamnya persyaratan tumbuh mikroba, maka harus dimengerti jenis-jenis nutrient yang
disyaratkan oleh mikroba dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi yang
optimum bagi pertumbuhannya. Mikroba amat beragam, baik dalam persyaratan nutrient
 maupun fisiknya. Jadi, media yang digunakan harus mengandung komponen-komponen
yang dibutuhkan oleh mikroba tersebut (Hadietomo, 1990).
Kebanyakan dari bakteri heterotrof dan jamur, seperti pada percobaan dalam
laboratorium sehari-hari, tumbuh pada media kompleks yang tersusun dari nutrisi termasuk
ekstrak khamir, daging atau tumbuhan atau sumber lain. Dalam media kompleks, energi,
nitrogen dan sulfur dibutuhkan organisme untuk tumbuh. Jika media kompleks berbentuk
cairan maka disebut media Nutrient Broth. Sedangkan ketika ditambah agar, maka disebut
media Nutrient Agar (Tortora et all, 2010)
Untuk memadatkan kultur media cair diperlukan agar yang mengandung ekstrak
polisakarida yang berasal dari alga. Media agar berbeda dengan gelatin. Pada media agar,
kemampuan bakteria untuk mendegradasi sangat kecil sehingga tidak akan rusak pada
temperatur yang tinggi. Agar akan mulai mengeras pada suhu di bawah 45⁰C, dan akan
berbentuk cair ketika suhunya di atas 45⁰C (Tortora et all, 2010)
Pada suhu yang terlalu tinggi, nutrisi yang terkandung dalam agar akan mengalami
kerusakan. Untuk mengatasinya dapat dilakukan dengan menambah nutrisi pada suhu yang
rendah sebelum agar mengeras. Jika agar dipanaskan pada suhu di atas 45⁰C, maka agar
akan berubah wujud menjadi cair (Tortora et all, 2010).
Hal ini berbeda dengan gelatin yang dapat mencair pada suhu 37⁰C. Pada suhu
ruangan, agar akan tetap menjadi padat sehingga mikroba yang telah ditanam dapat tumbuh
dan koloni dapat menempel pada media agar. Karena agar bersifat bening dan tembus
cahaya, maka pengamatan dapat dilakukan dengan mudah (Tortora et all, 2010).
Media adalah suatu substrat makanan yang mengandung unsur-unsur makanan yang
diperlukan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Unsur-unsur makanan dapat berupa:
garam-garam anorganik dan senyawa-senyawa organik seperti protein, pepton, aseton, asam
amino, vitamin. Kultur media adalah bahan-bahan nutrien yang disediakan untuk
menumbuhkan mikroorganisme didalam laboratorium. Kultur adalah mikroorganisme yang
tumbuh dan berkembang biak pada suatu kultur media ( Tarigan, 1988 ).
Syarat-syarat medium supaya mikroba dapat tumbuh biak:
a. Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakanoleh mikroba.
b. Medium harus mempunyai tekanan osmose, tegangan muka, pH.
c. Medium tidak mengandung zat-zat penghambat.
d. Medium harus steril ( Jutono,dkk, 1980 ).

Adapun macam - macam media Pertumbuhan antara lain (Pelczar, 1986) :

1. Medium berdasarkan sifat fisik

a. Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media
menjadi padat..
b. Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi
sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan
 supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami
percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB
(Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan
dibawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah
hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya
pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan
metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
c. Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient
Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
a. Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
b. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti,
misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak
kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang
komposisi senyawa penyusunnya.
c. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat
diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya
Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan untuk isolasi
a. Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya
Nutrient Broth, Blood Agar.
b. Media selektif/penghambat. Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu
zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani
medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan
menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4%
untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
c. Media diperkaya (enrichment). Media diperkaya adalah media yang mengandung
komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti
darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba
tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi
sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya
Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.
d. Media untuk peremajaan kultur. Media umum atau spesifik yang digunakan untuk
peremajaan kultur
e. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.. Media ini digunakan unutk
mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s
 Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat
sebagai sumber karbon.
f. Media untuk karakterisasi bakteri. Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan
spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan
adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
g. Media diferensial. Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari
campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,
misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling
koloni.
Untuk memindahkan kultur murni bakteri, dapat dilakukan dengan beberapa metode,
antara lain Streak Plate Method atau metode gores, Spread Plate Method atau metode
sebar/tebar, dan Pour Plate Method atau metode tabur.
a. Streak Plate Method/ Cara Gores
Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar
sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya
ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan
medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan
akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga
dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980)
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang
memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan
lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang
benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994).

Gambar 1. Streak plate method secara goresan sinambung.

 Gambar 2. Streak plate method secara goresan T

Gambar 3. Streak plate method dengan lebih banyak sektor.

b. Spread Plate Method/ Cara Sebar atau Tebar
Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi
kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat.
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi
sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan
beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang
mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah
memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung (Jutono, dkk, 2010).

Gambar 4. Spread plate method

c. Pour Plate Method/ Cara Tabur
Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan
menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-
koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri,
sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980)
 Gambar 5. Pour plate method

Gambar 6. Contoh hasil isolasi Streak plate method.

Sebelum melakukan percobaan, alat-alat yang akan digunakan harus terbebas dari
segala bentuk kehidupan. Untuk itu perlu dilakukan proses sterilisasi. Sterilisasi merupakan
usaha untuk dapat membebaskan alat-alat atau bahan dari segala bentuk kehidupan. Ada
beberapa cara untuk melakukan proses sterilisasi, antara lain:
a. Sterilisasi dengan menggunakan panas, yang terdiri dari panas kering, pemijaran, panas
lembab, dan panas basah.
b. Sterilisasi dengan menggunakan panas basah dapat membunuh mikroorganisme karena
panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein pada bakteri sehingga bakteri mati.
Alat yang digunakan untuk pemanasan basah yaitu autoklaf.
c. Sterilisasi dengan menggunakan radiasi sinar UV dapat mengurangi mikroba di udara.
d. Selain itu sterilisasi juga dapat dilakukan dengan proses penyaringan. Lubang saringan
yang digunakan sebesar 0,22 μm. Tetapi penyaringan ini tidak bisa dilakukan pada
bahan dengan volume yang lebih besar dari 500 mL karena jika volume bahan melebihi
500 mL dapat menyebabkan proses sterilisasi dengan penyaringan menjadi lebih tidak
efektif.
e. Sterilisasi secara kimiawi dilakukan dengan menggunakan bahan kimia, seperti etanol
70% dan fenol. Alat-alat kecil yang berbahan dasar kaca dicelupkan ke dalam etanol
70% atau fenol kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.
III. ALAT DAN BAHAN
1. Media dan Cara pembuatan media
A. Alat
1) Cawan petri
2) Tabung reaksi
3) Batang pengaduk
4) Pipet volume
5) Erlenmeyer
6) Autoklaf
7) Penangas air
B. Bahan
1) Media Nutrien Agar(NA) (Oxoid)
2) Media Nutrien Broth(NB)(Oxoid)
3) Aquadest

2. Teknik – Teknik Aseptis

a. Alat
1. Jarum Ose
2. Jarum Inokulasi
3. Vortex Mixer
4. Lampu Bunsen
5. Microbial Safety Cabinet
b. Bahan
1. Media NA miring dalam tabung reaksi
2. Media NA tegak dalam tabung reaksi
3. Media NB dalam tabung reaksi
4. Kultur murni bakteri Streptococus pygones, Staphylococus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli dan Baccilus subtilis
5. Alkohol 70 % / Lysol

3. Teknik – Teknik Isolasi dan Inokulasi Kultur Mikroba

a. Alat
1. Spreader/ Batang Bengkok
2. Lampu Bunsen
3. Jarum Ose
4. Mikropipet
5. Tabung Reaksi
b. Bahan
1. Media NA dalam cawan petri
2. Kultur Murni Bakteri
3. Larutan pengencer (BPW atau Nacl Fisiologis 0,9 %)
4. Alkohol 70 %
IV. SKEMA KERJA
a. Pembuatan media

Ditimbang media NA (oxoid) dan NB (oxoid) sesuai dikemasan.(catatatan : buatlah 50 ml

media NA untuk setiap kelompok kecil pratiku dan 50 ml media NB untuk satu golongan
praktikum) penimbangan media dilakukan secara teliti, kemudian serbuk media dikmasukan
secara hati-hati kedalam Erlenmeyer.

Ditambahkan aquadest dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk.

Dipanskan dengan hati-hati menggunakan penangas atau elemen pemanas sampai media
tercampur homogen (ditujukan dengan warna yang kuning jernih). Perhatikan pada saat
pemansan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!)

Sebelum diautoklaf, tuangkan media NA dengan volume tetentu menggunakan pipet volume
5 ml kedalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml kedalam tabung reaksi untuk NA tegak,
dan sisanya diamkan dalam Erlenmeyer yang nantinya akan digunakan untuk NA dalam
cawan petri. Tutup tabung reaksi dan Erlenmeyer dengan penutup tabung atau kapas.

Sebelum di autoklaf, tuagkan NB kedalam tabung reaksi. Tutup tabung reaksi penutup
tabung atau kapas.

Disetrilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf
selama 15 menit, tekanan 1 atm suhu 121°C.

Setelah di autoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakan tegak pad arak tabung
dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasi miring dan biarkan memadat. Media sisa
NA tuangkan dalam cawan petri secara aspetis dan biarkan memadat.

Media NB dibiarkan mendingin.Seluruh media akan digunakan pada praktikum selanjutnya.

 b. Teknik-teknik aseptis

Disiapkan media NA dan NB ( media NA miring, media NA tegak dan media NB)
pemindahan kultur mikroba dilakukan satu-persatu untuk masing-masing media.

Dilonggarkan tutp tabung atau kapas dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media
(jangan dilepaskan !)

Dipegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri ditangan kiri.

Dipegang jarum ose pada tangan kanan dan bakar diatas nyala lampu Bunsen hingga kawat
memijar.Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung sampai memijar,
sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat kira-kira sekitar 30 detik!

Dipegang ose mengguanakan ibu jari dan jari telunjuk,digunakan jari kelingking untuk
membuka tutup tabung reaksi (tutup tabung reaksi tetap dipegang seperti posisi semula).

Dibakar mulut tabung reaksi,dimasukan jarum ose dan diambil 1 ose biakan bakteri.

Dibakar kembali mulut tabung reasksi dan tutup tabung reaksi kembali.

Ambilah tabung reaksi yang akan diinokulasi dengan tangan kiri,dengan cara yang sama
buka tutup tabung reaksi, dan bakar mulut tabung reaksi.

Diinokulasi biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara goresan zigzag pada
permukaan NA miring.

Dibakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose .
Diberi label : tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan dan nama kelompok.

Dilakukan dengan cara yang sama untuk media cair atau NB menggunakan jarum ose dan
media agar tegak secara tusukan tegak lurus menggunakan jarum inokulasi

Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.

 c. Teknik isolasi dan inokulasi kultur mikroba
1. Metode spread plate

Dibuat pengenceran 10-1 – 10-2 dari kultur murni bakteri dengan karutan pengencer.

Diambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher
tabung.

Dipindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara asetis kepermukaan media NA dalam cawan
petri.

Dibakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alcohol, biarkan dingin.

Tebarkan atau sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan
sampai permukaan agar mengering selama 10 menit.

Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasi secara terbalik pada suhu
37°C selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
2. Metode streak plate

Dipanaskan jarum ose hingga memijar diatas Bunsen, kemudian didinginkan.Digunakan ose
yang telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri. Ose
yang terlalu panas dapat menyebabkan kultur bakteri mati.

Sebelum penggoresan pastikan bahwa media NA telah mengering secara sempurna.

Diambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan ada permukaan media agar dimulai pada
satu ujung. Dilakukan teknik pengoresan dengan teknik kuadran.

Ose disentuhkan pada permukaan media agar cawan petri,sewaktu menggores ose dibiarkan
meluncur diatas permukaan agar. Jangan menggores terlalu keras sehingga dapat menggores
agar.

Setiap kali menggoreskan ose kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu dan biarkan
dingin.

Inkubasi secara terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam pada suhu kamar dan amati
pertumbuhannya.
3. Metode pour plate.

Didinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 – 500 C (cirinyna: terasa
hangat dikulit)

Dibuka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol.

Dipindahkan 1 ml kultur murni bakteri kedalam tabung reaksi yang mengandung NA

secara aseptis

Dibakar leher tabung diatas Bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung
kultur murni bakteri kedalam cawan petri.

Digoyangkan perlahan-lahan untuk mencmpur kultur bakteri dengan NA sampai

homogen. Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri
bisa diletakan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril).

Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam inkubasi
terbalik dilakukan setelah agar memadat. amati pertumbuhannya.
V. LEMBAR PENGAMATAN
I. Lembar pengamatan pembuatan media dan teknik aseptis

Media PENGAMATAN KETERANGAN

Sebelum Inokulasi Setelah Inokulasi
NA tegak

NA miring

NA cawan petri

NB
 II. Lembar Pengamatan Metode Inokulasi

Metode inokulasi Gambar Hasil Keterangan

Spread plate

Streak plate
(kuadran)

Pour Plate
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.

Hadioetomo, R. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Gramedia: Jakarta.

Jutono, dkk. 1980. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: UGM-Press.Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di

Laboratorium. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada.

Pelczar, M. 1986. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Indonesia.

Tarigan,J. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta: Ditjen Dikti.

Tortora, et all. 2010. Microbiology and Introduction. 10th ed. San Fransisco: Pearson Education, pp.

163-165.

Willey, J.M., Sherwood, L. 2008. Prescott, Harley, and Klien’s Microbiology. 7th., ed. New York:

McGraw-Hill. Pp. 114-115.