356 1203 1 PB PDF
356 1203 1 PB PDF
Widya Dwi Rukmi Putri1*, Haryadi2, Djagal Wisesa Marseno2, M. Nur Cahyanto2
1
Fakultas Teknologi Pertanian - Universitas Brawijaya
Jalan Veteran, Malang, 65145
2
Fakultas Teknologi Pertanian - Universitas Gadjah Mada
Jalan Sosio Yustisio, Yogyakarta, 55281
*Penulis Korespondensi: email wid2putri@yahoo.com
ABSTRAK
Bakteri asam laktat yang tumbuh selama fermentasi growol (makanan tradisional
berbasis kasava) merupakan bakteri yang indiginus tumbuh pada media berbasis kasava.
Isolat yang mampu tumbuh pada media tinggi pati memiliki kemampuan amilolitik dan
berpotensi dimanfaatkan untuk produksi asam laktat dari pati mentah. Tujuan penelitian ini
adalah isolasi bakteri asam laktat amilolitik dari fermentasi kasava pada pembuatan growol dan
karakterisasi kemampuan isolat dalam produksi asam laktat dari pati mentah. Dua ratus tiga
puluh satu isolat telah diisolasi dari fermentasi kasava selama 0, 24, 48, 72, 96, dan 120 jam.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa sejumlah 63 isolat adalah bakteri asam laktat dengan
karakteristik gram positif, katalase negatif, tidak menghasilkan gas selama fermentasi gula. Tiga
belas isolat diantaranya adalah bakteri asam laktat dengan kemampuan tumbuh pada media
dengan pati sebagai satu-satunya sumber karbon. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa semua
isolat tergolong dalam genus Lactobacillus dengan spesies Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus
rhamnosus.
Kata kunci: growol, pati kasava asam, bakteri asam laktat, kemampuan amilolitik, Lactobacillus
ABSTRACT
Amylolytic lactic acid bacteria are a group of bacteria that capable to use starch as the only carbon
source. Lactic acid bacteria naturally present in growol (a traditional food from fermented cassava) is
an indigeneous bacteria that groww in cassava based media. The aims of this research were to isolate,
characterize, and identify lactic acid bacteria during growol fermentation. Two hundred and thirty one
colonies of lactic acid bacteria were isolated during 0, 24, 48, 72, 96, and 120 hours cassava fermentation.
Sixty three isolates were characterized as gram positive, catalase negative, and non producing gas from
glucose, but only thirteen isolates had amylolytic characteristics. Identification showed that all isolates
were Lactobacillus genera specifically Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus.
Keywords: growol, sour cassava starch, lactic acid bacteria, amylolytic ability, Lactobacillus
52
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
53
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
medium de Man Rogosa Sharp Agar (de Man kuantitatif. Masing-masing isolat berumur
(1960)) yang disuplementasi dengan 1.5% 24 jam diambil sebanyak 25 µL dan
CaCO3. Petridis diletakkan dalam kantong ditumbuhkan pada media pati terlarut
plastic kedap udara dan diinkubasi pada cair dengan komposisi 5 g pati terlarut,
suhu 37 oC selama 48 jam. Selanjutnya, koloni 5 g pepton, 5 g ekstrak khamir, 0.5 g
bakteri yang menghasilkan zona bening MgSO4.7H2O, 0.01 g, FeSO4.7H2O dan 0.01 g
dengan karakter yang berbeda dihitung NaCl yang dilarutkan dalam 1 liter akuades.
untuk enumerasi total bakteri penghasil Selama 0, 24, dan 48 jam inkubasi, media
asam. Isolat dengan zona bening dimurnikan cair diambil sebanyak 2 mL untuk diketahui
dengan metode streak plate, kemudian profil degradasi patinya. Untuk uji degradasi
ditumbuhkan dalam media agar tegak untuk pati 1 mL broth disentrifugasi untuk
analisis selanjutnya dan disimpan pada suhu mengendapkan sel bakterinya, kemudian
-40 oC dalam tabung mikro dengan medium supernatant diencerkan 100 kali dengan
MRS-gliserol 15% untuk penyimpanan akuades. Sebanyak 10 mL supernatan hasil
dan pengawetan isolat. Untuk setiap uji pengenceran dimasukkan tabung reaksi
karakterisasi isolat dari media agar tegak dan ditambahkan 1 mL larutan gram iodin.
diremajakan dalam 1.5 mL MRS broth dan Campuran dihomogenisasi dan absorbansi
diinkubasi selama 18–24 jam. Karakterisasi larutan yang membentuk senyawa kompleks
bakteri asam laktat (BAL) meliputi morfologi berwarna biru diukur dengan spektrometer
sel, pewarnaan gram, uji katalase, dan pada panjang gelombang 585 nm. Konsentrasi
produksi gas dari glukosa. Selanjutnya isolat pati sisa dari masing-masing supernatan
yang dikarakterisasi sebagai BAL diuji lebih dihitung berdasarkan kurva standar.
lanjut kemampuan amilolitiknya pada media
dengan pati sebagai satu-satunya sumber karbon. Identifikasi Bakteri Asam Laktat
Isolat dengan karakter gram positif,
Karakterisasi Kemampuan Amilolitik katalase negatif, tidak memproduksi gas
Bakteri Asam Laktat selama fermentasi, dan bersifat amilolitik,
Analisis hidrolisis pati secara kualitatif dikarakterisasi lebih lanjut kemampuannya
Isolat bakteri asam laktat digoreskan dalam memfermentasi 49 jenis karbohidrat
pada MRS agar dan diinkubasi pada suhu untuk diidentifikasi jenisnya menggunakan
37oC selama 24–48 jam. Selanjutnya masing- kit API 50 CHL (Biomerieux, Perancis).
masing koloni dari isolat diambil dan Isolat umur 24 jam digoreskan pada media
digoreskan dalam bentuk garis lurus pada MRS agar sehingga didapatkan koloni
media pati agar dengan pati merupakan satu- murni dalam jumlah banyak, selanjutnya
satunya sumber karbon. Komposisi medium disuspensikan pada medium API CHL
pati agar meliputi 10 g pati larut, 10 g pepton, dan dihomogenisasi. Suspensi isolat pada
5 g ekstrak khamir, dan 15 g agar per liter. medium API CHL diteteskan pada API
Setelah diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 CHL strips yang berisi substrat 49 macam
jam, masing-masing petri yang berisi isolat karbohidrat kemudian diinkubasikan pada
dituangi dengan larutan gram-iodin (0.5% suhu 37 °C selama 48 jam. Kemampuan isolat
kristal iodin ditambahkan pada larutan 1.5% dalam memfermentasi substrat diamati pada
larutan kalium iodida) untuk membentuk 24 dan 48 jam inkubasi. Perubahan warna
warna biru gelap karena terjadinya kompleks dari biru gelap menjadi kuning dinyatakan
pati-iodin. Strain dengan kemampuan sebagai perubahan yang positif. Hasil yang
amilolitik akan menghidrolisis pati pada diperoleh diolah dengan menggunakan
media di sekeliling tempat tumbuhnya dan software API 50 CHL sehingga didapatkan
dalam zona degradasi tidak terbentuk warna data jenis bakteri untuk masing-masing isolat.
biru, yang merupakan dasar deteksi dan
seleksi strain amilolitik. Zona bening akan HASIL DAN PEMBAHASAN
tampak setelah beberapa saat ditambahkan
larutan iodin dan kelebihan larutan iodine dibuang. Perubahan pH dan Jumlah Bakteri Asam
Laktat selama Fermentasi Kasava pada
Analisis Hidrolisis Pati secara Kuantitatif Pembuatan Growol
Isolat yang analisis kualitatif Hasil penelitian menunjukkan ter-
amilolitiknya menunjukkan hasil positif jadinya perubahan pH selama lima hari
diuji lebih lanjut dengan analisis amilolitik fermentasi kasava. Di awal hingga tiga hari
54
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
55
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
Tabel 1. Karakteristik isolat yang diisolasi dari perendaman kasava selama 0–120 jam
Jumlah isolat*
Karakteristik Jam ke-
Jam ke-0 Jam ke-24 Jam ke-48 Jam ke-72 Jam ke-96
120
Morfologi sel
- batang 30 34 36 28 35 27
- bulat 8 3 3 1 1 2
Pewarnaan Gram
- positif 24 16 17 18 23 13
- negatif 14 21 22 11 12 26
Katalase
- positif 9 10 8 6 7 5
- negatif 29 27 31 23 29 24
Produksi Gas
- positif 3 4 4 1 2 1
- negatif 35 33 35 28 34 28
* Jumlah isolat merupakan hasil isolasi dari air perendam dan umbi kasava
diinginkan lebih banyak berasal dari kasava memiliki kemampuan tumbuh pada pH
yang direndam dibanding air perendam, hal rendah (Tabel 2).
ini memberikan harapan bahwa isolat yang Isolat bakteri asam laktat UB5.H5S4
tumbuh adalah bakteri asam laktat yang memiliki kemampuan amilolitik yang
memang memiliki kemampuan tumbuh dan tertinggi dibandingkan isolat yang lainnya.
memanfaatkan kasava sebagai substratnya. Terjadi penurunan jumlah pati yang cukup
Penelitian terdahulu tentang isolasi besar setelah fermentasi 24 jam yang
bakteri asam laktat dari produk pangan menunjukkan kemampuan bakteri tersebut
berbasis kasava menunjukkan menunjukkan dalam produksi enzim amilase. Reddy et
hal yang sama. Fermentasi kasava pada al. (2008) menunjukkan beberapa strain
pembuatan fufu di Afrika menunjukkan peran Lactobacillus spp. menghasilkan amilase
bakteri asam laktat dalam pembentukan ekstraseluler dan memfermentasi pati
aroma, penghambatan bakteri pembusuk secara langsung menjadi asam laktat. Hal
dan patogen (Sobowale et al., 2007). Potongan ini disebabkan karena fermentasi dengan
kasava terfermentasi pada pembuatan gari BAL amilolitik akan menggabungkan dua
(makanan tradisional Afrika) juga telah proses yaitu hidrolisis enzimatis substrat
diteliti oleh Anike dan Okafor (2008), yang karbohidrat (pati) sekaligus fermentasi yang
menunjukkan bahwa hasil isolasi adalah memanfaatkan gula yang dihasilkan menjadi
Lactobacillus sp. yang merupakan jenis bakteri asam laktat.
asam laktat yang tumbuh dominan. Kemampuan BAL dalam mendegradasi
pati sangat dipengaruhi oleh karakter
Karakteristik Amilolitik Bakteri Asam bakteri tersebut dan hal ini berkaitan dengan
Laktat lingkungan isolat tersebut diperoleh. Seluruh
Sebanyak 63 isolat bakteri asam isolat yang digunakan dalam penelitian
laktat diuji kemampuan tumbuhnya pada ini adalah isolat hasil isolasi dari proses
media dimana pati merupakan satu-satunya fermentasi kasava pada pembuatan growol.
sumber karbon. Sebagian besar isolat (50 Isolat UA10 adalah isolat yang diperoleh
isolat) tidak mampu menggunakan pati setelah 72 jam fermentasi kasava. Jumlah
sebagai substratnya sedangkan 13 isolat gula yang tersedia bagi pertumbuhan
dapat tumbuh tetapi tidak memiliki zona mikrob pada kondisi tersebut sudah banyak
bening yang jelas, yang menunjukkan bahwa berkurang dan substrat utama yang tersedia
kemampuan amilolitik isolat tersebut lemah. adalah pati. Hal ini yang kemungkinan
Akan tetapi pengujian amilolitik kuantitatif menyebabkan isolat tersebut memiliki
menunjukkan bahwa terdapat lima isolat kemampuan amilolitik tinggi,
dengan kemampuan degradasi pati yang Fermentasi menyebabkan terjadinya
cukup besar pada pengamatan 0–48 jam perubahan karakteristik pati yang dise-
inkubasi, selain itu hampir semua isolat babkan terjadinya penyerangan granula-
56
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
Tabel 2. Kemampuan tumbuh isolat BAL pada medium pati dan pH rendah
Hidrolisis pati Jumlah BAL (absorbansi pada OD 600)***
Kode Isolat* (absorbansi pada OD
585)** pH 3 pH 4 pH 5
UB7.H1S3 0.032 0.160 3.275 7.923
UB3.H3S4 -0.071* 0.066 1.696 7.238
AB10.H4S4 0.124 0.068 1.544 6.883
UB5.H5S4 -0.003* 0.027 1.432 5.139
AA4.H2S1 -0.033* 0.109 3.530 6.936
AA5.H6S3 -0.026* 0.021 1.732 8.086
UA2.H2S2 -0.07* 0.056 3.428 8.308
UA10.H5S4 0.022 0.067 1.800 8.580
AA1.H6S2 0.127 0.084 1.737 6.787
AA2.H3S3 0.039 0.083 1.733 7.736
AA2.H4S4 -0.087* 0.081 1.694 8.225
AB6.H3S3 -0.03* 0.116 1.662 6.809
AA15.H1S3 0.046 0.039 1.598 6.792
Kontrol 0.007 0.004 0.083 0.102
Keterangan :
* Kode isolat
huruf A pertama menyatakan isolasi dari air perendam
huruf U menyatakan isolasi dari ubi kasava
huruf A kedua menyatakan isolasi dari batch fermentasi pertama (a)
huruf B menyatakan isolasi dari batch fermentasi kedua (b)
angka yang mengikuti huruf menunjukkan nomor isolat
** isolat dengan kemampuan tumbuh pada medium pati, nilai negatif menunjukkan penurunan nilai
absorbansi karena berkurangnya kepekatan warna iodin pada kadar pati yang lebih rendah
***kemampuan tumbuh BAL pada pH rendah diukur berdasarkan kekeruhan medium yang
menunjukkan bertambahnya jumlah BAL
granula pati oleh enzim sekaligus asam yang selama fermentasi dengan mengoksidasi
dikeluarkan oleh mikroorganisme yang bagian amorf dan selanjutnya secara
terlibat (Marcon et al., 2006). Degradasi pati simultan menghidrolisis amilosa dan
oleh bakteri asam laktat terjadi karena sumber amilopektin. Waktu yang dibutuhkan asam
karbon dibutuhkan bagi pertumbuhannya laktat untuk mendegradasi pati lebih panjang
sehingga bakteri menghasilkan enzim dibandingkan pemutusan ikatan oleh enzim.
amilase ekstraselular. Enzim ini memecah
ikatan polimer pati menjadi lebih pendek, Identifikasi Bakteri Asam Laktat Amilolitik
oligosakarida atau molekul gula sederhana, Identifikasi menggunakan API 50 CHL
sehingga uji iodin yang dilakukan dan interpretasi data menggunakan API
menyebabkan terjadinya perubahan warna software menunjukkan bahwa terdapat dua
yang berbeda. Identifikasi diperkuat dengan jenis spesies yang berbeda dari lima isolat
hasil penggunaan iodin untuk mewarnai yang memiliki karakter amilolitik (Tabel 3)
amilosa menunjukkan warna biru gelap, yaitu Lactobacillus rhamnosus dan Lactobacillus
yang terjadi karena pembentukan kompleks. plantarum. Isolat Lactobacillus plantarum
Kompleks tersebut terjadi akibat amilosa mendominasi jenis isolat yang tumbuh pada
membentuk kumparan heliks disekeliling perendaman kasava dibandingkan dengan
molekul iodin. Apabila polimer amilosa jenis Lactobacillus rhamnosus. Jenis isolat
terputus menjadi lebih pendek maka terjadi yang sama ternyata memiliki kemampuan
perubahan ikatan kompleks dengan iodin amilolitik yang berbeda-beda apabila
sehingga warna menjadi lebih muda, merah, diisolasi pada lama fermentasi yang berbeda
atau cokelat (Murphy, 2000). Asam laktat pula (Tabel 2). Berdasarkan pengamatan
juga dapat menyebabkan degradasi pati pertumbuhan selama fermentasi, L.
57
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
rhamnosus mulai tumbuh pada hari kedua 2002). Penelitian Kostinek et al. (2007) juga
fermentasi. Pada saat tersebut jumlah gula menunjukkan bahwa bakteri asam laktat
sederhana pada kasava sudah menurun yang dominan tumbuh pada fermentasi gari
dan mikrob yang tumbuh adalah yang (kasava terfermentasi) adalah kelompok
mampu memanfaatkan pati sebagai sumber bakteri asam laktat jenis Lactobacillus
karbon. Adapun L. plantarum yang tumbuh plantarum spp, sedangkan Weissella dan
mulai awal hingga akhir fermentasi dapat Leuconostoc adalah jenis bakteri yang
memiliki kemampuan amilolitik sebagai dominan berikutnya.
bentuk adaptasi terhadap lingkungan
media. SIMPULAN
Jenis dan kondisi media menjadi
penentu jenis dan kemampuan Perendaman kasava pada pembuatan
mikroorganisme dalam memfermentasi growol yang berlangsung selama 1-5
atau menggunakan pati sebagai substrat hari merupakan proses fermentasi yang
bagi pertumbuhannya. Hal ini menjadi melibatkan bakteri asam laktat dengan
penyebab beragamnya jenis isolat amilolitik kemampuan amilolitik yang berbeda.
yang diisolasi dari jenis media atau bahan Jenis bakteri asam laktat hasil isolasi
yang berbeda. Spesies L. manihotivorans didominasi oleh Lactobacillus plantarum
diisolasi dari fermentasi pati kasava (Guyot dan Lactobacillus rhamnosus berdasarkan
dan Guyot-Morlon, 2001), L. amylovorus dari identifikasi menggunakan kit API 50 CHL.
jagung (Nakamura, 1981), L. plantarum dari Kondisi media dan lama fermentasi terbukti
kentang dan kasava (Giraud et al., 1994), mempengaruhi jenis bakteri asam laktat
Lactobacillus fermentum dari (Agati et al., 1998; yang tumbuh dan kemampuannya dalam
Sanni et al., 2002) dan L. amylophylus dari mendegradasi pati. Penelitian lebih lanjut
substrat yang diperoleh dari bahan berpati dapat dilakukan dengan metode identifikasi
lainnya (Naveena et al., 2003; Vishnu et al., yang lebih akurat dan aplikasi bakteri asam
58
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
laktat hasil isolasi ini dalam memfermentasi Guyot JP, Brizuela MA, Rodriguez-Sanoya R,
pati kasava mentah. and Morlon-Guyot J. 2003. Characteri-
zation and differentiation of Lactobacil-
UCAPAN TERIMA KASIH lus manihotivorans strains isolatd from
cassava sour starch. International Jour-
Penulis mengucapkan terima kasih nal of Food Microbiology 87: 187-192
kepada Direktorat Penelitian dan Pengabdian Johansson ML, Sanni A, Lonner C, and Mo-
Kepada Masyarakat Departemen Pendidikan lin G. 1995. Phenotypically-based tax-
Nasional yang telah membiayai penelitian ini onomy using API 50 CH of lactobacilli
melalui Hibah Doktor Tahun 2009 melalui from Nigerian ogi, and the occurrence
Dana DIPA Universitas Gadjah Mada. of starch fermenting strains. Int J Food
Microbiol 25:159–68
DAFTAR PUSTAKA Kostinek M, Specht I, Edward VA, Pinto C,
Egounlety M, Sossa C, Mbugua S, Dor-
Agati VJP, Guyot J, Morlon-Guyot P, tu C, Thonart P, Taljaard L, Mengu
Talamond, and Hounhouigan D.J. M, Franz CMAP, and Holzapfel WH.
1998. Isolation and characteriza- 2007. Characterisation and biochemi-
tion of new amylolytic strains of cal properties of predominant lactic
Lactobacillus fermentum from fer- acid bacteria from fermenting cassava
mented maize doughs (mawe and for selection as starter cultures. Inter-
ogi) from Benin. J Appl Microbiol national Journal of Food Microbiology
85:512–20 114: 342–351
Anike N and Okafor N. 2008. Secretion of Lacerda ICA, Miranda RL, Borelli BM, Nunes
Methionine by microorganism associ- AC, Nardi RMD, Lachance MA, and
ated with cassava fermentation. Afri- Rosa CA. 2005. Lactic acid bacteria
can Journal of Food Agri. Nutr. and De- and yeasts associated with spontane-
velopment 8: 77-90 ous fermentations during the produc-
Camargo C, Colona P, Buleon A, and Mo- tion of sour cassava starch in Brazil. In-
lard D.R. 1988. Functional Properties ternational Journal of Food Microbiology
of Sour Cassava (Manihot utilissima) 105: 213-219
Starch: Polvilho Azedo.” Journal of the Marcon MJA, Vieira MA, Santo K, De Simas
Science of Food and Agriculture 81: KN, Amboni RDMC, and Amante ER.
429-435 2006. The effect of fermentation on
De Man JC, Rogosa M, and Sharpe ME. 1960. cassava starch microstructure. Journal
A medium for the cultivation of lacto- of Food Process Engineering 29: 362–372
bacilli. Journal of Applied Bacteriology 23: Morlon-Guyot J, Guyot JP, Pot B, de Haut
130–135 IJ, and Raimbault M. 1998. Lactoba-
Demiate LM, Dupuy N, Huvenne JP, Cere- cillus manihotivorans sp. nov., a new
da MP, and Wosiacki G. 2000. Rela- starch-hydrolyzing lactic acid bacte-
tionship between baking behavior of rium isolatd from cassava sour starch
modified cassava starches and starch fermentation. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:
chemical structure determined by 1101–1109
FTIR spectroscopy. Carbohydrate Poly- Murphy P. 2000. Handbook of Hydrocolloids.
mer 42: 149-158 Woodhead Publishing Ltd and CRC
Giraud E, Champailler A, and Raimbault M. Press LLC, New York
1994. Degradation of raw starch by a Muttarokah. 1998. Lactic Acid Bacteria in Fer-
wild amylolytic strain of Lactobacillus mented Food of Yogyakarta. Scription.
plantarum. Appl Environ Microbiol. 60: Faculty of Agricultural Technology.
4319–23 Gadjah Mada University, Yogyakarta
Guyot JP and Morlon-Guyot J. 2001. Effect of Nakamura LK. 1981. Lactobacillus amylolyti-
different cultivation conditions on Lac- cus: a new starch hydrolyzing spesies
tobacillus manihotivorans OND32T, an from swine waste corn fermentation.
amylolytic Lactobacillus isolatd from Dev Ind Microbiol 20: 531–40
sour starch cassava fermentation. In- Rascana AP. 1986. Microflora in Traditional
ternational Journal of Food Microbiology Growol Fermentation. Scription. Facul-
67: 217-225 ty of Agricultural Technology, Gadjah
59
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 1 [April 2012] 52-60
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri [Putri dkk]
60