Isolasi DNA

Definisi Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan
sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan
molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).

Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih
dahulu dan murni kandungannya.

(Wilson, Keith and John, 2010).

Macam metode isolasi DNA

1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang
menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini
biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan
primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas
18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Subandiyah,2006).

1. Metode CTAB

Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena
adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA,
dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita
DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).

1. Phenol:chloroform

Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,

Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.
 1. Salting Out

Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan
Proteinase K untuk denaturasi protein

1. Guanidine isothiocyanate

Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis
dinding sel, Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.

1. Silica Gel

Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery
DNA kurang (Barnum 2005).

1. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik
yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah
yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya.
Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri,
2004).

Tahap Isolasi DNA

1. Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

1. Pelisisan dinding dan membran sel

Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi),
sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau
buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.
Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel
yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang
tidak berfungsi.

1. Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal
tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

1. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut
kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan
untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse
berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

1. Presipitasi

Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai
DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA
menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan
kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri
atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru
dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas ( Fauziah, 2010)

Manfaat isolasi DNA

Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik.
Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan
binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang
paling umum. Di sisi lain, ilmu forensic perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi
pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau
identifikasi hewan (Anggie, 2011).

1. 1. Teknik untuk memotong rantai mol DNA

Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat
memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan enzim restriksi atau endonuklease
restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuen spesifik yang panjang 4 sampai
dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi.

Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang
menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri) Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi
yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali
dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut.

Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong
DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada DNA
yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens
pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai
tempat atau bagian yang akan dipotongnya. Enzim retriksi (Endonuklease) adalah enzim yang berasal
dari bakteri, yang dapat memotong rantai DNA (double stranded) atau RNA. Dalam bakteri enzim ini
berfungsi sebagai perlindungan diri dengan cara memotong DNA pada sisi pemotongan tertentu. Salah
satu contoh enzim retriksi adalah Enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada
tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim Ecor! Memotong DNA pada bagian yang urutan basanya
adalah GAATTC ( sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC ). Didalam sekuens pengenal tersebut,
Enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs
anara G dan A.

Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi
berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian anatara G
dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan
akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau
cohesive ends.

Berikut adalah contoh organisme-organisme penghasil Enzim retriksi

NAMA ENZIM SEKUENS PENGENAL ORGANISME ASAL

EcoRI G AATTC Escherichia coli

HindIII A AGCTT Haemophilus influenza

HhaI GCG C Haemophilus haemolyticus

TaqI T CGA Thermus aquaticus

BsuRI GG CC Bacillus subtilis

BalI TGG CCA Brevibacterium albidum

NotI GC GGCCGC Nocardia otidis-caviarum

BamHI G GATCC Bacillus amylolyquefaciens

SmaI CCC GGG Serratia marcescens

Berdasarkan cara pemotongannya Enzim retriksi digolongkan menjadi dua :

a. Endonuklease, memtotong nukleotida dari arah dalam

b. Eksonuklease memotong nukleotida hanya pada ujung atau dari arah luar

Endonuklease dapat mengenal urutan atau sekuen nukleotida pendek, antara 4-8 nuklotida, yang sering
dikenal dengan restrictionsite atau sisi pemotongan, atau situs pemotongan yang spesifik dan berbeda-
beda. Secara umum berdasarkan hasil pemotongan DNA double strain dengan enzim endonuklease
memilik dua bentuk yaitu hasil pemotongan sticky end (ujung runcing dan blund end (ujung tumpul
seperti pada skema dibawah ini.
Kemampuan memotong DNA pada sisi spesifik menjadi tonggak penting dalam pengembangan metode
manipulasi DNA sekarang ini. Endonuklease restriksi merupakan enzim bakteri yang memotong DNA
dupleks pada urutan target spesifik. Enzim ini dapat diperoleh secara komersial dari perusahaan-
perusahaan produk bioteknologi. Penamaan enzim restriksi didasarkan pada sistem sederhana yang
diusulkan oleh Smith and Nathans. Nama enzim (seperti BamHI, EcoRI) menunjukkan bahwa asal enzim,
tetapi tidak menunjukkan informasi spesifisitas pemotongan. Sisi pengenalan enzim restriksi pada
umumnya adalah urutan palindromik dengan panjang 4, 5, atau 6 pasang basa (pb) seperti AGCT (untuk
AluI), GAATTC (untuk EcoRI), dan lain sebagainya.

Masing-masing enzim restriksi memotong urutan palindrom pada sisi spesifik, dan dua enzim berbeda
dapat mempunya urutan pengenalan yang sama, tetapi memotong DNA pada titik berbeda di dalam
urutan basa tersebut. Ujung DNA hasil pemotongan enzim restriksi dapat dikelompokkan menjadi tiga
ketergori: (1) ujung tumpul, (2) ujung lengkaet 5’ dan (3) ujung lengket 3’.

Agarose gel elektroforesis atau southern analisis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
berdasarkan berat molekulnya. Metode ini ditemukan oleh Ed sourthern pada tahun 1975. Metode ini
digunakan untuuk mengidentifikasi fragmen DNA yang secara menyeluruh untuk mengetahui DNA
sekuen. Sourthern hibridisasi juga disebut sourthern blotting digunakan untuk mengetahui
perbandinagn antara genome dari suatu particular organisme dan dengan gen penanda atau gen
fragmen (probe). Ini dapat menjelaskan apakah suatu organisme berisi pertikel gen dan mengandung
informasi tentang pengorganisasian dan restriction map dari suatu gen.

Langkah-langkah dalam analisis sourthern gen DNA pada organisme dipotong dengan enzim retriksi
(endonuklease) menjadi fragmen-framen DNA lalu fragmen DNA tersebut dimasukkan pada gel agarose
lalu dilakukan elektroforesis dengan mengalirkan arus listrik dari kutub negative ke positif kemudian
hasil pemisahan DNA tersebut didenaturasi dalam suatu alkali dan ditransferkan pada membran
nitroselulosa. Pada membrane fragmen DNA telah menjadi single stranded lalu dimasukkan kedalam
larutan yang mengandungDNA probe, proses ini disebut DNA hibridisasi dengan kata lain DNA target
danDNA probe membentuk suatu ” hybdrid” karena keduanya saling melengkapi sekuen dan juga dapat
membentuk ikatan satu sama lain. DNA probe biasanya mengandung pelabelan radioaktif dengan γ-
[32P] dan polynucleotide kinase sering dengan pemindahan 5′ phosphate dari probe dengan
menggunakan alkaline phosphatase. Setalah itu membrane dicuci untuk menghilangkan ikatan probe
yang non spesifik, kemudian dengan memajangkannya pada film sinar X akan terbentuk warna hitam
apabila positif terbentuk ikatan antara DNA dan probe. Proses ini disebut autoradiography. Hal ini dapat
digunakan untuk mengidentifikasi ukuran DNA dan sejumlah fragmen gen kromosom dengan kekuatan
yang sama dengan fragmen gen yang digunakan oleh probe.

DAFTAR PUSTAKA

Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techiques in Molecular
Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ,USA.

Surzycky, R. 2000. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Inc., Belmont

Share this:

 Twitter

 Facebook

Leave a Reply

Go
Search

Hey, Look! It’s me :)

ichashare

Aisyatun Nur Laely (Icha) anak terakhir dari 3 bersaudara dari pasangan suami istri Herman Endy Suratno
dan Masnu'atu Sholihah dan adik dari Alvina Nur Fadhilla, Athia Nur Aziza. 19+ :)

View Full Profile →

date :D
M T W T F S S

« Dec

2 3 4 5 6 7 8

9 10 11 12 13 14 15

16 17 18 19 20 21 22

23 24 25 26 27 28 29

30

September 2019

my verified account :D

my verified account :D

Error: Twitter did not respond. Please wait a few minutes and refresh this page.

Categories

 Uncategorized

Blog Stats

 81,422 hits

Recent Posts

 (no title)

 (no title)
  (no title)

 (no title)

 (no title)

Recent Comments

Archives

 December 2014

 May 2013

 April 2013

 March 2013

Meta

 Register

 Log in

 Entries RSS

 Comments RSS

 WordPress.com

Aplikasi Android

Aplikasi Android

Blogroll

 Universitas Negeri Yogyakarta

 Ratih Dwi Utami's Site
 Sabar Nurohman's Site

Create a free website or blog at WordPress.com.

Close and accept

Privacy & Cookies: This site uses cookies. By continuing to use this website, you agree to
their use.
To find out more, including how to control cookies, see here: Cookie Policy
 Sample Page

 Archives

o June 2015

o October 2014

o September 2014

o May 2014

o November 2013

 Categories

o Uncategorized

In My life and My Dream

Blog mahasiswa Universitas Brawijaya

« Tugas bahasa indonesia (prospek pertanian di indonesia)

Comments Off on Bioteknologi Isolasi DNA

Bioteknologi Isolasi DNA

2015
06.17

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“Materi Isolasi DNA“

Nama : Reni Zuanita

NIM : 135040218113010
Kelompok : 2
Asisten : 1. Essensa Fitria K.
2. Freta Balladona

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Tanaman merupakan organisme eukariotik tingkat tinggi dan mempunyai DNA yang berada di
inti sel dan sitoplasma. DNA di sitoplasma dikenal sebagai DNA kloroplas dan mitokondria.
Karena jumlah DNA dari mitokondria dan kloroplas relative sedikit, maka DNA total yang
diperoleh dapat digunakan sebagai bahan untuk sintesis atau analisis DNA yang berada di dalam
inti sel (Suharsono, 2000).

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan
seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Menurut
Wilson, Keith and John (2010), Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau
dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya.

Isolasi DNA ini merupakan salah satu inovasi teknologi. Penerapan inovasi teknologi merupakan
salah satu kunci utama dalam pemanfaatan sumberdaya petani yang terbatas sesuai kondisinya
masing-masing. Dengan penerapan inovasi teknologiyang tepat diharapkan dapat dicapai
peningkatan produksi, produktivitas, peningkatan efisiensi dan mutu produk.

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel,
pemurnian DNA dari ekstraks sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan
hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA Jamilah (2005).

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum isolasi DNA adalah untuk mengetahui dan melakukan proses – proses
yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.
1.3 Manfaat

Dapat mengetahui dan melakukan proses – proses yang berkaitan langsung untuk melakukan
isolasi DNA.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian isolasi DNA

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis)
biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi
terlebih dahulu dan murni kandungannya.
(Wilson, Keith and John, 2010).
DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation
techniques which are developed were expensive. “Isolasi DNA merupakan tahap terpenting
dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat
mahal dan memerplukan waktu yang lama” (Listanto,1996).
Isolation of DNA is the process of identifying the DNA of an organism with a DNA extraction
process in the cell. ” Isolasi DNA adalah proses mengidentifikasi DNA dari suatu makhluk hidup
dengan suatu proses ekstraksi DNA di dalam sel” (Hatta, 2002).
2.2 Macam metode Isolasi DNA
A. Metode CTAB
Pada proses isolasi dengan metode CTAB dilakukan pembuatan bufer lisis (yang terdiri atas 0,2
M Tris-Cl pH 7,5 ; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2 M NaCl ; 2 % CTAB) dan bufer ekstraksi (terdiri dari 0,35
M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM EDTA ; dH2O). Potongan daun dimasukkan tabung 1,5
ml yang telah didinginkan dalam es, kemudian daun digerus dengan bantuan nitrogen cair.
Setelah itu ditambahkan bufer isolasi DNA (campuran bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl).
Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian diinkubasi selama 1 jam, pada suhu 65o
C. Setelah 1 jam ditambah 750 µl kloroform – isoamil alkohol (24 : 1). Setelah homogen larutan
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, 40 C, lapisan atas diambil dan
dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan larutan isopropanol dan divortex
perlahan. Sentrifugasi dilakukan selama 5 menit, 12.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian
supernatan dibuang. Pelet dicuci menggunakan 500 µl EtOH 70 %, kemudian disentrifugasi
12.000 rpm, 3 menit dan supernatan dibuang. Sentrifugasi dilakukan kembali dengan kecepatan
12.000 rpm, 1 menit, kemudian supernatan dibuang dengan mikropipet. Pelet dikeringkan dan
dilarutkan dengan 50 µl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada
suhu -200 C (Sambrook et al., 1989).

B. Metode CTAB
DNA genomik jarak pagar diisolasi dengan menggunakan 200 mg daun, yang dimasukkan ke
dalam tabung eppendorf dan digerus dengan bantuan nitrogen cair. Ke dalam tabung
ditambahkan 750 µl bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam
pemanas air selama 60 menit pada suhu 650 C. Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar,
campuran tersebut ditambahkan dengan 750 µl kloroform – isoamil alkohol ( 24 : 1 ). Campuran
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 40C. Lapisan atas
dimasukkan ke dalam tabung eppendorft lain yang mengandung isopropanol dan dicampur
merata. Setelah disentrifugasi selama 10 menit 11.000 rpm, endapan DNA dicuci dengan
menambahkan etanol 76 % dan dikeringkan. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam
25 µl bufer TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200 C

(Doyle and Doyle, 1990).

C. Metode SDS
Pada pemakaian metode ekstraksi sebelum berlangsungnya proses isolasi DNA dilakukan
pembuatan bufer pengekstrak yang terdiri atas 25 mM EDTA (pH 7,5), 50 mM TrisHCl (pH 8), 300
mM NaCl, SDS 1% dan H2O. Potongan daun tanaman jarak pagar dimasukkan tabung 1,5 ml
yang telah didinginkan dalam es, kemudian digerus dengan menambahkan 400 ul buffer
pengekstrak. Setelah cukup halus ditambahkan 100 ul buffer pengekstrak. Setelah itu diambil
400 ul larutan dan ditambah dengan 400 ul chloroform. Suspensi divortex sampai tercampur
merata, kemudian dan setelah homogen larutan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm
selama 1 menit pada suhu 40C. Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml,
kemudian ditambahkan 800 µl Etabol absilut. Larutan disentrifugasi selama 3 menit, 13.000
rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci kembali dengan menggunakan
500 µl EtOH 70 %. Supernatan dibuang, kemudian endapan dicuci kembali dengan etanol 70%,
dan disentrifugasi 13.000 rpm, pada suhu 40C Zheng et al (1995).
Supernatan dibuang kembali, dan pelet dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah
kering, pelet ditambah dengan 50 ul TE dan DNA disimpan pada suhu -200C (Zheng et al , 1995).
Hasil isolasi DNA dengan berbagai teknik tersebut kemudian dielektroforesis pada 0,8% gel
agarosa pada kondisi 50V selama 30 menit. Deteksi dilakukan menggunakan UV transluminator
dan dilakukan pemotretan gell (Fauziah, 2010).

2.3 Tahap Isolasi DNA

Ada 5 (lima) tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu:

1. Isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.
2. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan
(homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan
larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang
diinginkan ada di dalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel
yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan
dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.
3. Pengekstraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam
larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.
4. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan
tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal
tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh
temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA
dapat diisolasi secara utuh.

5. Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-
untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan
larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan
larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan
protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5
menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan Manfaat Isolasi DNA (khususnya bagi
pertanian).
(Istanti, 1999).
2.4 Manfaat Isolasi DNA
1. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
2. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi
Southern
3. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
4. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA
5. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA
secara in vitro melalui teknik PCR.
(Arumingtyas, 2012)

3.3 Analisis Perlakuan

Pada praktikum isolasi DNA yang pertama siapkan alat dan bahan. Objek isolasi DNA ini
menggunakan daun jagung dan daun kacang tanah. Campur buffer ekstraksi dengan carbon 0,5
gr dan mercaptoethanol 4 µl ke dalam tube 1 ml. Timbang daun tanpa tulang daun 0,1 gr
letakkan ke mortar dan tambahkan PVP 1 gr.

Gerus daun setelah ditambahkan N2 cair (segera digerus dan jangan sampai mencair). Masukkan
hasil gerusan kedalam tube 2 ml. Vortex tube dan inkubasi dalam oven dengan suhu 65 0C
selama 10 menit. Keluarkan tube dari oven dan dinginkan sebentar. Setelah dingin, tube di
sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. Ambil supernatan dan pindahkan ke
tube baru (bisa memakai tube 1,5 ml atau 2 ml).
Tambahkan 500 µl chisam pada supernatantyang sudah dipindahkan kemudian vortex.
Sentrifuge pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Pindahkan supernatant ke tube 1,5 ml
dan tambahkan chisam 500 µl, vortex kembali dan sentrifuge (10000 rpm 5 menit). Pindahkan
supernatan ketube baru (1,5 ml) dan tambahkan 300 µl isopropanol dingin secara perlahan,
bolak balik tube secara perlahan jangan sampai terguncang keras dan inkubasi dalam freezer
selama 15 menit.
Sentrifuge pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan buffer
pencuci 500 µl pada pellet dalam tube, vortex dan sentrifuge pada kecepatan 9000 rpm selama
5 menit. Buang supernatant dan keringanginkan pellet DNA selama ± 10 menit. Tambahkan
buffer TE sebanyak 50 µl dan larutkan pellet DNA dengan cara mengetuk ngetuk tube secara
perlahan. Amati DNA yang muncul pada daun kacang dan daun jagung.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil (DNA Terlihat/tidak + dokumentasi hasil)

(DNA kacang tanah dan jagung terlihat jelas)

4.2 Pembahasan (bandingkan dengan literature)
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam sumber DNA
yang dapat diperoleh dari tumbuhan. Pada praktikum isolasi DNA ini kami menggunakan daun
jagung dan daun kacang tanah. Dalam isolasi DNA ini daun yang di gunakan bukan daun yang
terlalu tua dan muda. Daun tersebut berwarna hijau tua. Biasannya daun tersebut di petik dari
bawah 2 helai atau bisa dikatakan daun yang tengah dan helai daun sudah masuk dalam kriteria.
Apabila daun yang di gunakan dalam isolasi DNA tersebut tidak tepat maka DNA akan tidak
terlihat. Karena salah satu faktor tidak munculnnya DNA di karenakan kelebihan unsur dan umur
daun yang tidak tepat. Selanjutnnya untuk mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan
merusak dinding sel. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat
beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil.
Selain pengrusakan secara fisik, membran dan dinding sel dapat pula dirusak dengan
menggunakan senyawa-senyawa kimia.

Untuk isolasi DNA kami menggunakan mortal,pstil dan nitrogen cair. Nirrogen cair ini berfungsi
sebagai merusak dinding sel. Dalam penghancuran di dalam mortar ini harus dengan cepat agar
diperoleh ekstrak sel yang halus. Menurut Kimball, J. John.(1992), Penghalusan digunakan untuk
memecahkan sel-sel secara mekanik. Jika proses penghalusan dilakukan terlalu lama,
dikhawatirkan tidak hanya memecahkan sel tetapi juga akan mencabik-cabik DNA, sehingga
DNAnya hancur. Sedangkan jika terlalu sebentar, sel-sel belum seluruhnya terpacahkan. Bahan
yang di gunkan selain nitrogen cair dalam isolasi DNA ini juga digunakan buffer CTAB dan bahan
yang lainnya.

Menurut Santoso (2005), mengatakan bahwa bufer CTAB dengan kandungan garam yang tinggi
dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel. Penggunaaan metode Modifikasi Doyle & Doyle
(1990) dengan nitrogen cair dan penambahan pelet juga membuat DNA yang muncul memiliki
intensitas yang baik. Hal ini sesuai dengan menurut Utami Anissa,dkk (2012), menyatakan pita
DNA yang diperoleh pada tahap pencucian pelet dengan etanol 76%. Pita DNA yang terlihat
memiliki intensitas yang cukup baik.

Dapat dilihat dari hasil pengamatan bawasannya adannya DNA yang muncul pada daun jagung
dan daun kacang. Dengan kasap mata DNA yang muncul tersebut terlihat sangat kecil berbentuk
seperti benang-benang halus tampak seperti kabut putih yang lembut dan memiliki intensitas
DNA yang baik. Dalam isolasi DNA ini tidak melakukan pengujian elektroforesis dan PCR
sehingga tidak diketahui pengamatan lebih lanjut tentang kuantitas dan kualitas dari DNA yang
diamati. Mungkin apabila dilakukan langkah berikutnnya seperti penggunaan elektroforesis dan
PCR DNA akan terlihat jelas dan jumlahnnya beribu-ribu. Selain itu, juga dapat di ketahui kualitas
dan kuantitas dari DNA kacang tanah dan jagung.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang kami lakukan maka dapat disimpulkan yaitu :
1. Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis)
biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah DNA rusak.
2. Isolasi bermanfaat sebagai visualisasi DNA dengan elektroforesis gel,peninjauan pola fragmen
DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern, isolasi DNA
genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik,isolasi plasmid atau DNA fage dalam
prosedur rutin peminakan DNA, isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam
prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.
3. Penghalusan digunakan untuk memecahkan sel-sel secara mekanik. Jika proses penghalusan
dilakukan terlalu lama, dikhawatirkan tidak hanya memecahkan sel tetapi juga akan mencabik-
cabik DNA, sehingga DNAnya hancur. Sedangkan jika terlalu sebentar, sel-sel belum seluruhnya
terpacahkan.
4. DNA yang muncul pada daun kacang tanah dan jagung terlihat sangat kecil berbentuk seperti
benang-benang halus tampak seperti kabut putih yang sangat lembut.

5.2 Kritik dan Saran

5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun Depan

Untuk praktikum selanjutnnya di harapkan untuk mencoba melakukan tahapan-tahapan
praktikum dan berpartisipasi dalam kegiatan praktikum. Jangan hanya melihat tutorialnya saja.
Agar nantinnya juga akan di peroleh manfaat dari praktikum isolasi DNA ini.

5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten

Untuk asisten harus bisa membawa suasana yang nyaman untuk praktikan yang berasal dari
kediri. Karena praktikan yang terlalu lelah dalam perjalanan jauh. Sehingga nantinnya praktikan
dapat mengikuti asisten dengan baik dan serius.

DAFTAR PUSTAKA

Annisa Utami, dkk. 2012. Variasi Metode Isolasi Dna Daun Temulawak (Curcuma xanthorrhiza
Roxb.). Biokimia FMIPA IPB Departemen 2 Pusat Studi Biofarmaka IPB: C206.
Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan.
Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot.
com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 25 Desember 2014.
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah.2005.Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas
(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum
Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Prtogram Sarjana Biologi.
Kimball, J. John. 1992. Biologi. Erlangga. Jakarta.
Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of
Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic untuk
polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor.
procedure for fruit crops. Jurnal Stigma XIV(1):1-4
 Santoso, P.J.2005. Modified CTAB-based DNA isolation
Suharsono. 2000. Penuntun praktikum pelatihan teknik pengklonal gen dan pengurutan DNA.
Pusat antar Universitas Bioteknologi. Institute Pertanian Bogor. Bogor.
Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada University Press. Yogyakarta.

This entry was posted on Wednesday, June 17th, 2015 at 12:18 and is filed
under Uncategorized. You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. You
can leave a response, or trackback from your own site.

Search...

 Recent Posts

o Bioteknologi Isolasi DNA

o Tugas bahasa indonesia (prospek pertanian di indonesia)

o C-ORGANIK DAN PENGAPURAN

o BI & BJ

o cacing tanah

 Archives

o June 2015

o October 2014

o September 2014

o May 2014

o November 2013

 Categories

o Uncategorized

 Meta

o Register

o Log in

o Entries RSS
 o Comments RSS

o WordPress.org

In My life and My Dream by Themebuilder | Entries (RSS) and Comments (RSS).