Disusun Oleh:
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DEPARTEMEN KIMIA
JATINANGOR
2019
Kata Pengantar
Puji syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT karena berkat rahmat dan karunia-
Nya, sehingga kami dapat menyelesaikan laporan akhir praktikum yang berjudul “Isolasi,
Penentuan Kadar Protein dan Uji Aktivitas Enzim Protease dari Paya”. Terlepas dari itu,
kami menyadari bahwa masih ada kekurangan dalam tugas ini, baik dari segi kalimat maupun
tata bahasanya. Oleh karena itu, kami menerima kritik dan saran agar menjadi dapat
memperbaiki dan menjadi pelajaran tersendiri bagi kami pada khususnya.
Laporan akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu nilai praktikumIII A yang ada
di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selain itu penulis juga
mengucapkan terimakasih kepada pihak-pihak yang telah membantu baik selama praktikum,
maupun dalam penyusunan laporan ini.
Akhir kata kami berharap semoga makalah ini dapat memberikan manfaat dan
menginspirasi bagi kami ataupun pembaca makalah ini.
Penulis
Daftar Isi
KATA PENGANTAR ....................................................................................................
..................................................................................... Error! Bookmark not defined.
DAFTAR ISI...................................................................................................................
..................................................................................... Error! Bookmark not defined.
ABSTRAK ......................................................................................................................
.................................................................................... iError! Bookmark not defined.
BAB I PENDAHULUAN ...............................................................................................
..................................................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1 Latar Belakang .................................................................................................
Error! Bookmark not defined.
1.2 Identifikasi Masalah .........................................................................................
Error! Bookmark not defined.
1.3 Tujuan Percobaan .............................................................................................
Error! Bookmark not defined.
1.4 Manfaat Percobaan ...........................................................................................
Error! Bookmark not defined.
1.5 Metodologi Percobaan......................................................................................
Error! Bookmark not defined.
1.6 Tempat dan Waktu Percobaan..........................................................................
Error! Bookmark not defined.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................
..................................................................................... Error! Bookmark not defined.
BAB III BAHAN DAN METODE ................................................................................. 8
3.1 Alat ................................................................................................................... 8
3.2 Bahan ................................................................................................................ 8
3.2.1 Bahan Praktikum .......................................................................................... 8
3.2.2 Bahan Kimia ................................................................................................. 8
3.3 Metode Percobaan ............................................................................................ 8
3.3.1 Pengendapan Protein dengan Garam Ammonium Sulfat................................ 8
3.3.2 Pemurnian Protein dengan Kromatografi Kolom Filtrasi Gel ........................
Error! Bookmark not defined.
3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim Protease .............................................................. 9
3.3.4 Pembuatan Kurva Baku Standar Protein .........................................................
Error! Bookmark not defined.
3.3.5 Penentuan Kadar Protein .................................................................................
Error! Bookmark not defined.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................
..................................................................................... Error! Bookmark not defined.
4.1 Hasil Pengamatan .............................................................................................
Error! Bookmark not defined.
4.1.1 Tabel Pengamatan.........................................................................................
Error! Bookmark not defined.
4.1.2 Tabel Data Absorbansi ................................................................................. 15
4.2 Perhitungan.......................................................................................................
Error! Bookmark not defined.6
4.3 Grafik ...............................................................................................................
Error! Bookmark not defined.4
4.4 Pembahasan ......................................................................................................
Error! Bookmark not defined.4
5.1 Kesimpulan.......................................................................................................
Error! Bookmark not defined.2
5.2 Saran .................................................................................................................
Error! Bookmark not defined.2
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................................
................................................................................... Error! Bookmark not defined.3
ABSTRAK
Pada buah dan sayuran terkandung enzim pankreatin yang merupakan enzim pencernaan
yang mengandung enzim protease, lipase dan amylase. Salah satu jenis enzim yang sangat
banyak digunakan dan berperan penting dalam aplikasi bioteknologi dan industri adalah
enzim protease, yang mana yang banyak digunakan adalah enzim papain. Enzim papain
merupakan enzim proteolitik hasil isolasi dari getah penyadapan buah papaya atau bisa
juga berasal dari daun pohon pepaya (Carica papaya L.) Di pasar sudah dijual enzim
komersial merk “Paya” yang berfungsi sebagai pengempuk daging dengan harga yang
murah, akan tetapi enzim papain ini tidak murni dan tidak diketahui aktivitasnya. Oleh
karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi enzim protease, memurnikan enzim
protease dengan kromatografi filtrasi gel, menentukan aktivitas enzim protease, dan
menentukan kadar enzim protein dengan metode Lowry. Metode yang digunakan adalah
sentrifugasi, fraksionasi, kromatografi filtrasi gel, dan metode Lowry. Hasil percobaan
menunjukkan bahwa enzim protease dari paya dapat diisolasi dan dimurnikan. Dari
percobaan ini dapat diketahui aktivitas spesifik dari enzim protease untuk fraksi 4,5,6,11,
dan14 berturut-turut sebesar 10,6193unit/mg; -3,3052 unit
/mg; -108,1774unit/mg;
25,5148unit/mg, dan -151,2010unit/mg.
PENDAHULUAN
TINJAUAN PUSTAKA
Protein berasal dari baha Yunani yaitu proteos yang berarti yang utama atau yang
didahulukan. Kata ini diperkenalkan oleh ahli kimia Belanda, Geraldus Mulder (1802 –
1880). Ia berpendapat bahwa protein adalah zat yang paling penting dalam setiap
organisme (Ellya,2010).Protein merupakan polimer yang panjang dari asam-asam
amino yang bergabung melalui ikatan peptida. Komposisi rata-rata unsur kimia yang
terdapat dalam protein adalah karbon 55%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%,
sulfur 1% dan kurang dari 1% fosfor (Winarno, 1991).
A. Temperatur Suhu
Inkubasi sangat mempengaruhi kerja dari enzim, suhu inkubasi yang lebih tinggi
dari suhu optimum kerja enzim dapat menyebabkan terjadinya perubahan konformasi
sisi aktif enzim yang disebabkan adanya denaturasi protein enzim (Arbianto, 1989).
Sebagian besar enzim terdenaturasi pada suhu diatas 50 ºC (Wolfe, 1993). Dalam batas-
batas suhu tertentu, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim akan naik bila suhunya
naik. Reaksi yang paling cepat terjadi pada suhu optimum (Rodwell, 1987). Pada suhu
0oC enzim menjadi tidak aktif dan dapat kembali aktif pada suhu normal (Lay dan
Sugyo, 1992).
B. pH (Derajat Keasaman)
pH (Derajat Keasaman) enzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang berarti
enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya,
terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus terminal amino. Perubahan
kereaktifan enzim diperkirakan merupakan akibat dari perubahan pH lingkungan
(Winarno, 1989). Perubahan pH dapat mempengaruhi asam amino kunci pada sisi aktif,
sehingga menghalangi sisi aktif enzim membentuk kompleks dengan substratnya (Page,
1989).
C. Konsentarasi Enzim
Kecepatan laju reaksi enzimatik berhubungan langsung antara konsentrasi enzim
dengan substrat (Orten and Neuhaus, 1970). Konsentrasi enzim secara langsung
mempengaruhi kecepatan laju reaksi enzimatik, laju reaksi meningkat dengan
bertambahnya konsentrasi enzim (Poedjiadi, 1994).
D. Konsentrasi substrat
Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi substrat.
Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat meningkat. Peningkatan
kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga tercapai suatu titik batas yang pada
akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan
reaksi (Lehninger, 1982).
E. Aktivator dan inhibitor
Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya. Aktivator adalah
senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzimatis. Komponen
kimia yang membentuk enzim disebut juga kofaktor. Kofaktor tersebut dapat berupa
ion-ion anorganik seperti Zn, Fe, Ca, Mn, Cu, Mg atau dapat pula sebagai molekul
organik kompleks yang disebut koenzim (Martoharsono dan Soeharsono, 1997).
Menurut Wirahadikusuma (2001) inhibitor merupakan suatu zat kimia tertentu yang
dapat menghambat aktivitas enzim. Pada umumnya cara kerja inhibitor adalah dengan
menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim tidak dapat berikatan dengan substrat dan
fungsi katalitik enzim tersebut akan terganggu (Winarno, 1989).
Salah satu enzim yang telah banyak dipelajari adalah enzim protease yang
berfungsi mengkatalis hidrolisis ikatan peptida pada protein. Enzim protease
merupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena aplikasi-nya
sangat luas. Contoh industri pengguna enzim protease antara lain industri deterjen,
kulit, tekstil, makanan, pengolahan susu, farmasi, bir dan limbah (Moon and Parulekar,
1993).
Protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan
peptida pada protein. Protease dibutuhkan secara fisiologi untuk kehidupan organisme
pada tumbuhan, hewan maupun mikroorganisme. Protease tidak hanya berperan dalam
proses metabolisme seluler, namun juga dapat diaplikasikan dalam bidang industri.
Enzim ini merupakan salah satu enzim skala industri dengan tingkat penjualan hingga
60% dari total penjualan enzim di dunia. (Gupta et al., 2002; Rao et al., 1998).
Protease dapat dihasilkan oleh tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme.
Penggunaan tumbuhan sebagai sumber protease terbatas oleh tersedianya lahan tanam
dan kondisi pertumbuhan yang sesuai, serta memerlukan waktu produksi enzim yang
lama. Produksi protease dari hewan juga dibatasi oleh ketersediaan ternak penghasil
enzim. Mikroorganisme merupakan sumber enzim yang paling potensial dibandingkan
tanaman dan hewan. Penggunanan mikroorganisme lebih menguntungkan karena
pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah
ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik.
Beberapa genus bakteri yang diketahui mampu menghasilkan protease di antaranya
Bacillus, Lactococcus, Streptomyces, dan Pseudomonas Produksi enzim protease
dipengaruhi oleh faktor waktu produksi enzim. Waktu produksi yang sesuai akan
menghasilkan aktivitas enzim maksimum (Rao et al., 1998; Said & Likadja, 2012).
Papain (paya) merupakan enzim proteolitik yang terkandung dalam getah papaya
(Carica papaya). Papain bisa diperdagangkan dalam bentuk serbuk putih kekuningan
dan harus disimpan di bawah temperatur 4oC. Kelebihan papain dibandingkan
proteolitik yang lain adalah lebih tahan terhadap proses suhu, mempunyai kisaran pH
yang luas dan lebih murni dibandingkan biomelin & ficin. Kisaran pH optimum papain
sekitar 5 – 7,5 dan stabil pada suhu (40 – 60)oC (Fitriani, 2006).
Protease diklasifikasikan berdasarkan tiga kriteria utama, yaitu tipe reaksi yang
dikatalisisnya, struktur kimia alami yang ada pada sisi katalitiknya, dan struktur yang
berhubungan dengan evolusi (Rao et al., 1998). Berdasarkan sistem klasifikasi IUBMB
(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular
Biology), enzim-enzim proteolitik mikroba dapat dibedakan atas endopeptidase dan
eksopeptidase. Endopeptidase terbagi menjadi 4 kelompok utama, yaitu protease serin
(EC 3.4.21), protease sistein (EC 3.4.22), protease aspartat (EC 3.4.23) dan protease
metal (EC 3.4.24) (Nagodawithana dan Reed, 1993). Penamaan tersebut menunjukkan
bagian penting dari sisi katalitik enzim.
A. Protease serin
Protease serin adalah endopeptidase yang mempunyai residu sistein reaktif dan pH
optimum mendekati netral. Protein serin mempunyai aktivitas maksimum pada pH
alkalis. Tiga residu asam amino yang membentuk catalytic triad yang essensial pada
proses katalitik, yaitu His57, Asp102 dan serin195. Tahap pertama terjadi
pembentukan intermediet asil-enzim antara substrat dan serin. Pada tahap kedua
intermediet asil-enzim di hidrolisis dengan molekul air yang melepaskan peptida
dengan gugus OH serin (Nagodawithana dan Reed, 1993)
B. Protease sistein
Famili protease ini meliputi protease tanaman seperti papain, aktinidin dan
bromelain. Pada famili ini, papain merupakan tipe protease yang paling banyak
dipelajari. Proses katalisis berlangsung melalui pembentukan intermediet kovalen yang
melibatkan residu sistein dan histidin. Pada protease sistein, Cys25 dan His159
berperan sama seperti Ser195 dan His57 pada protease serin. Ion thiolat lebih nukleofil
daripada gugus OH. Ion thiolat distabilkan melalui pembentukan pasangan ion dengan
gugus imidazolium dari His159 (Nagodawithana dan Reed, 1993).
C. Protease aspartat
D. Protease metal
Metode Lowry merupakan metode yang telah lama digunakan untuk menentukan
konsentrasi protein. Metode Lowry sangat sensitif dan hanya dapat mendeteksi protein
yang sangat rendah. Ketika reagen folin bersama larutan tembaga sulfat dicampur
dengan larutan protein, sehingga terbentuk larutan berwarna biru-ungu yang dapat
secara kuantitatif dianalisis absorbansinya pada 600 nm. Metode ini berdasarkan reaksi
biuret dimana ikatan peptida dari protein bereaksi dengan Cu2+ di bawah kondisi basa
menghasilkan Cu+ yang bereaksi dengan reagen folin dan terjadilah reaksi ciaocalteu
yang melibatkan reaksi reduksi fosfomolibdat menjadi hetero-polimolibdenum biru
yang dikatalisis oleh reduksi Cu dari asam amino aromatik. Hasil tersebut juga
bergantung pada kandungan tirosin & triptofan dalam sampel protein (Wilson &
Walker, 2000).
BAB III
3.1 Alat
Alat–alat yang digunakan adalah batang pengaduk, botol vial, gelas kimia,
inkubator, kolom filtrasi gel, neraca analitik, tabung reaksi sentrifugator, dan
spektrofometer UV-Vis.
3.2 Bahan
Bahan praktikum
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah paya.
Bahan kimia
Bahan- bahan kimia yang digunakan adalah akuades, ammonium sulfat,
buffer fosfat pH 7,6 0,1 M, folin ciocalteu, N,N-dimetil kasein, TCA 8% (trichloro
acetic acid), natrium ditionit, natrium karbonat 2% (dalam NaOH 0,1 N),sephadex
G-25, dan tembaga sulfat pentahidrat 0,5% (dalam Na-K-Tartat 1%) (pereaksi C).
- Ditambahkan ammonium
sulfat 3,4515 gramsedikit
demi sedikit sambil
diaduk
- Disentrifugasi 9000rpm,
30 menit - Terbentuk supernatan
dan endapan
vial
Kolom Kromatografi
- Di jenuhkan buffer fosfat
pH 7,6
- Dimasukkan kapas yang
sudah di jenuhkan
dengan buffer fosfat ke
dalam kolom
- Kolom kromatografi
- Dimasukkan kedalam
Sephadex G-25 kolom hingga setinggi 15 setinggi 15 cm
cm
- Dielusi dengan buffer
fosfat pH 7,6
- Dimasukkan 0,5 mL
sampel
- Dielusi dengan buffer
fosfat pH 7.6
- Ditampung 25 fraksi - 25 fraksi 3 mL
masing-masing 3 ml
- Ditimbang - Massa = 40 mg
Boufin Serum Albumin
(BSA) - Dimasukkan ke dalam
labu ukur 10 mL
- Ditambahkan akuades
hingga tanda batas dan
dihomogenkan
- Diencerkan menjadi
konsentrasi 0,1 ; 0,5 ; 1,0 - BSA konsentrasi 0,1
- Ditambahkan 2,5 mL
pereaksi C
- Dikocok menggunakan
vortex
- Didiamkan 10 menit
- Ditambahkan 0,25 mL
pereaksi D
- Dikocok dengan vortex
- Didiamkan selama 30
menit
- Diukur absorbansinya
pada λ=750 nm
- Didapat absobansi:
Blanko = 0;
0,1 = 0,06;
0,5 = 0,213
1 = 0,399
1,5 = 0,515
2 = 0,582
- Didapat kurva baku
- Dibuat kurva baku
y = 0,2789x +0,0694
serapan terhadap
konsentrasi standar
Sampel Absorbansi(A)
Blanko 0
0,1 mg/mL 0,06
0,5 mg/mL 0,213
1 mg/mL 0,399
1,5 mg/mL 0,515
2 mg/mL 0,582
Ekstrak
5 0,8304 3.8667 4,152 19,3335 4,6564 100 1
Kasar
Ekstrak
Pengend 25 0,1061 3.8667 2,6525 96,6675 36,4439 500 7,8266
apan
Fraksi 4 0,7659 8,1333 114,885 1.219,995 10,6193 6.310,2646 2,2805
Fraksi 5 -0,1412 0,4667 -21,18 70,005 -3,3052 362,0917 -0,7098
Fraksi 6 150 -0,0265 2,8667 -3,975 430,005 -108,1774 2.224,1446 -23,2319
Fraksi 11 0,0810 2,0667 12,15 310,005 25,5148 1603,4603 5,4795
Fraksi 14 -0,0194 2,9333 -2,91 439,995 -151,2010 2.2758,8165 -32,4716
4.2.2.1.Volume
a.Volume matriks =πr2t = 3,14 . (0.6)2 . 15 = 16,956 mL
3 3
b.Volume sampel = 100 . volume matriks = 100 .16,956 = 0,50868 mL
f.Fraksi 4,5,6,11,14
25 𝑚𝐿
V= . 3𝑚𝐿 = 150 mL
0.5
4.2.2.2 Kadar Protein (KP)
Persamaan kurva baku
y = 0,2789x + 0,0694 ; R2 = 0,9637
a = 0,2789 ; b = 0,0694
y = absorbansi ; x = kadar protein
a. Ekstrak kasar
y = bx + a
0,301= 0,2789x + 0,0694
x = 0,8304 mg/mL
b. Ekstrak Pengendapan
y = bx + a
0,099= 0,2789x + 0,0694
x = 0,1061 mg/mL
c. Fraksi 4
y = bx + a
0,283= 0,2789x + 0,0694
x = 0,7659 mg/mL
d. Fraksi 5
y = bx + a
0,030= 0,2789x + 0,0694
x = -0,1412 mg/mL
e. Fraksi 6
y = bx + a
0,062= 0,2789x + 0,0694
x = -0,0265 mg/mL
f. Fraksi 11
y = bx + a
0,092= 0,2789x + 0,0694
x = 0,0810 mg/mL
g. Fraksi 14
y = bx + a
0,064= 0,2789x + 0,0694
x = -0,0194 mg/mL
4.2.2.3.Aktivitas Unit (AU)
A sampel−A Blanko (kontrol)
AU =
0,001 x t hidrolisis(menit)x Venzim(mL)
a. Ekstrak Kasar
0,104 − 0,046
AU =
0,001 x 30 x0,5
AU = 3.8667 unit/mL
b. Ekstrak Pengendapan
0,104 − 0,046
AU =
0,001 𝑥 30 𝑥 0,5
AU = 3,8667 unit/mL
c. Fraksi 4
0,168 − 0,046
AU =
0,001 x 30 x 0,05)
AU = 8,1333 unit/mL
d. Fraksi 5
0,053 − 0,046
AU =
0,001 x 30 x 0,5
AU = 0,4667 unit/mL
e. Fraksi 6
0,089 − 0,046
𝐴𝑈 =
0,001 𝑥 30 𝑥 0,5)
AU = 2,8667 unit/mL
f. Fraksi 11
0,077 − 0,046
AU =
0,001 x 30 x 0,5
AU = 2,0667 unit/mL
g. Fraksi 14
0,090 − 0,046
AU =
0,001 x 30 x 0,5)
AU = 2,9333 unit/mL
AT = V x AU
a. Ekstrak Kasar
AT = 5 mL x 3,8667 unit/mL
AT = 19,3335 unit
b. Ekstrak Pengendapan
AT = 25 mL x 3,8667 unit/mL
AT = 96,6675 unit
c. Fraksi 4
AT = 150 mL x 8,1333 unit/mL
AT = 1.219,995 unit
d. Fraksi 5
AT = 150 mL x 0,4667
AT = 70,005 unit
e. Fraksi 6
AT = 150 mL x 2,8667 unit/mL
AT = 430,005 unit
f. Fraksi 11
AT = 150 mL x 2,0667 unit/mL
AT = 310,005 unit
g. Fraksi 14
AT = 150 mL x 2,9333 unit/mL
AT = 439,885 unit
AT
AS = PT
a. Ekstrak Kasar
19,3335 unit
AS =
4,152 mg
AS = 4,6564 unit/mg
b. Ekstrak Pengendapan
96,6675 unit
AS =
2,6525 mg
AS = 36,4439unit/mg
c. Fraksi 4
1.219,995 unit
AS =
114,885 mg
AS =10,6193 unit/mg
d. Fraksi 5
70,005 unit
AS =
−21,18 mg
AS = -3,3052 unit/mg
e. Fraksi 6
430,005 unit
AS =
−3,975 mg
AS = -108,1774 unit/mg
f. Fraksi 11
310,005 unit
AS =
12,15 mg
AS = 25,5148 unit/mg
g. Fraksi 14
439,995 unit
AS =
−2,91 𝑚𝑔
AS = -151,2010 unit/mg
4.2.2.7 Perolehan
AT sampel
Perolehan = AT Ekstrak Kasar x 100 %
a. Ekstrak Kasar
19,3335
Perolehan = x 100 %
19,3335
Perolehan = 100 %
b. Ekstrak Pengendapan
96,6675
Perolehan = x 100 %
19,335
Perolehan = 500 %
c. Fraksi 4
1.219,995
Perolehan = x 100 %
19,3335
Perolehan = 6.310,2646 %
d. Fraksi 5
70,005
Perolehan = x 100 %
19,3335
Perolehan = 362,0917 %
e. Fraksi 6
430,005
Perolehan = x 100 %
19,3335
Perolehan = 2.224,1446 %
f. Fraksi 11
310,005
Perolehan = x 100 %
19,3335
Perolehan = 1.603,4603 %
g. Fraksi 14
439,995
Perolehan = x 100 %
19,3335
Perolehan = 2.2758,8165 %
4.2.2.8 Kemurnian
AS sampel
Kemurnian =
AS Ekstrak Kasar
a. Ekstrak Kasar
4,6564
Kemurnian =
4,6564
Kemurnian = 1
b. Ekstrak Pengendapan
36,4439
Kemurnian =
4,6564
Kemurnian = 7,8266
c. Fraksi 4
10,6193
Kemurnian =
4,6564
Kemurnian = 2,2805
d. Fraksi 5
−3,3052
Kemurnian =
4,6564
Kemurnian = -0,7098
e. Fraksi 6
−108,1774
Kemurnian =
4,6564
Kemurnian = -23,2319
f. Fraksi 11
25,5148
Kemurnian =
4,6564
Kemurnian = 5,4795
g. Fraksi 14
−151,2010
Kemurnian =
4,6564
Kemurnian = -32,4716
4.3 Grafik
4.3.1 Grafik Penentuan Absorbansi Tiap Fraksi
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Fraksi
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Konsentrasi (mg/mL)
4.4 Pembahasan
Pada percobaan kali ini bertujuan untuk mengisolasi enzim protease dari paya
(pengempuk daging) dengan metode fraksionasi; memurnikan enzim protease dari paya
(pengempuk daging) dengan metode kromatograsi kolom filtrasi gel; menentukan aktivitas
enzim protease dari paya (pengempuk daging) dengan menggunakan substrat N,N-
dimetilkasein; dan menentukan kadar protein dari paya (pengempuk daging) dengan metode
Lowry.
Sampel yang digunakan pada percobaan ini adalah Paya (pengempuk daging). Dalam
paya terdapat papain,garam dan gula. Enzim papain merupakan salah satu jenis enzim
proteolitik yang dapat memecah protein sehingga berfungsi untuk proses pengempukan
daging. Papain cocok digunakan sebagai pengempuk daging karena aktif pada keadaan pH
daging. Enzim papain dalam proses pengempukan daging menyerang protein pada serat –
serat otot (muscle fiber) dan menghidrolisisnya menjadi peptida yang lebih kecil sehingga
menyebabkan daging menjadi lebih empuk dari sebelumnya. Enzim ini memotong protein
daging pada sisi karboksil valin, lisin dan arginine. Enzim papain mempunyai nomor komisi
enzim EC.3.4.22.2, artinya angka 3 terebut menandakan bahwa enzim papain itu termasuk
kedalam kelas enzim hidrolase. Selanjutnya, nomer 4 itu artinya bahwa bahwa enzim papain
ini termasuk kedalam enzim hidrolase yang memotong ikatan peptida. Selanjutnya, nomor 22
itu termasuk kedalam sistein endopeptidase, dan nomor 2 itu artinya bahwa enzim papain ini
didapatkan dari pepaya.
Prosedur selanjutnya adalah uji aktivitas enzim protease. Ekstrak kasar, ekstrak
pengendapan, fraksi,4,5,6,11, dan 14 serta akuades dipipet sebanyak 0,5 mL dengan
menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berbeda yang
didalamnya telah berisi 2,5 mL N,N-dimetilkasein dan 4,5 mL larutan buffer fosfat pH 7,6.
N,N-dimetilkasein berfungsi sebagai substrat yang akan terikat pada sisi aktif enzim sehingga
aktivitas enzim dapat diketahui. Larutan buffer fosfat pH 7,6 berfungsi untuk
mempertahankan kestabilan protein substrat pada kompleks enzim-substrat karena protein
stabil pada pH netral. Jumlah substrat N,N-dimetilkasein yang ditambahkan harus berlebih
agar seluruh enzim dapat terikat pada substrat. Enzim protease pada sampel akan memecah
ikatan peptida substrat membentuk asam amino penyusunnya. Banyaknya asam amino yang
terbentuk dapat menyatakan aktivitas enzim protease. Semakin banyak asam amino yang
terbentuk maka semakin besar aktivitas enzim proteasenya. Setelah itu, seluruh larutan yang
berada dalam tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Enzim dapat
mengkatalisis reaksi pemecahan protein kompleks tersebut dapat dibantu dengan inkubasi
pada suhu 37oC karena pada suhu tersebut, enzim bekerja secara optimum. Jika inkubasi
dilakukan diatas suhu optimumnya, maka enzim akan terdenaturasi. Jika diinkubasi dibawah
suhu optimumnya, maka enzim akan terinaktivasi sehingga aktivitas enzimnya tidak dapat
ditentukan. Pada saat inkubasi, di dalam campuran terjadi hidrolisis protein oleh enzim
protease. Setelah diinkubasi, masing-masing sampel ditambahkan 2,5 mL trikloroasetat
(TCA) 8% yang berfungsi sebagai inhibitor untuk memutuskan rantai ikatan peptida yang
panjang pada protein menjadi rantai peptida yang lebih pendek sehingga proses hidrolisis
terhenti dengan ditandai munculnya cloudy solution (larutan berawan) berwarna putih yang
berarti ikatan peptida panjang telah terputus dan hidrolisis terhenti. Kemudian, masing-
masing sampel disaring menggunakan corong saring untuk memisahkan endapan dan filtrat.
Filtrat yang diperoleh merupakan asam amino dari substrat yang dipecah.
Prosedur terakhir yang dilakukan yaitu penentuan kadar protein dari paya
menggunakan metode Lowry. Pada metode Lowry, terjadi dua tahap reaksi. Pertama adalah
reaksi biuret, yaitu pembentukan kompleks antara ion Cu2+ dengan gugus -NH dari protein
pada rantai peptida dalam suasana basa. Adanya ion Cu2+ dari larutan CuSO4 dan basa dari
NaOH menyebabkan terbentuknya kompleks berwarna ungu. Biuret merupakan hasil
pemanasan urea pada suhu 180°C. Kedua yaitu reaksi reduksi follin-ciocalteu (fosfomolibat
dan fosfowalframat) disebabkan karena terdapat asam amino tirosin dan triptofan. Berikut
reaksi yang terjadi pada uji biuret:
Langkah pertama yaitu ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, dan fraksi 4,5,6,11, dan
14 diambil sebanyak 0,1 mL menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang berbeda. Setelah itu, ditambahkan pereaksi C yang berisi campuran larutan A
(natrium karbonat 2% dalam natrium hidroksida 0,1 N) dan larutan B (kupri sulfat
pentahidrat 0,5% dalam Na-K tartat 1%) sebanyak 2,5 mL kemudian dikocok dengan
menggunakan pengocok vortex dan didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang agar reaksi
dapat berlangsung sempurna. Pereaksi A (berisi Natrium karbonat 2% dalam Natrium
hidroksida 2N) berfungsi sebagai pemberi suasana basa pada reaksi pembentukan senyawa
kompleks antara Cu2+ dengan gugus -NH dari rantai peptida pada protein dan pereaksi B
(berisi Kuprisulfat pentahidrat 0.5 % dalam Na-K tartat 1%) berfungsi sebagai sumber ion
Cu2+. Selanjutnya, ditambahkan pereaksi D (larutan folin-ciocalteu) ke dalam tabung reaksi
sebanyak 0,25 mL kemudian dikocok kembali dengan pengocok vortex dan didiamkan
selama 30 menit pada suhu ruang agar reaksi reduksi follin ciocalteu berjalan sempurna.
Pereaksi D (berisi larutan follin ciocalteu/fosfomolibdat-fosfowalframat) yang akan direduksi
oleh asam amino tirosin dan triptofan yang berasal dari molekul protein. Setelah pengocokan,
dihasilkan larutan kompleks berwarna biru yang menandakan bahwa proses telah selesai.
Langkah berikutnya yaitu larutan kompleks biru diukur absorpsi dalam penentuan
kadar protein pada panjang gelombang maksimum 750 nm dengan spektrofotometer UV-Vis.
Panjang gelombang digunakan pada 750 nm karena pereaksi folin-ciocalteu yang berwarna
biru akan terdeteksi pada panjang gelombang tersebut dan mempunyai absorbansi
maksimum.Pengukuran absorbansi ini menggunakan akuades sebagai blanko yang diberi
perlakuan yang sama. Berdasarkan hasil spektrofotometer UV-Vis, didapatkan nilai serapan
untuk blanko, ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 4, fraksi 5, fraksi 6, fraksi 11, dan
fraksi 14 berturut-turut adalah 0,014A; 0301A; 0,099A; 0,283A; 0,030A; 0,062A; 0,092A;
dan 0,092A. Setelah didapat nilai absorbansi, kadar protein dapat ditentukan menggunakan
persamaan regresi y = 0,2789x + 0,0694 dimana y merupakan absorbansi sampel dan x
merupakan kadar protein. Sesuai perhitungan tersebut didapatkan kadar protein ekstrak kasar,
ekstrak pengendapan, fraksi 4, fraksi 5, fraksi 6, fraksi 11, dan fraksi 14 berturut-turut adalah
mg mg mg mg mg
0,8304 /mL; 0,1061 /mL; 0,7659 /mL; -0,1412 /mL; -0,0265 /mL; 0,0810
mg mg
/mL;dan -0,0194 /mL. Berdasarkan hasil percobaan tersebut, dapat dihitung persentase
perolehan dari ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 4, fraksi 5, fraksi 6, fraksi 11, dan
fraksi 14 berturut-turut adalah 100 %; 500%; 6.310,2646%; 362,0917%; 2.224,1446%;
1.603,4603%; dan 2.2758,8165%. Berikutnya, percobaan ini didapatkan kemurnian dari
ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 4, fraksi 5, fraksi 6, fraksi 11, dan fraksi 14
berturut-turut adalah 1; 7,8266; 2,2805; -0,7098; -23,2319; 5,4795; dan -32,4716. Hasil
tersebut kemungkinan terjadi karena tidak adanya puncak protein yang jelas pada saat
pengukuran aktivitas enzim. Hal tersebut kemungkinan terjadi karena larutan yang
dimasukkan ke dalam kolom terlalu sedikit dan menjadi terlalu encer. Selain itu, hasil ini
kemungkinan terjadi karena pada saat preparasi sampel larutan paya, paya tidak sepenuhnya
larut sehingga kadar protein yang terdeteksi menjadi sangat sedikit. Selain itu juga, hasil ini
kemungkinan didapat karena proses kromatografi yang tidak berjalan sempurna sehingga
proses pemisahan protein tidak terjadi secara sempurna.
DAFTAR PUSTAKA
Arbianto, P. (1989). Dalam Biokimia Konsep - Konsep Dasar (hal. 222 - 225). Jakarta: Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan TInggi.
Ellya, E. (2010). Gizi dalam Kesehatan Reproduksi. Jakarta: Trans Info Media.
Fitriani. (2006). Profil Asam Lemak Omega-3 Dalam Hati Ikan Manyung (Arius hnalassinus) yang
Mengalami Pemanasan Pasteurisasi (Blanching). Semarang: Tugas Akhir N.
Gupta, R., Beg, Q.K., & Lorenz, P. . (2002). Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and
industrial application. . Appl Microbiol Biotechnol, 59:15-32.
Lay, B. W & Sugyo, H. (1992). Mikrobiologi. Jakarta: Rajawali Pers.
Lehninger, A.L. (1982). Dasar - Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Martoharsono & Soeharsono. (1997). Biokimia Jilid 1. Yogyakarta: UGM Press.
Mc Gilvery., Robert, W., Goldstein., & Gerald, W. (1996). Biochemistry A Functional Approuch 3rd
Edition. Surabaya: Airlangga University Press.
McKee, T & J.R. McKee. (1999). Biochemistry : An Introduction 2nd edition. USA: The McGraw-
Hill Companies, Inc.
Moon SH & Parulekar SJ. (1993). Some Observation On Protease Producing In Continuous
Suspention Cultures of Bacillus firmus. . Biotechnology and Bioengineering, 41. 43-45.
Nagodawithana & Reed. (1993). Enzymes in Food Processing (Food Science and Technology). Tulsa,
PennWell Books: Oild Processing, Crude Oil.
Orten, J. M & O. W. Neuhaus. (1970). Biochemistry. Saint Luois. 430 - 435: Mosby Company.
Page, D.S. (1989). Prinsip - Prinsip Biokimia. Jakarta: Erlangga.
Pelczar, M. J & Chan, E.C.S. (2005). Dasar - Dasar Mikrobiologi Jilid 2 . Jakarta: UI-Press.
Podjadi, A. (1994). Dasar - Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga.
Rao, M.B., Tanksale, A.M., Ghatge, M.S., dan Deshpande, V.V. (1998). Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 62:597-635.
Rodwell, V. W. (1987). Harper's Review of Biochemistry. Jakarta: EGC Kedokteran .
Said, M.I., & Likadja, J.C. (2012). Isolasi dan Identifikasi Bakteri yang Berpotensi sebagai Penghasil
Enzim Protease pada Industri Penyamakan Kulit Pt. Universitas Hasanuddin Makassar : Adhi
Satria Abadi (Asa), Yogyakarta, Makalah Ilmiah Fakultas Peternakan.
Wilson, K & Walker, J. (2000). Principle and Techniques Of Prcatical Biochemistry 5th Edition.
England: Cambrigde University Press.
Winarno, F. G. (1989). Enzim Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.
Winarno, F. G. (1991). Kimia Pangan dan Gizi . Jakarta: Gramedia.
Wolfe, S. L. (1993). Molecular and Cellular Biology. California: Wadsworth Publishing Company.