24

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

3.1.1. Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknologi

Hasil Pertanian, Universitas Lampung dan Balai Veteriner Lampung.

3.1.2. Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2018 sampai Mei 2018.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

- Cawan petri diameter 10 cm

- Lidi kapas steril

- Kasa steril

- Jarum ose

- Inkubator

- Autoclave

- Pinset

- Kertas cakram

- Tabung reaksi dan rak

- Lampu spirtus
 25

- Oven

- Timbangan elektrik

- Beaker glass 100 ml

- Erlenmeyer 100 ml

- Pipet ukur 5 ml; 10 ml

- Balp

- Jangka sorong

- Blender

- Kertas saring steril

- Kain kasa steril

- Sarung tangan

3.2.2. Bahan

- Perasan daun mengkudu (Morinda citrifolia) dan daun papaya (Carica

papaya L.) dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, 100%.

- Biakan murni bakteri Shigella dysenteriae, dan Escherichia coli

- Aquades steril

- Media Nutrien Agar (NA)

- Larutan NaCl 0,9 %

- Aquades steril

- Standar Mac farland ( BaCl2 1% : H2SO4 1%)

- Baku kloramfenikol
 26

3.3. Metode Penelitian

3.3.1. Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah daun mengkudu (Morinda citrifolia L.)

dan daun pepaya (Carica papaya L.) yang dipetik di desa Kalirejo,

Lampung Tengah.

3.3.2. Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah air perasan daun mengkudu (Morinda

citrifolia L.) dan daun pepaya (Carica papaya L.) masing-masing 150

gram.

3.4. Prosedur Penelitian

3.4.1. Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi alat-alat yang digunakan, disterilkan dengan oven pada suhu

170oC selama satu jam, sedangkan untuk media disterilkan dengan

autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.

3.4.2. Preparasi Sampel (Wardani, 2012) Modifikasi Sampel

Pada preparasi sampel ini, dilakukan modifikasi menjadi 2 sampel yaitu :

Sebanyak 150 gram daun pepaya (Carica papaya L.) dan daun mengkudu

(Morinda citrifolia L.) yang berwarna hijau, tua, dan masih segar dicuci

bersih kemudian diangin-anginkan. Selanjutnya, dihaluskan dengan cara

diblender. Daun pepaya yang telah dihaluskan, kemudian diperas dan

disaring untuk diambil airnya, sehingga didapatkan konsentrasi perasan

daun pepaya dan daun mengkudu sebesar 100%.

 27

3.4.3. Pengenceran Air Perasan Daun Mengkudu dan Daun Pepaya

1. Siapkan larutan yang telah diperoleh yaitu air perasan daun mengkudu

dan daun papaya konsentrasi 100%.

2. Kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi sampel

75%, 50% dan 25%.

3.4.4. Pembuatan Standar Kekeruhan Mac Farland (SNI 8234, 2016)

1. Siapkan larutan BaCl2 1% sebanyak 5 ml

2. Campurkan dengan larutan H2 SO4 1% sebanyak 99,5 ml.

3. Kocok larutan hingga homogen dan terlihat keruh.

4. Diambil 10 ml untuk dijadikan pembanding saat pembuatan suspensi

bakteri.

3.4.5. Pembuatan Media Peremajaan Bakteri (Bara, 2015)

1. Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 4,6 gram.

2. Lalu dilarutkan dengan 200 ml aquades menggunakan tabung

erlenmeyer.

3. Kemudian dihomogenkan dan dituang ke dalam tabung reaksi steril yang

ditutup dengan aluminium foil.

4. Media tersebut disterilkan kedalam autoclave pada suhu 121o C selama

30 menit sampai media memadat pada kemiringan 30o .

3.4.6. Peremajaan Bakteri (Pajan, dkk, 2016)

1. Masing-masing bakteri Escherichia coli, dan Shigella dysenteriae

diambil satu ose dari bakteri biakan murni.

 28

2. Menggunakan jarum ose steril, lalu ditanamkan pada media agar miring

dengan cara menghapus.

3. Kemudian diinkubasi selama 24 jam, pada suhu 37o C.

3.4.7. Teknik Pembuatan Suspensi Bakteri (SNI 8234, 2016)

1. Masing-masing tabung reaksi disiapkan untuk bakteri Escherichia coli

dan Shigella dysenteriae.

2. Tabung ditambahkan dengan larutan NaCl 0,9%.

3. Buat suspensi bakteri sampai didapat kekeruhan yang sesuai dengan

standart kekeruhan Mc Farland.

3.4.8. Pembuatan Media NA (Plating) (Bara, 2015)

1. Timbang 12 gram Nutrient Agar

2. Kemudian larutkan dalam 500 ml aquadest dan panaskan hingga

mendidih.

3. Sterilkan selama 15 menit di autoclave dengan tekanan udara 1 atm suhu

121o C.

4. Setelah di autoclave, agar langsung dituangkan ke dalam cawan petri dan

didinginkan hingga agar beku.

3.4.9. Uji Antibakteri Air Perasan Daun Mengkudu Dan Daun Pepaya

1. Siapkan cawan petri berisi 20 ml media Nutrient Agar (NA). Ambil 0,2

ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke media NA secara merata dengan

cara spread plate dan biarkan permukaan agak mengering.

 29

2. Secara aseptis letakkan satu disc antibiotik (disc yang mengandung

kloramfenikol) dan tiga disc blank (yang mengandung berbagai

konsentrasi senyawa uji antibiotik yaitu, 100%, 75%, 50%, dan 25%),

serta satu disc blank kontrol negatif (aquadest steril).

3. Setiap paper disc diinokulasi dengan jarak tertentu secara teratur, supaya

tidak terjadi over lapping zona hambat yang terbentuk.

4. Beri label pada dasar petri secara benar.

5. Inkubasikan selama 24 jam. Amati zona keruh dan jernih disetiap petri.

6. Amati, gambar pertumbuhannya dan ukur diameter zona jernih yang

terbentuk disekitar paper disc dengan jangka sorong/penggaris.

7. Pembacaan

a. Jika terjadi zona hambat (zona bening) disekitar paper disc, sampel

atau zat yang digunakan dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

b. Jika tidak terjadi zona hambat (zona bening) disekitar paper disc,

sampel atau zat yang digunakan tidak dapat menghambat

pertumbuhan bakteri.

3.5. Pengumpulan Data

Setelah dilakukan penelitian dilakukan pengukuran zona hambat (daerah

bening) menggunakan jangka sorong dari masing-masing konsentrasi dengan

tiga kali pengulangan.

 30

3.6. Cara Analisis Data

Data yang diperoleh dari masing-masing konsentrasi dengan tiga kali

pengulangan dirata-rata, ditentukan konsentrasi efektif kemudian

dibandingkan dengan baku pembanding yang digunakan yaitu kloramfenikol

untuk memperoleh kepastian laporan, rendah (resisten), sedang (intermediet),

atau tinggi (sensitif).