Deteksi GC / MS asam lemak rantai pendek dari kotoran mamalia menggunakan preparasi sampel

otomatis dalam larutan air.

Abstrak Catatan Aplikasi ini menyajikan metode untuk pembuatan profil asam lemak rantai pendek
(SCFA) dalam kotoran mamalia menggunakan Agilent 5977B GC / MSD yang dilengkapi dengan
Agilent 7890B GC dan autosampler Agilent 7693A. Terlepas dari pentingnya membuat profil dan
mengukur SCFA dalam tinja, kesulitan teknis dalam analisis tetap karena volatilitas dan hidrofilisitas
SCFA. Kami menggunakan derivatisasi isobutyl chloroformate / isobutanol dalam larutan air tanpa
mengeringkan sampel. Dengan menggunakan protokol ini, metode untuk asam C1 hingga C7 (formic
to heptanoic) dikembangkan, dan lebih dari tujuh SCFA berhasil diidentifikasi dan diukur dari sampel
tinja mamalia oleh GC / MS.

pengantar

Profil asam lemak rantai pendek (SCFA) telah menjadi topik utama dalam studi bakteri usus1,2.
Namun, volatilitas tinggi dan karakteristik hidrofilik dari SCFA membuat deteksi analit ini sulit. GC /
MS bisa menjadi teknik yang cocok, menawarkan keuntungan untuk mendeteksi senyawa volatil.
Spesies yang sangat polar ini memerlukan derivatisasi untuk analisis GC / MS yang tepat. Derivatisasi
dapat melibatkan sililasi (yaitu, trimetilsilil (TMS)) 3, alkilasi4, dan esterifikasi5. Banyak protokol
derivatisasi memerlukan kondisi tak berair, yang menyerukan untuk mengeluarkan air dari sampel
biologis sebelum reaksi derivatisasi. SCFAs dapat dipengaruhi secara negatif selama proses
pengeringan, menghasilkan hasil yang tidak akurat. Dalam penelitian sebelumnya, esterifikasi
menggunakan propil kloroformat / propanol digunakan untuk derivatisasi dalam kondisi air6.
Sayangnya, pereaksi derivatisasi ini tidak dapat dipisahkan secara kromatografi dari asam format,
membuat identifikasi dan deteksi asam format sulit. Protokol derivatisasi GC / MS yang ditingkatkan
dikembangkan menggunakan isobutyl chloroformate / isobutanol, yang memungkinkan pemisahan,
identifikasi, dan deteksi 14 SCFA yang tepat, menggunakan analisis GC / MS yang sensitif. Catatan
Aplikasi ini memperkenalkan platform profil SCFA untuk sampel tinja mamalia menggunakan GC /
MS.

Eksperimental

Pretreatment sampel penting, terutama dalam kasus sampel biologis yang kaya lipid seperti feses,
karena lipid dapat memengaruhi proses derivatisasi. Oleh karena itu, singkirkan banyak senyawa
lipofilik dalam sampel biologis dengan pemisahan fasa sebelum proses derivatisasi. Ini membantu
untuk menghindari menghalangi derivatisasi akibat kontaminan, dan menghilangkan puncak
kontaminan dalam kromatogram GC. Persiapan sampel Sampel tinja yang baru dikumpulkan
(manusia dan kucing, 100–150 mg berat segar) ditempatkan ke dalam tabung tutup ulir berukuran 2
mL dengan manik-manik keramik (KT03961-1, Bertin Technologies, Prancis). Setelah penambahan 1
mL 10% isobutanol, sampel dihomogenisasi secara mekanis (Precellys Evolution; Bertin
Technologies, Perancis) dengan kecepatan 6.000 rpm selama 20 detik, dua kali, dengan interval 30
detik. Setiap sampel kemudian disentrifugasi pada 21.000 g selama lima menit, dan 675 μL
supernatan dipindahkan ke tabung baru. Selanjutnya, untuk memantau pemulihan, alikuot 20 μg
asam 3-metilpentanoat ditambahkan ke supernatan. Kemudian, 125 μL larutan 20 mM NaOH dan
400 μL kloroform ditambahkan ke tabung, dan sampel di vorteks dan disentrifugasi pada 21.000 g
selama dua menit. Alikuot 400 μL dari fase berair atas dipindahkan ke tabung baru, kemudian 80 μL
isobutanol dan 100 μL piridin ditambahkan ke tabung bersama dengan air berkualitas tinggi untuk
menyesuaikan dengan volume total 650 μL. Untuk meminimalkan berbusa, satu chip mendidih
ditempatkan ke dalam tabung. Sampel dapat disimpan dalam freezer setelah langkah ini.

Persiapan standar kalibrasi

Konsentrasi standar SCFA yang diinginkan dengan 125 μL 20 mM NaOH, 100 μL piridin, dan 80 μL
isobutanol digabungkan dalam sebuah tabung. Volume akhir disesuaikan menjadi 650 μL dengan air.
Untuk menghindari berbusa, satu chip mendidih ditambahkan ke dalam tabung.

Proses derivatisasi

Standar kalibrasi dan sampel menjadi sasaran prosedur derivatisasi yang sama. Alikuot isobutil
kloroformat 50 μL ditambahkan secara hati-hati ke dalam sampel 650 μL atau larutan standar. Untuk
melepaskan gas-gas yang dihasilkan oleh reaksi, tutup tabung dipertahankan terbuka selama 1
menit, kemudian tutupnya ditutup dan sampelnya di vortex. Selanjutnya, 150 μL heksana
ditambahkan, dan tabung disentrifugasi pada 21.000 g selama 2 menit. Fase heksana-isobutanol atas
dipindahkan ke botol autosampler untuk analisis GC / MSD. Tutup sekrup preslit (p / n 5185-5824)
direkomendasikan untuk botol karena gas CO2 diproduksi. Gambar 2 menunjukkan mekanisme
reaksi dari proses tersebut.

Instrumentasi

Untuk kuantifikasi SCFA, pengukuran GC / MS dilakukan pada Agilent 5977B GC / MSD spektrometer
massa quadrupole tunggal yang dilengkapi dengan Agilent 7890B GC dan autosampler Agilent
7693A. Tabel 1 mencantumkan kondisi analitik GC / MS.

hasil dan Diskusi

Pemisahan kromatografi

Tabel 2 mencantumkan 14 SCFA yang dipantau dengan waktu retensi dan ion kuantifikasi mereka.
Gambar 3 dan 4 menunjukkan bahwa proses derivatisasi yang dimodifikasi memungkinkan pereaksi
derivatisasi sepenuhnya dipisahkan dari SCFAs yang dielusi awal, asam format, dan asam asetat.

Puncak besar sekitar 6,5 menit dan 14,3 menit berasal dari reagen derivatisasi. Namun, mereka tidak
mengganggu identifikasi dan kuantisasi yang tepat dari SCFA.

Kinerja kuantitatif

Kalibrasi dilakukan untuk mengakomodasi konsentrasi yang terjadi secara alami pada kotoran
mamalia. Karena C1 hingga C4 SFCA terdeteksi dalam sampel biologis pada konsentrasi yang jauh
lebih tinggi daripada SCFA karbon yang lebih tinggi, kalibrasi dimulai pada konsentrasi yang lebih
tinggi untuk analit yang dielusi lebih awal daripada senyawa yang dielusi kemudian. Dalam semua
rentang linearitas yang sangat baik diamati.
Contoh hasil

Kami menguji sampel tinja vertebrata menggunakan teknik ini. Kami biasanya mendeteksi asam
asetat (C2), asam propionat (C3), dan asam butanoat (C4) pada semua sampel yang diuji. Asam
asetat adalah SCFA dominan di antara semua kotoran. Protokol isobutilasi oleh chloroformate ini
memungkinkan profil SCFA cepat untuk berbagai sampel biologis, seperti kotoran. Protokol yang
ditingkatkan ini memfasilitasi penyelidikan proses fermentasi bakteri usus.

Kesimpulan

Esterifikasi oleh kloroformat dapat dilakukan dalam larutan air. Dibandingkan dengan esterifikasi
dalam larutan nonaqueous (misalnya, BF3 atau H2SO4 dalam metanol) 5, protokolnya mudah dan
praktis. Pendekatan kami dapat dilakukan dengan autosampler, memungkinkan otomatisasi langkah
derivatisasi. Protokol ini memiliki potensi untuk diterapkan dalam pengukuran rutin.