Badan inklusi bakteri berfungsi sebagai kendaraan untuk respons sel T yang dimediasi

dendritic cell

Antigen imunogenik untuk vaksinasi sering dibuat melalui produksi protein rekombinan
menggunakanEscher-ichia coli.1 Sebagai produk sampingan, agregat yang disebut badan
inklusi (IB) dibentuk, mengandung sebagian besar bentuk yang salah dari protein rekombinan
yang diekspresikan secara berlebihan. 2. Pengaruh IB terhadap sistem kekebalan dan apakah
mereka dapat digunakan sebagai produk vaksin yang efektif tetap tidak diketahui. Penyesuaian
non-asli protein pada akumulasi dalam IBs membatalkan penggunaannya yang ditujukan untuk
menghasilkan antibodi afinitas tinggi. Namun, IBs menunjukkan sifat yang unik, termasuk
stabilitas mekanik dan termal karena sifat partikulat intrinsiknya, biocompat-ibility, kandungan
antigenik yang tinggi. , toksisitas rendah dan relativeresistance terhadap protease. Karakteristik
ini membuat IBs menarik sebagai formulasi vaksin antigenik untuk respon sel T terhadap
linearepitop. Apakah IB dapat memicu respons seluler adaptif yang diinisiasi melalui
penyerapan oleh sel dendritik untuk presentasi pada sel T tidak diketahui.

Kami menghasilkan IB yang mengandung epitop ovalbumin (OVA) -derivedOT-I dan OT-II
menggunakan urutan sinyal TorA diE. coli (Gbr.1a), seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Karena sel dendritik (DC) adalah tipe sel primer yang bertanggung jawab untuk aktivasi sel T,
pertama-tama kami menganalisis kapasitas imunogenik yang melekat pada IB secara langsung
pada sel-sel ini. IB berasal dariE. gangguan sel coliby dan sentrifugasi (Mentah), serta proses
tambahan pencucian berikutnya (Diproses; Gbr.1b). Sel-sel dendritik yang diturunkan dari
sumsum tulang (BMDC) dikultur dari sumsum tulang tikus tipe C57Bl / 6 liar, seperti yang
telah dijelaskan sebelumnya. Pematangan imunogenik dari BMDC diukur dengan ekspresi dari
penanda-penanda penghambat CD70, CD80, dan CD86, dan MHCClass I dan II kompleks
menggunakan flow cytometry. Baik IB yang tidak diproses (Mentah) dan yang diproses
menginduksi ekspresi CD70, CD80, CD86, dan MHC kelas I dalam cara yang bergantung pada
konsentrasi, sedangkan MHC kelas II diturunkan regulasi dengan konsentrasi IBs athigher (100
nM), seperti yang diamati dengan LPS (Gambar .1c). Selain itu, CD11c + DC limpa
menunjukkan pematangan yang bergantung pada konsentrasi yang sama oleh IB seperti halnya
BMDC. Meskipun IB adalah agregat partikulat yang secara struktural tahan terhadap metode
detoksifikasi, seperti pemisahan Triton-mediatedphase (mengeluarkan LPS gratis), IB jarang
endotoksin enam seperti LPS. dirasakan oleh TLR4 oninnate sel imun, menghasilkan MyF88-
mediated NFkBactivation, 7kami menguji efek pematangan yang diinduksi oleh IB pada
BMDCs yang kekurangan MyD88. Menariknya, kehilangan MyD88 di BMDC benar-benar
mencabut pematangan yang diinduksi IB (Gbr.1d), menunjukkan bahwa pensinyalan TLR
yang utuh diperlukan untuk IBs untuk inducematurasi dalam DC. Meskipun LPS gratis secara
efektif tidak ada pada IB yang diproses, pematangan BMDC oleh IB yang diproses bergantung
pada MyD88 dan tidak tergantung pada antigencen karena keduanya mengandung OVA
(Gbr.1d; hijau dan merah) dan IB yang mengandung GFP (Biru; Gbr.1d) menginduksi MyD88
DCaturatur yang tergantung. Singkatnya, IB menunjukkan kapasitas yang melekat untuk
menginduksi pematangan DC yang tergantung pada keberadaan MyD88, hilir pensinyalan
TLR.

IB memiliki kemampuan maturasi DC yang kuat, menunjukkan potensi mereka sebagai

kandidat vaksin, karena maturasi DC diperlukan untuk pemberian prima yang efektif untuk sel
T CD8 + dan CD4 + naif. Namun, tidak diketahui apakah DC dapat menginternalisasi dan
memproses antigen yang termasukIB untuk presentasi antigen. Oleh karena itu, basahi
kapasitas IB yang diproses untuk menginduksi presentasi antigen oleh DC ke sel T CD8 + dan
CD4 +. BMDC dikembangkan di hadapan OVA-IB, direkayasa untuk menyertakan OVA-OT-
I dan epitop OT-II yang diturunkan, atau protein ovalbumin selama 3 jam, dicuci secara luas
dan dikulturkan dengan OT-I CD8 + atau CD4 berlabel CFSE khusus berlabel antigen. + Sel
T transgenik O-TII selama 3 hari (Gbr.1e). Kami mengamati proliferasi yang bergantung pada
konsentrasi dan produksi IFN-oleh kedua-sel antigen-ICD8 + T dan OT-II CD4 + T sel setelah
kultur dengan BMDC berdenyut-IB (Gbr.1e). CD11c + DC limpa murni yang sarat dengan
OVA-IB juga mampu menginduksi proliferasi antigen spesifik dan produksi IFNγ pada sel T
CD8 + dan CD4 + (Gbr.1f). Proliferasi dan produksi IFN yang diinduksi oleh IB secara
signifikan lebih tinggi dari yang diinduksi oleh jumlah yang sama dari peptid sintetik yang
panjang yang mengandung urutan OT-I dan OT-II. Oleh karena itu, baik DCB yang dikultur
dan DC limpa CD11c + terisolasi mengambil, memproses dan menghadirkan antigen yang
diturunkan dari IB ke sel CD8 + dan CD4 +. Penyerapan, pemrosesan, dan penyajian antigen
eksogen pada MHC kelas I ke CD8 + Sel T adalah proses yang disebut lintas -
presentation.8TLR4 engagement, MyD88 signaling dan DCmaturation oleh LPS sebelumnya
telah terbukti meningkatkancross-presentation.9Oleh karena itu, kami menguji kapasitas
BMDCdari tikus yang kekurangan MyD88 untuk cross-present antigento yang diturunkan dari
IB CD8 + Tcells.MyD88-defisien BMDC menunjukkan pengurangan aktivasi sel T CD8 +,
sedangkan aktivasi sel T CD4 + tidak terpengaruh (Gbr.1g). Kuantifikasi preferensi untuk
presentasi silang (persentase yang dihitung dari sel CD8 + T yang awalnya direspon dibagi
dengan sel T CD4 +) menunjukkan penurunan presentasi silang yang signifikan ketika
pensinyalan MyD88 hilang. Oleh karena itu, pemberian sinyal TLR-MyD88 yang utuh
diperlukan untuk lintas presentasi yang optimal antigen yang diturunkan dari IB. Terakhir,
kami berhipotesis bahwa peningkatan penyajian antigen antigen yang diturunkan oleh IB
disebabkan oleh pembentukan depot intraseluler dan pelepasan antigen yang lambat dari IB
yang diinternalisasi. Untuk menguji ini, kami menginkubasi BMDC dengan IB (selama 3 jam
dan dengan pencucian pasca inkubasi yang luas) 24 jam sebelum kultur sel T atau tanpa
preinkubasi 24 jam (Gbr.1h). Menariknya, tidak ada pengurangan aktivasi sel T CD8 + yang
diinduksi. byIB diamati ketika DC dipreinkubasi dengan IB, menunjukkan presentasi silang
yang utuh dan berkelanjutan (Gbr.1 h). Sebaliknya, aktivasi sel T CD4 + menurun secara
signifikan dengan preinkubasi selama 24 jam, menunjukkan bahwa presentasi MHC kelas II
yang dimediasi oleh sel T CD4 + terjadi sebagian besar dalam 24 jam pertama setelah inkubasi
IB.

Setelah memverifikasi kapasitas IB untuk menginduksi presentasi DC-mediatedantigen ke sel

T, kami selanjutnya menyelidiki kapasitas IB untuk menghasilkan respons seluler de novo in
vivo. Pertama, secara tidak disuntikkan OVA-IBs disuntikkan dengan tikus agodyistic CD40
antibodyin, dan setelah 7 hari, mengukur persentase sel T CD8 +ovalbumin spesifik dalam
splenocytes byflow cytometry menggunakan H2-Kb OVA-tetramer (Gbr.1i). Induksi
signifikan sel T inantigen spesifik CD8 + diamati pada splenosit tikus yang diimunisasi setelah
7 hari (Gbr.1j). IB tanpa tambahan zat tambahan tidak menginduksi sel T CD8 + antigen
spesifik yang terdeteksi (data tidak ditunjukkan). Untuk menguji apakah induksi respon sel
dapat dioptimalkan lebih lanjut, kami memvaksinasi tikus dengan IB yang dikombinasikan
dengan pilihan bahan pembantu yang dikenal untuk meningkatkan respons sel T CD8 +,
termasuk CD40 agonistik, Poli I: C, AddaVax (MF59) dan ligan STING (DMXAA). AddaVax
andagonistic CD40 menginduksi frekuensi tertinggi sel T CD8 + sebagaimana diukur dengan
pewarnaan tetramer (Gbr.1k). Ketika IBsdikombinasikan dengan agonis CD40 atau AddaVax,
frekuensi tertinggi sel T CD8 + yang memproduksi sitokin IFNγ dan TNFα setelah restimulasi
peptida ditemukan (Gambar 1). Gbr.1m). Oleh karena itu, bahan pembantu dapat menentukan
besarnya tanggapan sel T CD8 + atau CD4 + terhadap IB. Tidak disimpulkan, kami secara
eksperimental menunjukkan potensi IB untuk digunakan sebagai vaksin untuk menginduksi
respon sel T CD8 + dan antigen spesifik yang kuat.