Contraste en microscopía

•Factores limitantes •Soluciones En general, las células son transparentes

para ver las células para ver las células

1) Pequeño tamaño 1) Lentes de aumento La mayor resolución del microscopio no

2) Transparencia 2) Métodos de contraste es suficiente para verlas. Se necesita el
contraste

Contraste en microscopía óptica Microscopía de luz: tinciones con colorantes

En general
•Tinción con colorantes
-Microscopio convencional
Otros
•Células sin teñir
-Microscopio de interferencia Muestra Interacción luz
-Microscopio de contraste de fases teñida y colorantes

•Tinción con fluorocromos

-Microscopio de fluorescencia
-Microscopio confocal

1. Tinción con colorantes Tinciones: muy variadas. Dos ejemplos

La tinción más rutinaria: Hematoxilina-Eosina Tricrómicos
Impregnaciones
•Hematoxilina (morado): (diferencia tejidos)
metálicas (Ag, Au, Cr…)
tiñe estructuras ácidas
(negativas) como DNA o Epitelio
RNA
•Eosina (rosa-naranja):
tiñe las proteínas
básicas (positivas) del Conjuntivo
citoplasma y de la Hematoxilina: núcleos
matriz extracelular Eosina: citoplasma Músculo

1
 2. Células sin teñir
Se pueden ver porque las estructuras celulares
modifican (retrasan) el paso de la luz
2. Células sin teñir
La luz se retrasa más o menor al atravesar regiones
con diferente índice de refracción → contraste
-Regiones menos densas, más claras
-Regiones más densas, más oscuras)

Las células sin teñir se ven con microscopios Estos microscopios permiten el
especiales estudio de células vivas
•Microscopio de contraste de fases

Con halo

•Microscopio de interferencia y de interferencia

diferencial (Nomarski) (variantes del primero)

Sin halo
3D

Contraste en microscopía óptica 3. Tinción con fluorocromos

En general
•Tinción con colorantes
-Microscopio convencional
Otros
•Células sin teñir
-Microscopio de interferencia
-Microscopio de contraste de fases

•Tinción con fluorocromos

-Microscopio de fluorescencia
-Microscopio confocal

2
 3. Tinción con fluorocromos Microscopio de fluorescencia convencional

•Sustancias que
absorben luz a una
l y la emiten en otra
l más larga (menos
energética)

Microscopios de fluorescencia
•Convencional (muestras finas)
•Confocal (muestras gruesas)

COMPRENDER

Microscopio de fluorescencia convencional Microscopio de fluorescencia convencional

•La luz atraviesa dos Las estructuras teñidas con los fluorocromos se
sistemas de filtros ven de color brillante sobre un fondo oscuro
2
•El primero (antes de la
muestra) solo deja pasar
la l que excita al
colorante fluorescente Membrana basal
usado (que la absorbe) 1
•El segundo solo deja
pasar la l emitida por el
colorante fluorescente
Células teñidas
con fluorocromos
Sección de epitelio y conjuntivo
COMPRENDER

Microscopio de fluorescencia convencional Microscopio de fluorescencia confocal

Pueden utilizarse varios fluorocromos Confocal laser scanning microscopy (CLSM)
(ejemplo: tres colorantes -verde, azul, rosa-)

Sección de músculo esquelético

Bart B. L. Groen et al. J Appl Physiol 2014;116:998-1005 ©2014 by American Physiological Society

3
 Confocal: diferencias con el convencional Microscopio confocal
•Iluminación con láser que pasa por un pinhole (1).
•Se enfoca un punto concreto (2) El punto que se ilumina por el laser es el que
•El detector solo capta la luz emitida por ese punto a se detecta: dos pinholes “confocales”
través de otro pinhole (3). No capta la luz que viene
de otros puntos (luz fuera de foco) (4)

3 4

COMPRENDER COMPRENDER

Microscopio confocal Corte grueso (20 mm). Intestino

Se puede captar un plano de puntos (2D) o Microscopio fluorescencia Microscopio fluorescencia
muchas imágenes y reconstruir la imagen convencional confocal
tridimensional (3D)

Permite enfocar todo el

Imagen borrosa grosor → imágenes 3D

Microscopio confocal El microscopio confocal permite el estudio de

Imágenes 3D de cortes gruesos, células células vivas y de pequeños organismos vivos
completas o pequeños organismos

Localización de
Oocito proteínas con
de ciclo circadiano
ratón (cerebro de
Drosophila)

4
 Ir haciendo resúmenes de cada parte del tema
Ejemplo. Contraste en microscopía óptica. CONTRASTE EN MICROSCOPÍA
En general Absorción l ELECTRÓNICA
•Tinción con colorantes Ejs. H-E, Tricrómicos
-Microsc. convencional Sales metálicas
No se usan colorantes sino metales
•Células sin teñir Retraso luz por ≠ pesados
-Microsc. de interferencia índice refracción
-Microsc. de contraste de fases Células vivas (osmio, uranio, plomo, platino,
tungsteno, oro, manganeso, vanadio,
•Tinción con fluorocromos Emiten > l; 2 filtros oro, plata...)
Cortes normales
-Microsc. de fluorescencia
-Microsc. confocal Cortes gruesos y
células enteras
(3D, digital)

Contraste en microscopía electrónica Haz de electrones

Electrones como partículas

Interacción entre electrones y Muestra

átomos de la muestra 1
2
2
Muestra 1
Pantalla 2. Ausencia de e-
Electrones fluorescente (dispersados)
dispersados
(no alcanzan 1. Los e- no dispersados
Electrones Oscuridad
la pantalla) hacen brillar la pantalla
no dispersados

Densidad a los electrones (electrodensidad):

Haz de electrones la capacidad de dispersión

Muestra
E- dispersados

Pantalla Nucleolo
fluorescente
Los e- no dispersados Vacuolas
Emulsión Áreas Áreas impresionan la
brillantes
fotográfica Luz oscuras
emulsión: se obtiene
un negativo
Papel El negativo se Denso a los e- Claras a los e-
fotográfico positiviza en papel (electrodenso) (no electrodensas)

5
 Dispersión de electrones Estructuras

Muy electrodensas
(negras)

Intermedias
(grises)

Esquema “simple” Esquema “real”

(todo o nada) Hay grados de Claras a los e-
dispersión (blancas)

Los electrones del haz se dispersan por interacción Densidad electrónica del material biológico
electrostática con los átomos de la muestra, •Átomos más frecuentes: pequeños
especialmente por la atracción del núcleo (positivo)
•Pocos átomos pesados E- E-
La dispersión (y → intensidad del contraste) es
E-
variable según los átomos de la muestra mayor a
mayor numero atómico) C, H, O, N +
P, S + Fe +
θ
Haz de electrones θ
θ

El material biológico, en general, dispersa poco a

+
+ los electrones  necesita contraste para
incrementar su poder dispersión
Se añaden metales pesados, que interaccionan
θ θ con las estructuras biológicas

Técnicas de contraste en TEM CONTRASTE POSITIVO

Todas utilizan metales pesados Las estructuras se ven en oscuro, “dibujadas”
La técnica depende del tipo de muestra
1. Contraste positivo (el habitual)
•En cortes
Réplicas Fawcett
2. Contraste negativo
Los metales pesados se unen con las moléculas
•En extensiones
Extensiones biológicas mediante alguna interacción química
(material particulado) Cortes
específica (unión covalente, electrostática…) →
3. Sombreado metálico donde están las moléculas biológicas hay
•En extensiones dispersión → hay densidad a los electrones
•En réplicas La unión diferencial de los metales refleja la
estructura de la muestra (membrana, gránulos…)

6
 Contraste en extensiones de Técnica de fraccionamiento celular y
material particulado centrifugación diferencial

•CONTRASTE NEGATIVO Permite obtener aislados y purificados los

•SOMBREADO METÁLICO componentes de las células eucariotas
-Microorganismos (virus, bacterias…)
-Componentes de las células eucariotas
(orgánulos, membranas, ribosomas…)
Previamente, fraccionamiento de las células
y separación de los orgánulos

1. Fraccionamiento 2. Separación

Separación: centrifugación diferencial Extensiones. 1. CONTRASTE NEGATIVO

El contraste (sales metálicas) rodea a las partículas

Harris

Virus. Contraste negativo Bacteria y bacteriófagos

Imagen real El contraste, que

rodea a las
partículas, no
permite el paso
de electrones,
que atraviesan
fácilmente el
material biológico
sin teñir.
Alberts

7
 El contraste negativo da la mejor resolución
en microscopía electrónica (1-2 nm)
Se usa para macromoléculas
Filamentos de actina
Extensiones 2. SOMBREADO METÁLICO
El metal se evapora, oblicuamente, sobre la
superficie de la muestra
•El metal se acumula en el lado de la muestra
próxima al foco de evaporación
•Queda una zona sin metal (“sombra”) en el
lado opuesto

•Además, queda
Monómeros de actina un fondo de
metal en el resto
de la red

Alberts

¿Cómo son las imágenes en el TEM? Imagen digital directa Imagen digital invertida
(ME) (photoshop)

Objeto oscuro,
sombra clara

Sombra clara Sombra oscura

Sombreado RÉPLICAS. SOMBREADO METÁLICO

Réplica de superficie Réplica sombreada

Copia de la superficie
suficientemente fina para
su observación al ME
transmisión
Unilateral Rotatorio
(moléculas filamentosas)

8
 (Proceso de vesiculación)
Preparación de una réplica sombreada Corte fino. Contraste +

Réplicas: visión 3D

Alberts

Contraste en microscopía electrónica. Resumen