Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN

Volume 17 (3) 2005

AMOBILISASI ENZIM PENISILIN ASILASE DARI E. coli B1O4               
DENGAN POLIAKRILAMIDA 
 
Firman Sebayang 
Departemen Kimia FMIPA USU Medan

Abstrak
Penisilin asilase adalah merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis benzil penisilin menjadi asam
6-amino penisilanat (6-APA) dan asam fenil asetat. Isolasi enzim penisilin asilase menggunakan bakteri. E.coli
B1O4 sebagai sumber enzim intraseluler. E.coli B1O4 ditumbuhkan dalam medium fermentasi menurut
formula morita dan iwata dengan asam fenil asetat 0,2% sebagai induser. Sel dipecah dengan ultrasonikator
o
pada suhu 4 C. Ekstrak enzim dipisahkan dengan sentrifuga dan diikuti dengan pengendapan enzim dengan
menggunakan ammonium sulfat. Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan jumlah 6-APA yang dihasilkan dari
hidrolisis substrat benzil penisilin. 6-APA ditentukan berdasarkan metodekornfeld. Kadar protein ditentukan
dengan metodelowry. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim adalah 0,65 unit/mg protein dan setelah
pemurnian dengan amonium sulfat 20-60% aktivitas spesifik enzim meningkat menjadi 2,85 unit/mg protein
o
pada kondisi optimum pH 7,5 suhu 45 C dengan lama inkubasi 30 menit.
Amobilisasi enzim penisilin asilase dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung poliakrilamida.
Aktivitas spesifik enzim amobil adalah 2,70 unit/mg protein pada kondisi pH 7,5 dan suhu 45 oC dengan lama
inkubasi 30 menit. Bila dibandingkan aktivitas spesifik enzim penisilin asilase bebas dengan enzim amobil
terjadi penurunan aktivitas spesifik setelah diamobilisasi, namun demikian enzim penisilin asilase amobil lebih
menguntungkan karena dapat digunakan secara berulang.

Kata kunci: E. coli B104, Enzim penicilin, Asilase, Amobilisasi

A. PENDAHULUAN sifatnya lebih baik dari penisilin alam. Dari

Sampai saat ini penggunaan penisilin dan
derivatnya di Indonesia cukup tinggi dan
diperkirakan akan meningkat dari tahun ke
tahun. Penisilin alam dikenal sebagai
antibiotik yang secara kimia tidak stabil,
sehingga pada pemakaian penisilin untuk
tujuan medis sering ditemukan beberapa
kekurangan dalam pemakaiannya. Seperti
timbulnya gejala alergi, waktu paruh
dalam tubuh sempit, tidak tahan terhadap
asam dan beta-laktamase serta spektrum
kerjanya sempit.
Berdasarkan kenyataan ini perlu dilakukan
perbaikan sifat penisilin yaitu membuat
derivat penisilin-G sehingga diperoleh
penisilin semisintetik yang sifatnya lebih
efektif dan lebih bermanfaat. Pengembangan
penisilin baru dapat ditempuh dengan
jalan modifikasi spektrum kimia benzil
penisilin (penisilin-G) menjadi asam 6-
amino penisilanat (6-APA) dan merupakan
bagian inti penisilin.
6-APA ini merupakan prekursor pada
pembuatan penisilin semisintetik yang
6-APA dapat dihasilkan proposilin,
ampisilin, metesilin, oksasilin, kloksasilin,
karbenesilin, fenetesilin, dan sebagainya.
Sedangkan produksi antobiotik di
Indonesia masih sangat terbatas sehingga
harga antibiotik di pasaran cukup tinggi
akibatnya sulit dijangkau oleh masyarakat.
Terbatasnya produksi antibiotik di
Indonesia diperkirakan karena bahan baku
serta enzim yang terkait dalam produksi
antibiotik tersebut masih harus diimpor.
Untuk mengurangi ketergantungan akan
bahan baku dari luar negeri maka perlu
dilakukan upaya penelitian untuk
pemuliaan galur mikroba yang dapat
menghasilkan antibiotik.
Langkah awal yang dilakukan untuk
mengkonversi benzil penisilin menjadi
6-APA diperlukan enzim penisilin asilase.
Enzim penisilin asilase dapat dihasilkan
oleh beberapa jenis mikroba baik
termasuk jamur dan bakteri yang
diproduksi secara intraseluler maupun
ekstraseluler. Transformasi benzil penisilin
secara enzimatis menggunakan enzim

1
Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005

panisilin asilase dapat digambarkan permukaan melokul enzim. Gugus fungsi

sebagai berikut: inilah yang berikatan dengan gugus fungsi
bahan pedukung untuk membentuk ikatan
kovalen atau non kovalen.
Teknik amobilisasi enzim dapat dilakukan
dengan cara (1) cara fisik yang meliputi
teknik penjebakan (entrapment,
encapsulation), (2) cara kimia yang meliputi
teknik pengikatan baik secara kovalen,
non kovalen dan teknik ikatan silang
(crosslinking), (3) Kombinasi cara fisik dan
kimia. Beberapa metode amobilisasi
enzim dapat digambarkan sebagai berikut:

Walaupun enzim merupakan katalis yang

efisien dan cara kerjanya berlangsung
secara spesifik dan selektif namun
demikian enzim tidak terlalu ideal untuk
penggunaan dalam berbagai reaksi kimia
karena stabilitas enzim yang rendah, dan
secara teknik sulit untuk memperoleh
kembali enzim yang masih aktif dari
campuran reaksi untuk dapat digunakan
kembali.

Adanya perkembangan rekayasa enzim

akan dapat mengatasi kekurangan dari
reaksi enzimtais biasa. Cara ini dikenal Bahan pendukung yang banyak
sebagai tenik amobilisasi enzim. Amobilisasi digunakan untuk amobilisasi enzim adalah
enzim adalah suatu proses di mana kalsium alginat, kappa-karagenan,
pergerakan molekul enzim ditahan pada poliakrilamida dan resin sintetis. Dalam
tempat tertentu dalam suatu ruang reaksi penelitian ini digunakan bahan pendukung
kimia yang dikatalisisnya. Proses ini dapat amobilisasi emzim penisilin asilase adalah
dilakukan dengan cara mengikatkan poliakrilamida. Struktur poliakrilamida
molekul enzim tersebut pada suatu bahan dibentuk oleh reaksi polimerisasi larutan
pendukung (matriks) tertentu melalui akrilamida dan N-N-
pengikatan kimia atau menahan secara metilenbisakrilamida (BIS) sebagai
fisik dalam suatu rongga bahan pembentuk ikatan silang. Pada reaksi
polimerisasi ini digunakan kalium ferosulfat,
pendukung. Hal ini dimungkinkan karena
K2S2O8 sebagai bahan inisiator serta beta-
molekul enzim yang struktur globular
dimetilaminopropionitril (DMAPN) sebagai
(tertier maupun kuartener) mempunyai
gugus hidrofilik yang mengarah keluar dari

2 
Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005

aselerator. DMAPN dapat diganti dengan
N,N,N,N-tetrametilendiamin (TEMED).
Reaksi polimerisasi gel poliakrilamida ini
dapat dilihat seperti gambar berikut:
fermentasi ditambahkan asam fenil asetat
0,2% sebagai penginduksi. Pasta sel
bakteri dipisahkan dari medium cair
dengan sentrifuga dingin 2-4 oC pada
5000 rpm selama 30 menit. Pasta sel
dicuci dengan NaCl 0,95%, selanjutnya
pasta sel disuspensikan dengan 5 ml bufer
fosfat 0,01 M pH 7,0.
Pemecahan sel bakteri dilakukan dengan
ultrasonikator pada suhu 2-4 oC. Ekstrak
enzim kasar dipisahkan dari komponen-
komponen sel lainnya dengan sentrifuga
dingin pada 5000 rpm selama 30 menit.

3. Pemurnian Enzim Penisilin Asilase.

Metode pemurnian enzim dilakukan
berdasarkan metode balshingham dan
kawan-kawan. Ekstrak enzim kasar
dimurnikan dengan penambahan amonium
sulfat secara pengendapan bertingkat 0-20%
jenuh; 20-60% jenuh; dan 60-80% jenuh.
Masing-masing fraksi dipisahkan dari
cairannya secara sentrifugasi pada 12000
rpm suhu 2-4 oC selama 20 menit.
Endapan enzim yang diperoleh
disuspensikan dalam bufer fosfat 0,01 M
pH 7,0. Larutan enzim setiap fraksi
dilakukan dialisa menggunakan selofan.

4. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin

Asilase
Sebanyak 0,1 ml enzim hasil isolasi
B. BAHAN DAN METODA direaksikan dengan 0,4 ml substrat benzil
penisilin. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml
1. Pembuatan Inokulum. bufer fosfat 0,1 M pH 7,5. Inkubasi selama
Sebanyak 2 mata ose biakan E. coli B104 30 menit pada 45 oC. Setelah inkubasi, ke
dipindahkan ke dalam 100 ml medium dalam campuran reaksi ditambahkan 1,90 ml
fermentasi. Medium yang telah bufer fosfat 0,5 M pH 6,8 dan 0,1 ml
diinokulasikan ini dikocok selama 24 jam larutan 2,4-pentanadion, kocok dalam
pada suhu 30 oC, 180 rpm. Jumlah sel vortek dan langsung dipanaskan dalam air
yang tumbuh diukur berdasarkan mendidih selama 20 menit. Dinginkan
turbiditasnya pada panjang gelombang dalam air es selama 10 menit. Selanjutnya
650 nm. tambahkan 1,5 ml regen erlich, campuran
reaksi dikocok dan biarkan 10 menit.
2. Isolasi Enzim Penisilin Asilase Warna merah yang terjadi diukur
Sebanyak 3000 ml medium fermentasi serapannya pada panjang gelombang 538
diinokulasi dan dikocok selama 20 jam nm. Sebagai kontrol digunakan enzim
pada 180 rpm dan suhu 30 oC. 8 jam penisilin asilase hasil isolasi yang telah
setelah diinokulasi pada medium dimatikan aktivitasnya melalui

3
Firman Sebayang
pemanasan. Untuk mengetahui jumlah 6-
APA yang terbentuk digunakan kurva
standar 6-APA (Lampiran 1).
5. Penentuan Kadar Protein Enzim
Penisilin Asilase
Penentuan kadar protein dilakukan
dengan metode lowry. Sebanyak 1 ml
larutan enzim direaksikan dengan 5 ml
reagen C, kocok dan biarkan selama 10
menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5
ml reagen D (folinciocalteu 1 N) kocok dan
biarkan 30 menit pada suhu kamar.
Warna biru yang terbentuk diukur
serapannya pada panjang gelombang 750
nm. Untuk mengetahui konsentrasi protein
digunakan kurva standar bovin serum
albumin (Lampiran 2).
6. Pembuatan Enzim Penisilin Asilase
Amobil
Sebanyak 750 mg akrilamid dicampur
dengan 40 mg N,N-metilenbisakrilamida
dalam 100 ml gelas kimia yang berisi 5 ml
bufer fosfat 0,01 M pH 7,0. Diaduk sampai
homogen. Tambahkan 1 ml larutan enzim
penisilin asilase hasil isolasi dan diaduk.
Tambahkan 0,5 ml larutan N,N,N,N-
tetrametilendiamin (TEMED) 5% dan 0,5
ml larutan kalium persulfat. Setiap kali
penambahan bahan selalu diaduk.
Dibiarkan membeku dalam kamar
pendingin agar enzim yang diamobilkan
tidak rusak akibat pengaruh panas pada
proses reaksi polimerisasi. Gel yang telah
dibentuk dipotong-potong dengan ukuran
2 x 2 x 2 mm, kemudian dengan bufer
fosfat dengan volume tertentu. Gel yang
telah dicuci merupakan enzim penisilin
asilase amobil.
7. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
Asilase Amobil.
Proses yang dilakukan adalah sistem
batch. Sebanyak 2 gr gel poliakrilamida
yang mengandung 0,4 ml enzim
ditambahkan sebanyak 0,8 ml substrat
4
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
benzil penisilin dan 1,2 ml bufer fosfat 0,1
M pH 7,5. Inkubasi dalam inkubator
goyang pada suhu 45 oC selama 30 menit.
Jumlah 6-APA yang dihasilkan ditentukan
seperti cara penentuan jumlah 6-APA
dengan menggunakan enzim penisilin
asilase bebas.
8. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
Asilase Amobil pada Pemakaian
Berulang.
Penentuan ativitas enzim amobil pada
pemakaian berulang sama halnya dengan
cara penentuan aktivitas enzim amobil,
hanya saja setelah pemakaian pertama
selesai, enzim amobil tersebut dicuci
dengan air, selanjutnya digunakan
kembali. Demikian seterusnya sampai
pemakaian berulang 6 kali.
C. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Isolasi Enzim Penisilin Asilase
Pada tahap isolasi enzim dilakukan
sentrifugasi sel E. coli yang masih
tercampur dengan mediumnya. Pengujian
terhadap sisa medium fermentasi
menunjukkan tidak adanya aktivitas enzim
penisilin asilase. Hal ini membuktikan
bahwa enzim penisilin asilase dari E. coli
B104 bersifat intraseluler sehingga untuk
memperoleh enzim harus dilakukan
pemecahan sel menggunakan
ultrasonikator. Ekstrak kasar enzim
dipisahkan dari komponen-komponen sel
lainnya dengan sentrifugasi.
2. Pemurnian Enzim Penisilin Asilase
Ekstrak enzim yang diperoleh masih
merupakan campuran dari berbagai
macam enzim sehingga untuk
mendapatkan enzim yang lebih murni
dilakukan pemurnian dengan fraksinasi
menggunakan amonium sulfat. Aktivitas
spesifik sebelum dan sesudah pemurnian
dapat dilihat pada Tabel 1.
Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005

Tabel 1. Aktivitas Spesifik Enzim

Penisilin Asilase Sebelum dan
Sesudah Pemurnian.
Fraksi Enzim Kadar Aktivitas
Protein spesifik
(mg/ml) (Unit/ mg
Protein)
Ekstrak enzim 12.50 0.65
kasar
(NH4)2SO4
0 - 20% 12.10 0.85
20 - 60% 10.35 2.82
60 - 80% 9.78 1.15

Dari tabel dapat dilihat bahwa aktivitas

spesifik enzim tertinggi diperoleh pada
fraksi 20-60%. Hal ini menunjukkan bahwa
pada fraksi tersebut enzim penisilin
asilase realtif lebih murni.

5
Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005

Kurva 1. Grafik Aktivitas Enzim Penisilin pada Berbagai pH

Kurva 2. Grafik Aktivitas Enzim Penisilin Asilase pada Berbagai Suhu

Kurva 3. Grafik Enzim Penisilin Asilase Amobil pada Pemakaian Berulang

3. Penentuan pH Optimum Enzim H+ tidak mempengaruhi konformasi enzim

Penisilin Asilase
PH optimum enzim penisilin asilase
dapat dilihat pada Kurva 1. Dari kurva
dapat dilihat bahwa pH optimum enzim
penisilin asilase adalah 7,5. pH ini
berhubungan dengan struktur enzim
yang terdiri dari asam amino.
Perubahan pH dalam larutan
menunjukkan perubahan ion H+.
Jumlah ion akan mempengaruhi
struktur enzim terutama pada ikatan
hidrogen. Pada pH optimum jumlah ion
sehingga pada pH optimum konformasi
enzim sama dengan konformasi substrat
sehingga pada pH optimum aktivitas
enzim paling tinggi.
4. Penentuan Suhu Optimum Enzim
Penisilin Asilase.
Suhu optimum enzim dapat dilihat seperti
Kurva 2. Dari kurva dapat dilihat bahwa
suhu optimum enzim penisilin asilase
adalah 45 oC. Sebelum mencapai suhu
optimum aktivitas enzim masih rendah.

6 
Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005

Hal ini disebabkan karena energi molekul substrat dengan sisi aktif enzim
aktivasi yang diperlukan enzim untuk kurang efektif sehingga akan menurunkan
menghidrolisa substrat benzil penisilin aktivitas enzim.
belum cukup sehingga enzim tidak
bekerja secara efektif. Kenaikan 6. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
temperatur menyebabkan kenaikan Asilase Amobil pada Pemakaian
aktivitas enzim meningkat sampai Berulang
mancapai kondisi optimum. Setelah Dari hasil pengujian aktivitas enzim
tercapai suhu optimum ternyata dengan penisilin asilase amobil pada pemakaian
kenaikan suhu aktivitas enzim berulang untuk enzim yang sama ternyata
menurun. mengalami penurunan seperti terlihat
pada Kurva 3.
Terjadinya penurunan aktivitas Dari kurva dapat dilihat bahwa penurunan
diperkirakan karena enzim mengalami aktivitas ini berhubungan dengan stabilitas
denaturasi akibat panas. Ikatan dan daya katalitik molekul enzim. Daya
hidrogen yang merupakan ikatan yang katalitik dan stabilitas enzim dipengaruhi
lemah pada molekul enzim mungkin oleh faktor lingkungan terutama gugus
terputus sehingga terjadi perubahan fungsi reaktif enzim pada pusat aktif. Bila
struktur tertier dan kuartener dan suatu enzim sering digunakan maka
menurunkan aktivitas enzim. adanya interaksi antara substrat dengan
enzim akan mempengaruhi gugus reaktif
5. Aktivitas Enzim Penisilin Asilase sehingga terjadi perubahan konformasi
Sebelum dan Sesudah struktur enzim, dengan demikian akan
Diamobilisasi mempengaruhi daya katalitik enzim
Aktivitas enzim penisilin asilase tersebut.
sebelum dan sesudah diamobilisasi
dapat dilihat pada Tabel 2. Bila dilihat stabilitas enzim penisilin
asilase amobil pada pemakaian berulang
Tabel 2. Aktivitas Enzim Penisilin Asilase
ternyata pada pemakaian 1 sampai ke-4
Fraksi Enzim Aktivitas Spesifik
(unit/mg Protein)
relatif belum menunjukkan perubahan
Enzim penisilin 2.85 aktivitas enzim yang berarti. Namun
asilase bebas setelah pemakaian yang ke-5 dan ke-6
Enzim penisilin 2.70 terjadi penurunan aktivitas yang tajam. Hal
asilase amobil
ini kemungkinan kerusakan perubahan
konformasi enzim penisilin asilase cukup
Bila dibandingkan aktivitas enzim besar sehingga menyebabkan aktivitas
bebas dengan enzim amobil dengan enzim menurun secara drastis.
bahan pendukung poliakrilamida ternyata
aktivitas enzim penisilin asilase amobil
D. KESIMPULAN
lebih rendah. Hal ini mungkin
disebabkan karena enzim sebagai
1. E. coli B104 dapat memproduksi enzim
molekul protein yang bersifat hidrofilik
penisilin asilase jika bakteri tersebut
sangat mudah dipengaruhi oleh
ditumbuhkan dalam medium fermentasi
keadaan lingkungan. Dengan demikian
menurut formula morita dan iwata yang
diperkirakan struktur molekul enzim
mengandung asam fenil asetat 0,2%
rusak akibat terjadinya perubahan
sebagai penginduksi.
panas pada saat berlangsungnya
2. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim
reaksi polimerisasi. Selain itu turunnya
aktivitas enzim amobil mungkin adalah 0.65 unit/mg protein, dan
disebabkan karena orientasi antara setelah pemurnian dengan amonium

7
Firman Sebayang
sulfat 20-60% jenuh aktivitas
spesifik meningkat menjadi 2,85
unit/mg protein dengan kondisi
optimum reaksi enzim adalah pH 7,5
dan suhu 45 oC.
3. Aktivitas spesifik enzim penisilin
asilase amobil dengan bahan
pendukung poliakrilamida adalah
2,70 unit/mg protein pada pH 7,5
dan suhu 45 oC.
4. Mekipun terjadi penurunan aktivitas
enzim penisilin asilase amobil
namun penggunaan enzim amobil
lebih menguntungkan karena enzim
amobil dapat meningkatkan
stabilitas serta dapat digunakan
secara berulang.
E. DAFTAR PUSTAKA
Widiawati Adinoto, dkk., (1987),
Pemilihan Anti Mikroba yang
Rasional, MKB. XX, No.1, Juli,
30-35.
Carrington, T.R., (1971), The
Development of Commersial
Processes for the Production of
6-amino Penisilanic Acid (6-APA),
Proc.R.Soc.Lond.B., 179, 321-
333.
8
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
Crueger, W., and A. Crueger, (1984),
Biotechnology: A Textbook of Industrial
Micribiology, Brock, T.D., editor,
Science Tech., Inc., Madison, USA,
178-180, 202-206.
Savidge, T.A., and M.Cole, (1975),
Penicillin Acylase (Bacterial) in
Hash, J.H.(ed.), Methods in
Enzymology-Antibiotics, Academic
Press, New York, 705-720.
Chibata, Inchiro, (1978), Immobilized
Enzymes, Kodansha Ltd., Tokyo, 9-
54.
Morita, H., and T. Iwata, J., (1984),
Ferment. Technol., 62, 217-218.
Balashingham, K, et al., (1972), The
Isolation and Kinetics of Penicillin
Amidase from Escherichia coli,
Biochim, Biophys, Acta, 276, 250-
251.
Kornfeld, J.M., (1987), A New Colorimetric
Methods for The Determination of 6-
Aminopenicillanic Acid, Anal. Chem.,
86, 118-126.
Lowry D.C.H., RoseBrough, N.J. dan Farr,
Randall, (1951), J. Biol.Chem, 193.
Kawashima, K. and umeda K., (1974),
Immobilization Of Enzymes By
Radiopolimerization Of Acrilamide,
Biotechnology And Bioenginering,
16, 609-621.
Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005

LAMPIRAN

Lampiran 1.

9
Firman Sebayang Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005

Lampiran 2.

10