LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI (IDK 2)
ACARA 1
TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI

Dosen Pengampu :
Rizki Nisfi Ramdhini, M.Si

KELOMPOK 3
Ahmad Syafi’i
Any Sefty
Della Andryana
Farid Agil Kusuma
Khusnul Khotimah
Widya Wulandari

S1 KEPERAWATAN
SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN (STIKes) MUHAMMADIYAH
PRINGSEWU LAMPUNG
TAHUN 2017
1
1. DASAR TEORI
2. TEKNIK PEWARNAAN
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan karakteristik yang khas.
Yang merupakan mikroorganisme berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik,
bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Oleh
karena itu untuk melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit.
Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel
bakteri. Pewarnaan tersebut merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempermudah proses
identifikasi bakteri.

3. PEWARNAAN GRAM (DEFERENSIAL)

Pewarnaan Gram adalah salah satu tenik pewarnaan yang paling penting
dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dengan menggunakan
teknik ini dapat dibedakan dua kelompok besar bakteri diantaranya bakteri yang
dapat menahan kompleks pewarna primer ungu Kristal iodium hingga akhir
prosedu ryang ditandai dengan sel-sel bakteri tampak biru ungu, koloni tersebut
adalah bakteri gram positif. Sedangkan bakteri yang kehilangan kompleks warna
ungu Kristal pada saat pembilasan dengan alkohol, yang selanjutnya diwarnai
dengan pewarnatan dengan safranin akan menghasilkan sel yang bewarna merah
yang disebut sebagai koloni bakteri gram negatif. Berdasarkan kemampuan
membedakan kelompok-kelompok bakteri, pewarnaan gram juga disebut
pewarnaan deferensial. Adanya perbedaan hasil pewarnaan tersebut disebabkan
perbedaan komposisi dinding sel bakteri yang berbeda sehingga akan
menimbulkan reaksi yang berbeda. Dinding pada bakteri gram positif memiliki
peptidoglikan lebih tebal dari pada gram negatif dan memiliki asam teikoik yang
tertanam pada dinding sel. Sedangkan gram negatif miliki peptidoglikan lebih
tipis dan tidak memiliki asam teikoik, namun memiliki membrane luar yang
terdiri dari lipopolisakarida.

A. TUJUAN PRAKTIKUM
Mempelajari teknik pewarnaan gram positif dan negatif untuk pengamatan
mikroorganisme.

2
B. BAHAN DAN ALAT
1) Mikroskop
2) Gelas benda
3) Jarum Ose
4) Rak cat
5) Pembakar spiritus
6) Suspensi bakteri
7) Cat Gram A (crystal violet)
8) Cat Gram B (iodine)
9) Cat Gram C (etanol 95%)
10) Cat Gram D (safranin)
11) Air

C. CARA KERJA
1) Persiapan Kaca Benda
a. Bersihkan kaca benda dengan menggunakan kapas yang telah dibasahi
dengan alkohol 70 %
b. Buatlah lokasi bentuk oval 3 x 2 cm dengan spidol permanent di bagian
bawah kaca benda
c. Dengan menggunakan pensil 2b berilah nama kultur bakteri pada kiri atas
gelas benda
2) Smear
Smear dapat dilakukan dari medium cair maupun dari koloni pada medium
padat.
Semear pada medium cair (Gambar 1a, b, c, g dan h)
a. Kocoklah tabung suspensi biakan bakteri
b. Ambillah dengan menggunakan ose mata 1-2 kali kemudian letakkan
dibagian atas kaca benda, diratakan pada lokasi oval yang telah dibuat
(lakukan dengan cara aseptis)
c. Kering anginkan pada suhu ruang, sampai terlihat selaput putih
d. Setelah benar benar kering, lakukan fiksasi 3x kali diatas api dengan cepat

3
 Smear dengan menggunakan koloni pada medium padat (Gambar 1d, e, f,
g dan h)
a. Taruhlah 1-2 tetes larutan fisiologis diatas kaca benda
b. Ambillah koloni bakteri pada medium padat dengan menggunakan ose
mata, kemudian letakkan dibagian atas kaca benda, diratakan pada lokasi
oval yang telah dibuat (lakukan dengan cara aseptis)
c. Kering anginkan pada suhu ruang, sampai terlihat selaput putih
d. Setelah benar benar kering, lakukan fiksasi 3x kali diatas api dengan cepat

3) Pengecatan Gram
a. Letakkan kaca benda hasil smear diatas rak yang telah disiapkan
b. Lakukan pengecatan dengan cara menggenangi kaca benda dengan cat
utama (Primary stain) berupa kristal violet yang terdapat dalam Gram A
selama 3 menit (Gambar 2a)
c. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2b)
d. Genangi dengan Gram B yang berisi dengan iodin yang berfungsi sebagai
Mordant selama 1 menit (Gambar 2c)
e. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2d)
f. Dekolorisasi (Decolorize) dengan etanol 95 % yang terdapat pada Gram C
dengan cara mengalirkan dari bagian atas kaca benda (Gambar 2e)
g. Dengan cepat langsung cuci dengan air mengalir (Gambar 2f)
h. Genangi dengan Gram D yang berisi safranin dan berfungsi sebagai
Counterstain selama 3 menit (Gambar 2g)
i. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2h)
j. Bersihkan dengan menggunakan tisue, hati hati jangan sampai menggosok
bagian yang telah tercat, karena akan menghapus bakteri
k. Setelah kering, tetesi dengan minyak imersi
l. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x.

4
4) Skema Cara Kerja

Gambar 1. Smear bakteri: dari medium cair dan dari koloni pada medium
padat

5
Gambar 2. Prosedur Pengecatan Gram

6
2. Pengamatan Pewarnaan

No TeknikPewarnaan Keterangan
(Gram Positif/Negatif)
1 Gram Positif NamaSpesies : Stapyloccus
Aureus

Perbesaran: 10 X
Reagen: iodine, crystal violet ,
etanol 95 % , safranin
Warna:Ungu
Bentuk:Batang ( basil )

2 Gram Negatif NamaSpesies:

Escherhia Coli

Perbesaran: 10 X
Reagen: Iodine, crystal violet,
etanol 95 % , safranin
Warna:Merah
Bentuk:Batang ( basil )

7
2. PEMBAHASAN
1. Tujuan Praktikum
 Mahasiswa mampu mengetahui prosedur teknik pewarnaan gram positif dan
negaitf
 Mahasiswa mengetahui ciri-ciri bakteri gram positif dan negatif
2. Fungsi dari setia palat-alat yang digunakan
◦ Mikroskop
Mikrosop digunakan untuk melihat dan mengamati mikroorganisme yang
berukuran sangat kecil yang tidak mampu dilihat dengan mata telanjang.
◦ JarumOse
Jarum ose berfungsi untuk memindahkan biakan bakteri untuk ditanam atau
ditumbuhkan ke media baru.
◦ Bunsen
Bunsen merupakan alat pembakaryang dapat menghasilkan nyala api premix
(premix flame).
◦ Incase
Menginkubasi alat dan media pada suhu kamar 25-27’ C.
◦ Jarum loop
Untuk inokulasi dari media padat ke cair
◦ Objek glass
Untuk tempat bakteri.
◦ Sprayer
Untuk wadah alkohol 0,70%.
◦ Nampan
Untuk tempat alat dan bahan.
◦ Pipettetes
Untuk mengambil larutan dalam skala kecil ukuran 1-10 ml.
◦ Rak tabung reaksi
Untuk tempat tabung reaksi.

8
3. Fungsi dari setiap zat warna dan larutan yang digunakan.
◦ Cat Gram A (crystal violet)
Berfungsi untuk memberi warna pada bakteriyang ingin diamati,
Crystal violet bersifat basa sehinggamampu berikatandengan bakteri yang
bersifat asam sehinggabakteri yang transparan akan terlihat berwarna ungu.
◦ Cat Gram B (iodine)
Berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme
target. Pemberian iodine pada pengecatan Grambertujuanuntuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri.
◦ Cat Gram C (etanol 95%)
Berfungsi untuk melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme).
◦ Cat Gram D (safranin)
Berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan
pewarna utama setelah perlakuan dengan etanol, dengan kata lain memberikan
warna pada mikroorganisme non target.

4. Perbedaan dinding sel bakteri gram positif dan negatif

Perbedaan Bakteri gram positif Bakteri gram negatif
Dinding sel : Lebih tebal (20-80nm) 1- Lebih tipis11-22 %
Lapisan 4%
peptidoglikan
Kadar lipid
Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam
Endospora Beberapa grup dapat Tidak dapat membentuk
membentuk endospora endospore
Ketahanan terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

9
5. Analisis Hasil
Pewarnaan bakteri dilakukan pada suspensi staphylococcus Aerus
menunjukan bahwa bakteri termasuk gram positif, karena bakteri tersebut
mengikat kompleks zat warna cristal violet. staphylococcus Aerus berbentuk
kokus atau lingkaran dengan diameter sel mencapai 1µm. Koloninya berbentuk
sejajar seperti rantai memanjang. Bakteri ini menjadi penyebab berbagai
penyakit, diantaranya bisul, jerawat, pneumonia, meningitis, dan arthritits.
Sebagian besar penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini memproduksi nanah,
oleh karena itu bakteri ini disebut piogenik.

NamaSpesies : Stapyloccus Aureus

Warna : Ungu
Bentuk : Kokus (lingkaran)

Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli pada air

WC. Bentuk E. coli adalah basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada saat
diwarnai menunjukkan warna merah muda yang berarti bahwa bakteri ini bersifat
gram negatif. E. Coli mengikat zat warna sekunder yang berwarna merah.
Menurutliteratur, E. coli termasuk dalam familia Enterobacteraceae yang
termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E.coli
hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem
pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada
strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan
penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitikuremic (hus),
infeksiusus, infeksisaluranurin, dan neonatal meningitis. Peranan yang
mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada

10
level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak digunakan
dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk
menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena
bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam
penanganannya (Fajriana, 2008).

NamaSpesies : Escherhia Coli

Warna : Merah
Bentuk : Batang ( basal )

11
 PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan pengamatan dibawah mikroskop, maka dapat disimpulkan bahwa pada
sampel tersebut ditemukan bakteri coccus berwarna ungu berbentuk basal dan bakteri E
Coli berwarna merah berbentuk batang

B. Saran
Adapun saran sehubung dengan pelaksanaan praktikum, khususnya ditunjukan bagi
mahasiswa bahwa;
- Diharapkan kepada seluruh mahasiswa selama praktikum berlangsung sungguh
sungguh dalam melakukan praktikum
- Diharapkan kepada seluruh mahasiswa selama dalam ruang praktikum
menggunakan APD (Alat Pelindung Diri)

12
 DAFTAR PUSTAKA

Madigan, M.T. et al., 2012. Brock Biology of Microorganisms 13th ed., San
Francisco: Benjamin Cummings.
Pollack, R.A. et al., 2009.laboratory exercises in microbiology, USA: JOHN WILEY
& SONS, INC.
Prescott & Harley, 2002.Laboratoy exercises in microbiology fifth., United States:
McGraw-Hill.
Willey, J.M., Sherwood, L.M. &Woolverton, C.J., 2009. Prescott’s Principles of
Microbiology, New York: McGraw-Hill.

13