Pendahuluan

Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR) / CRISPR-associated

protein (Cas) 9 system. Pengembangan cara yang efisien dan dapat diandalkan untuk
membuat perubahan yang ditargetkanpadagenom sel-sel hidup secara tepat adalah tujuan
lama bagi para peneliti biomedis.CRISPR / Cas9 systemtelah berkembang pesathanya dalam
waktu yang sangat singkat dan sudah digunakan untuk berbagai gen target yang penting
dalam berbagai macam sel dan organisme, termasuk manusia, bakteri, ikan zebra, cacing C.
elegans, tanaman, Xenopus tropicalis, ragi, lalat Drosophila, monyet, kelinci, babi, tikus serta
mencit. Beberapa penelititelah menggunakanmetode ini untuk membuatpoint
mutation(penghapusan atau sisipan) dalam gen target tertentu, melalui gRNA tunggal.
Suatuperkembanganyangmenarik baru-baru ini adalah penggunaan versi dCas9 dari sistem
CRISPR / Cas9dalammenargetkan domain protein untuk regulasi transkripsi, modifikasi
epigenetik, dan visualisasi mikroskopik dari lokus genom tertentu. Alat pengedit dan
penarget genom ini telah sangat meningkatkan kemampuan kita untuk mengeksplorasi
patogenesis penyakit dan memperbaiki mutasi penyakit serta fenotipe. Dengan panduan
singkat RNA, Cas9dapat tepat diarahkan ke targetareaDNA tertentu, dan berfungsi sebagai
enzim endonuklease yang efisien untuk menghasilkan pemotongan pada DNA untai ganda.
Dalam kurun waktu 20 tahun terakhir, CRISPR telah berkembang dari alat ‘pengurutDNA
dengan fungsi biologis yang tidak diketahui’ menjadi ‘pengedit genom’yang sangat
menjanjikan dan telah berhasildigunakan dalampercobaan yang menggunakan berbagai sel
dan organisme. Teknologi pengeditgenom ini juga dapat diterapkan untuk biologi sintetis,
skrining genom fungsional, modulasi transkripsi, dan terapi gen.

Cara kerja
Ada dua komponen utama dalam sistem CRISPR-Cas9 yaitu protein Cas dan single guide
RNA (sgRNA). Dalam sistem CRISPR-Cas tipe II, Cas 9 ini merupakan protein penting yang
menjadi karakteristik utama dan sistem ini yang paling banyak digunakan dalam penelitian.
Hal ini karena CRISPRCas tipe II ini memiliki komponen yang lebih sederhana yaitu 3
komponen (Cas9, crRNA dan trRNA) yang lebih mudah diadaptasi dibandingkan
CRISPRCas tipe I, III dan IV. Cas 9 berfungsi sebagai enzim yang memotong DNA target di
sekuen yang posisinya dekat dengan situs protospacer adjacent motif (PAM). Sekuen di situs
PAM ini biasanya ditandai dengan 3 basa nukleotida (NGG, dengan N adalah basa nukleotida
yang bisa berupa A: Adenin; T: Timin; C: Cytocine; G: Guanin). Protein cas9 ini memiliki 2
situs homolog yaitu RuvC dan HNH, yang masing-masing memotong satu dari untai ganda
DNA, yang menghasilkan potongan tumpul (blunt cut) pada sekuen DNA target. Selanjutnya,
sgRNA yang merupakan RNA buatan gabungan dari dua noncoding RNA yaitu crRNA yang
berfungsi sebagai guide yang bisa menyesuaikan dengan sekuen dari DNA target dan
tracrRNAyang berfungsi sebagai scaffold. Sekuen sgRNA ini digunakan untuk mentarget
lokus genom tanaman/hewan yang secara 34ector34us panjangnya 19-22bp, dengan
penambahan 3 bp sekuen PAM (NGG). Cas9 dan sgRNA dapat dikonstruk dalam satu vektor
atau bisa menggunakan dua vektor yang terpisah dengan mengkombinasikan dengan jenis
promotor dan sekuen dari enzim restriksi lainnya tergantung dari karakter genom yang
ditargetkan. Metode pengeditan dari CRISPR ini, sama dengan dua teknologi sebelumnya
yaitu adanya mekanisme reparasi akibat terpotongnya sekuen DNA target. Mekanisme
reparasi tersebut bisa terjadi secara alami yang bergabung dengan Nonhomologous end
joining (NHEJ) maupun dengan menggunakan cetakan eksternal yang diinginkan seperti
homology directed repair (HDR). Dari mekanisme perbaikan ini maka akan terjadi insersi
basa atau penghapusan nukleotida baru yang menyebabkan terjadinya disfungsi gen.(Sprink
et al., 2015).