ISOLASI DNA DARAH

I. TEORI SINGKAT

DNA/RNA adalah informasi genetik yang dibentuk oleh asam deoksiribonukleat untuk
DNA atau Ribosanukleat untuk RNA (Solomon dkk 2005: 38). Menurut Watson dan Crick,
DNA disusun oleh basa purin yaitu adenin dan guanin, dan basa pirimidin yaitu timin dan
sitosin. DNA juga mengandung gula deoksiribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen yang
semuanya dinamakan susunan nukleotida (Suryo 2008: 68).Susunan basa kimia ini akan
mengandung informasi untuk komposisi penyusun suatu organisme tertentu. DNA dapat
menggandakan dirinya dan nantinya berperan dalam proses pembelahan sel (Genetic home
refrence: 2015).
Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi DNA dari suatu sel sebagai tahap awal suatu
analisis genetik. Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan sampel sel,
pelisisan membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, pemurnian DNA,
dan pengawetan DNA (Gaikwad 2010: 2). DNA manusia dan hewan biasanya diperoleh dari
darah dan jaringan dalam. Namun DNA juga dapat diektraksi darisemen, saliva, akar rambut,
urine, dan gigi (Medical Genomics 2004: 1). Isolasi DNA juga berfungsi sebagai media
pembelajaran genetik, dapat mengetahui kelainan genetik yang diderita (University of Utah
2015: 1).
Prinsipnya isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan
molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan
pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi
merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.

II. METODE

II.I ALAT DAN BAHAN

ALAT

 Mesin sentrifugasi
 Tabung sentrifugasi
 Vortex
 Mikropipet + tips
 Pipet transfer
 Tube
 Lanset
 Gloves
 Masker
 Inkubator
BAHAN

 Darah 300 µl
 Larutan pelisis eritrosit
 Larutan pelisis leukosit
 RNAse
 Larutan presipitasi protein
 Isopropanol
 Etanol 70%
 tris-EDTA.

II.II PROSEDUR KERJA

1. Darah diambil sebanyak 300 µl dengan menggunakan mikropipet dari ujung jari steril
yang telah dilubangi dengan lanset.
2. Darah dimasukan pada tube dan diberi larutan pelisis eritrosit.
3. Lalu tabung diinkubasi selama kurang lebih 10 menit lalu setelah itu di sentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 2.500 rpm.
4. Setelah itu supernatan kemudian dibuang.
5. Tambahkan lagi 4,5 ml larutan pelisis eritrosit lalu gunakan vortex untuk
homogenisasi.
6. Lalu sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2.500 rpm. Setelah itu
supernatan kembali dibuang.
7. Pelet yang didapat kemudian ditambahkan 1 ml larutan pelisis leukosit lalu
tambahkan 1,5 µl RNAse, lalu homogenisasi campuran dengan cara membolak-
balikkan tabung.
8. Lalu tabung diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37ºC.
9. Tambahkan 500 µl larutan presipitasi protein dan gunakan vortex untuk
homogenisasi. Selanjutnya tabung di sentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan
3.000 rpm.
10. Setelah selesai, supernatan berisi DNA dituang ke tabung berisi 4 ml isopropanol
dingin dan dibolak-balikkan secara perlahan. Selanjutnya tabung di sentrifugasi
selama 5 menit dengan kecepatan 3.000 rpm.
11. Supernatan selanjutnya dibuang dan pellet ditambahkan 4 ml etanol 70% dingin dan
dibolak-balikkan.
12. Selanjutnya tabung di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 3.000 rpm.
Selanjutnya tabung dibolak-balikkan dan DNA dikeringkan selama 15 menit.
13. Lalu tambahkan tris-EDTA 0,5 ml. selanjutnya sampel DNA siap digunakan dan
disimpan pada suhu 4ºC.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Mesin sentrifugasi adalah mesin yang didesain untuk memisahkan material bermassa
berat dengan yang ringan. Mesin sentrifugasi berputar dengan kecepatan yang sangat tinggi.
Tabung sentrifugasi berfungsi sebagai tempat diprosesnya darah (TUFTS University: 2010).
Vortex berfungsi untuk mencampurkan larutan dengan jumlah sedikit (Electron Microscopy
Science 2015:1). Mikropipet dan pipet transfer berfungsi untuk mengambil larutan yang
diperlukan dalam praktikum dalam satuan mikroliter. Tube digunakn untuk menampung
sampel darah. Lanset digunakan untuk melubangi ujung jari tempat pengambilan darah
(Weiner 2010: 443). Inkubator atau waterbath digunakan untuk mengontrol temperature,
keamanan dan goncangan pada status yang tetap (Microguide 2010: 1).
Larutan pelisis sel darah merah mengandung NH4Cl sebagai garam dan berfungsi
sebagai pengoptimalisasi pelisisan sel darah merah tanpa menyebabkan efek yang berarti
pada sel darah putih (Stemcell Technologies 2014: 1). EDTA (Ethylenediaminetetra Acetic
Acid) berfungsi untuk mengikat ion metal yang mempunyai +2 (Mg2+ dan Ca2+) yang dapat
menghambat mereka untuk bereaksi dan mereduksi aktivitas DNAse (Brennan 2010: 1),
KHCO3 berfungsi sebagai larutan penyangga atau buffer (Protocol Online 2006: 1). KOH
digunakan untuk menaikkan pH (Nuansakimia 2009: 1). Sedangkan HCl digunakan untuk
menurunkan pH larutan (Ash 2011: 1).
Larutan pelisis sel darah putih mengandung Tris-HCl sebagai larutan buffer. EDTA,
SDS (Sodium DodecylSulfate) sebagai melarutkan membrane dan protein yang terdenaturasi.
RNAse sebagai penghancur RNA, larutan presipitasi protein (HAc) mengendapkan protein
yang berasosiasi dengan DNA, isopropanol sebagai medium agregasi plasmid DNA agar
DNA terlihat, ethanol sebagai fase pencucian DNA untuk menghilangkan isopropanol dan
garam yang terkandung, dan Tris-EDTA sebagai larutan isotonis agar DNA tidak rusak
(Researchergate 2012: 3-5).
Darah diambil menggunakan lanset steril bertujuan agar darah tidak terkontaminasi dan
menghindari hal-hal yang tidak di inginkan, selanjutnya darah ditempatkan pada tube lalu
tambahkan larutan pelisis sel darah merah yang bertujuan agar sel darah merah hilang, lalu
selanjutnya disentrifugasi agar supernatan yang berisi sel darah merah yang telah terlisis dan
pellet yang berisi sel darah putih terpisah, selanjutnya supernatan dibuang. Lalu ditambahkan
lagi larutan pelisis sel darah merah untuk yang kedua kalinya agar sel darah merah yang
masih ada dapat terlisis dengan sempurna (Researchergate 2012: 4).
Menggunakan larutan pelisis sel darah putih (GB buffer) untuk melisiskan membrane
sel darah putih. Selanjutnya diinkubasi pada waterbath untuk optimalisasi kinerja GB buffer
(DNA Cloning 2004: 1). Lalu selanjutnya tambahkan elution buffer untuk menghilangkan
protein yang telah terdenaturasi sehingga yang tersisa hanya DNAnya (Cooke 2010 : 1).
Tambahkan ethanol untuk proses pencucian DNA. Lalu tempatkan GD Column pada
tube dan selanjutnya disentrifugasi. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan
supernatan, sehingga DNA tidak tercampur dengan supernatan yang akan dibuang.
Selanjutnya GD Columndiberi wash buffer untuk proses pencucian DNA dan bertujuan agar
DNA yang masih menempel pada GD Columndapat mencapai bawah tabung (Researchergate
2012: 2). Setelah GD Column dipindahkan kedalam tube yang baru, lalu diberi TE buffer atau
elotion buffer agar DNA tidak terdegradasi saat proses penyimpanan (Protocol Online, 2006).
Hasil yang akan didapatkan adalah larutan berwarna bening yang berisi DNA murni,
tanpa adanya komponen lain yang tidak diperlukan seperti sel darah merah maupun protein.

IV. KESIMPULAN

DNA merupakan informasi genetik berbentuk rantai ganda berpilin yang terdiri atas
komponen fosfat, gula ribosa, dan basa nitrogen. DNA dapat ditemukan pada seluruh sel
makhluk hidup dan dapat diisolasi dengan berbagai teknik. Isolasi DNA dapat dilakukan
salah satunya dari sampel darah manusia. Hasil yang diperoleh adalah tube sampel yang
berubah warna dari merah menjadi bening sebagai tanda hasil praktikum sesuai dengan
literatur.
 DAFTAR PUSTAKA

Ash, M. 2011. The role of HCl in gastric function and health. 1 hlm.
http://www.clinicaleducation.org/resources/reviews/the-role-of-hcl-in-gastric-function-
and-health/. 14 Mei 2015 pk. 23.09
Campbell, N.A., J.B. Reece, L.A. Urray, M.L. Cain, P.V. Minorsky, R.B Jackson & S.A.
Wasserman. 2008. Biology. 8th ed. Pearson Education Inc, San Fransisco: 1465 hlm.
Solomon, E. P., D. W. Martin, & L. R. Berg. 2005. Biology. 8th ed. Thomson Corporation,
Belmont, USA: 1379 hlm.
Stemcell Technologies. 2014. Ammonium Chloride Solution.
http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/Ammonium-Chloride-
Solution.aspx. 11 Mei 22.58.
Suryo. 2008. Genetika. Gadjah Mada University Press, Yogjakarta: 344 hlm.