Anti Bodi Monoklonal
Anti Bodi Monoklonal
BAB I
PENDAHULUAN
A. Pengertian Antibodi
Antibodi dibuat oleh tubuh untuk merespon serangan bakteri atau virus.
Antibodi ini melindungi tubuh terhadap serangan infeksi. Antibodi dihasilkan oleh-
oleh sel limfosit dan dapat juga dihasilkan dengan menumbuhkan sel-sel ini dalam
laboratorium. Sel-sel tersebut kemungkinan menghasilkan sejumlah besar antibodi
yang sejenis, ini dikenal sebagai antibodi monoklonal. Untuk memahami bagaimana
hal ini bekerja, terlebih dahulu diperhatikan pengujian mekanisme alami dari tubuh
untuk membentuk antibodi. (http://id.shvoong.com/exact-sciences/biology/2274042-
pembuatan-antibodi-monoklonal-dengan-hibridoma/)
BAB II
PEMBAHASAN
Sebelum ditemukannya teknologi antibodi monoklonal, antibodi dahulunya
diperoleh dengan cara konvensional yakni mengimunisasi hewan percobaan,
mengambil darahnya dan mengisolasi antibodi dalam serum sehingga menghasilkan
antibodi poliklonal. Apabila dibutuhkan antibodi dalam jumlah besar maka binatang
percobaan yang dibutuhkan juga sangat besar jumlahnya. Selain itu bila diproduksi
dalam jumlah besar antibodi poliklonal jumlah antibodi spesifik yang diproduksi juga
sangat sedikit, sangat heterogen dan sangat sulit menghilangkan antibodi lain yang
tidak diinginkan, Maka dari itu dilakukan serangkaian penelitian untuk membuat
antibodi spesifik secara in vitro, sehingga dapat diproduksi antibodi spesifik dalam
jumlah besar, dan tidak terkontaminasi dengan antibodi lainnya.
Tahun 1975, Georges Köhler, César Milstein, and Niels Kaj
Jernemenemukan cara baru dalam membuat antibodi dengan mengimunisasi hewan
percobaan, kemudian sel limfositnya difusikan dengan sel mieloma, sehingga sel
hibrid dapat dibiakkan terus menerus. Antibodi yang homogen dan spesifik ini
disebut antibodi monoklonal. Berkat temuan antibodi
monoklonal GeorgesKöhler, César Milstein, and Niels Kaj Jerne mendapatkan
hadiah nobel di bidang fisiologi dan kedokteran pada tahun 1985. (Radji M. 2010)
Teknologi antibodi monoklonal yaitu teknologi menggunakan sel-sel sistem
imunitas yang membuat protein yang disebut antibodi. Sistem kekebalan kita
tersusun dari sejumlah tipe sel yang bekerja sama untuk melokalisir dan
menghancurkan substansi yang dapat memasuki tubuh kita. Tipa tipe sel
mempunyai tugas khusus. Beberapa dari sel tersebut dapat membedakan dari sel
tubuh sendiri (self) dan sel-sel asing (non self). Salah satu dari sel tersebut adalah
sel limfosit B yang mampu menanggapi masuknya substansi asing dengan
spesivitas yang luar biasa.
Dengan mengetahui cara kerja anti bodi kita dapat memanfaatkannya untuk :
keperluan deteksi, kuantitasi dan lokalisasi.
Teknologi antibodi monoklonal saat ini digunakan untuk deteksi kehamilan, alat
diagnosis berbgai penyakit infeksi dan deteksi sel-sel kanker.
Karena spesifitasnya yang tinggi maka Teknologi antibodi monoklonal dapat
digunakan untuk membunuh sel kanker tanpa mempengaruhi sel-sel yang sehat.
Cara imunisasi lain yang juga sering dilakukan adalah imunisasi sekali suntik
intralimpa (Single-shot intrasplenic immunization). Pada cara imunisasi konvensional
antigen dipengaruhi bermacam-macam faktor. Bila disuntikan ke dalam darah
sebagai besar akan dieliminasi secara alami, sedangkan melalui kulit akan tersaring
oleh kelenjar limfe, makrofag, dan sel retikuler. Hanya sebagaian kecil antigen yang
terlibat dalam proses respon imun. Oleh sebab itu untuk mencegah eliminasi antigen
oleh tubuh dilakukan suntikan imunisasi langsung pada limpa dan ternyata hasilnya
lebih baik dari cara konvesional.
1. Secara In Vitro
Thawing sel
Sel myeloma yang disimpan pada nitrogen cair cepat dicairkan padawater
bath dengan temperatur 37°C. Lakukan dengan cara menuangkan sel; 1 ml ke
dalam tabung yang mengandung 10 ml medium MPM yang telah dipanaskan 37°C.
Kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 450 g atau 1750 rpm,
stufe 3. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet diresuspensikan dalam 7 ml MPM
yang dipanaskan 37°C, setelah itu dimasukkan flash dan diinkubasikan selama 6
jam. Kemudian dilihat di bawah mikroskop inverted dan bila perlu dilakukan
perhitungan sel, jika selnya lebih dari yang diperlukan maka sel tersebut harus
diencerkan.
Pembekuan sel
Sel yang akan dibekukan sebaiknya sel yang berumur 2-3 hari agar setelah
di thawing sel yang hidup lebih banyak. Sel yang akan dibekukan pada
setiap tube/cryotube mengandung sel kurang lebih 2 x 10. Caranya yaitu sel yang
ditanam pada flash 45 ml dipanen dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 450
g selama menit. Supernatan yang positif klon Mab disimpan dan pelet
diresuspensikan dengan medium pembeku kemudian didinginkan secara pelan-
pelan dengan meletakkan dalam es selama 40 menit. Kemudian tambahkan medium
pembeku 1 ml yang telah didinginkan 4°C. Sel ditaruh pada styrophor dan disimpan
pada frezer 70°C selama 3 hari. Akhirnya sel disimpan di Nitrogen cair.
Kloning
Hitunglah sel dari mikroplate atau flash yang kecil kemudian diencerkan 500
sel per ml (4 ml per 96 well). Pada baris B-H diencerkan lagi sampai 7. Pada
pengenceran kei di uji. dua ditambahkan( 2 ml + 2 ml medium ). Setiap pengenceran
A-H stiap lubang (well) diberi 0,1 ml (1,2 ml). Sehingga setiap baris A 12 x 50
sel/well, untuk baris B 12 x 25 sel/well, dan seterusnya sehingga pada baris H 12 X
0,35 sel/well. Pengenceran dengan medium HT atau MPM/pyruvat ditambah
makrofag. Setelah 7 hari diuji. Klon yang positif pada pengenceran yang tinggi dipilih
dengan cara mengambil 2 ml kemudian dibekukan dan 1-2 kali dilakukan rekloning.
Fusi
1. Empat minggu sebelum fusi pasase 3 sel myeloma di kultur, kemudian diseleksi
dengah antidote HGPRT-defisiensi (dalam 6-Thioguanin atau 8 Azaguanin (mg/ml) 1
: 100 selama 1-2 minggu.
2. Sepuluh hari sebelum difusikan sel dicari eksponensial pertumbuahn sel (yang bagus
viabilitasnya harus 90%;
4. Mencit yang telah diimunisasi dilakukan booster sehari sebelum fusi, sel peritoneal 5
x 104/ml dilapiskan pada well 96 sebanyak 50 µl/well (sel peritoneal dipanen
sebanyak 3 ml);
5. Pada saat fusi, mencit dibunuh dan limfa diambil secara aseptis;
6. Limfa dimasukkan ke dalam medium yang bebas serum sebanyak 10 ml yang telah
dipanaskan 37°C dan kemudian dengan glass objek disayat-sayat kemudian ditekan
dengan pinset;
7. Sisa jaringan kemudian dimasukkan pada tabung 50 ml dan letakkan pada inkubator
selama 5 menit;
8. Supernatan diambil dan kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada level 3-4
dengan kecepatan 600 g atau 2000 rpm;
9. Pelet kemudian diresuspensikan dengan 0.83% NH4CL dan eritrosit dilisiskan pada
temperatur ruangan selama 2 menit;
10. Suspensi 9 ml medium dengan FCS dihangatkan dalam tabung 12 ml dan sel
myeloma pindahkan ke tabung 50 ml;
11. Kedua sel disentrifugasi dengan kecepatan 450 g atau 1750 rpm stufe 3 sampai 8
menit;
12. Kedua sel dipisahkan dengan cara mencuci menggunakan medium tanpa serum.
Myeloma mengumpul kemudian dipindah sebanyak 12 ml ke dalam tabung dan
sentrifugasi pada stufe 3 selama 5 menit.
13. Sel dihitung dan selanjutnya campur bersama dengan perbandingan 3 : 1, sel limfa :
myeloma kemudian disentrifugasi pada stufe 3;
14. Supernatan dipisahkan dengan sisa organ sedimen harus lembab, kemudian
diresuspensikan tanpa ada gumpalan:
15. Pada saat fusi semua medium dihangatkan, 44,4% 1 ml PEG dipanaskan selama
satu menit setelah autoklaf dan sebelum ditambah medium tanpa serum 1, 5 ml
selama 1 menit, 3 ml medium tanpa serum selama 2 menit dan sekali dicampur, 6 ml
MPM selama 2 menit dengan sekali dicampur;
16. Sel disentrifugasi dengan kecepatan 150 g atau 1000 rpm selama 1-2 menit;
17. Pelet diberi HAT dan diinkubasikan pada inkubator selama 30 menit, lakukan
dengan pelan-pelan;
18. Masukkan ke dalam plate klonisasi 9 x 105/well sekitar 2 tetes, 6 plate 96 well 2 x
105/well sampai kurang lebih 10 µl untuk 12 plate;
19. Setiap 3-4 hari di makan 3 x HAT dan HT dan setelah itu setiap 10 hari diuji . Untuk
lebih jelas lihat gambar 3.
Gambar 3. Cara hibridisasi sel limfosit limpha mencit yang telah diimunisasi dengan sel myeloma mencit.
Kultur Sel
Persyaratan kultur sel yang perlu diperhatikan antara lain desinfektan untuk
alat, lantai, gas dalam inkubator, antibiotik, dan bahan-bahan pel lainnya karen
atoksik terhadap sel terutama akan merusak metabolisme sel dan sitogenitas sel.
Oleh karena itu harus ada aturan standar tersendiri terhadap teknisi dan kelompok
kerja di laboratorium. Selain itu juga harus dihindari adanya gas di dalam
laboratorium. Bahan-bahan untuk pencuci gelas dan alat yang sudah teruji antara
lain 7X ant 7X-o-matic, RBS-vitro, Deconex 20 NS, Decon 90. Hal lain yang perlu
diperhatikan adalah cryotube untuk membekukan sel boleh digunakan hanya satu
kali, di samping Itu juga material dan alat-alat harus diberi tanda khusus untuk kultur
sel dan tdak diperbolehkan digunakan yang lainnya.
Penyimpanan bahan-bahan plastik harus diberi sirkulasi udara yang baik
sehingga tidak terjadi kerusakan bahan tersebut, karena banyak mengandung
formaldehid yang sangak toksik terhadap sel. Oleh karena itu palstik yang lama tidak
dapat dipergunakan lagi. Kualitas air pada laboratorium tissue culture harus
disediakan beberapa tingkatan kualitas air terutama untuk fusi sel seperti proses
pertukaran ion sangat penting misalnya osmose diperlukan kualitas air tingkat II atau
aqua bidest. Selain itu juga diperlukan dimineralisasi dengan cara pertukaran ion
yaitu kation dan anion yang nantinya digunakan selain untuk pengenceran atau
membuat larutan juga untuk pencucian alat. Aqua destilata yang diproses dengan
menggunakan spiral pemanas dari besi atau metal tidak bisa digunakan, sebaiknya
dari glas kuarsa karena tidak merusak proses ionisasi. Oleh karena itu kualitas air
merupakan syarat utama dalam mengerjakan kultur sel.
Medium
Setelah selesai membeli medium, masalah yang timbul biasanya adalah kualitas air.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan, bahwa medium yang masih di pak dan
diletakkan dalam lemari pendingin 4°C tidak boleh disimpan lebih dari 6 bulan,
sedang medium yang terbuka lebih tidak tahan lama. Medium sejenis ini tidak dapat
digunakan untuk hibridoma sel .
Penyimpanan medium yang tidak mengandung serum paling lama 6 bulan,
jika terlalu lama maka kualitasnya berkurang. Medium tidak dapat dibekukan karena
serum dapat menghindari terjadinya presipitasi calsium. Medium yang mengandung
L-glutamin tidak stabil karena sifat l-glutamin adalah labil, sehingga bila ditambahkan
pada medium , maka medium jika disimpan pada suhu 4°C tahan sampai 6 bulan,
sedang pada temperatur 37°C bertahan sampai 1 minggu. Tetapi jika serum akan
menguraikan enzyme. Oleh karena itu tidak baik jika medium mengandung L-
glutamin. Sebaiknya L-glutamin diencerkan 10 kai dan disimpan pada -70°C..
Medium RPMI-1640 sering digunakan untuk mengklon, tetapi bahan yang
baik untuk kloning adalah campuran RPMI-1640 dengan 20° medium 199 karena
medium campuran berpengaruh terhadap nukleotide, di mana memblok azaserin
dan aminopterin.
Gambar 4. Sel hibridisasi antara sel myeloma dari mencit dan sel limfosit mencit yang telah diimunisasi.
Pada gambar 4. Sel myeloma dari mencit dan sel limfosit mencit telah
diimunisasi , selanjutnya difusikan dengan menggunakan Poly Ethylen Glycol (PEG).
Agar sel yang berfusi dapat memproduksi imunoglobulin dan dapat hidup tanpa
adanya bahan tanpa adanya toksik, maka ditambahkan medium HAT (Hypoxanthin,
Aminopterin dan Thymidin). Medium ini digunakan untuk seleksi sel yang berfusi
akan hidup terus. Sedang sel yang tidak berfusi akan mati. Kemudian dilakukan uji
imunologi untuk menskrining sel hibrid yang dapat menghasilkan imunoglobulin
dilakukan klon dan dipindahkan ke tempat lainnya untuk kultur. Akhirnya dilakukan
uji imunologi kembali. Jika sel hibrid tidak dapat memproduksi imunoglobulin atau
negatif, maka sel hibrid dibuang dan sel hibrid yang positif dilanjutkan untuk dikultur.
Serum
Dalam penggunaan serum sebagai salah satu bahan penumbuh sel sebelum
dipakai harus dites terlebih dahulu dengan berbagai konsentrasi misalnya 10%, 5%,
atau 2%. Hal ini sebaiknya juga dites pada hibridoma yang sudah establish.
Ada beberapa serum charge seperti 55% charge foetal calf serum, 59%
charge newborn calf serum, 42 charge calf serum, 73% charge bovine serum.
Serum-serum ini sudah banyak dipasarkan. Uji untuk serum dapat dilakukan dengan
sel hibrid yang establish dan dilakukan pengamatan selama 1-3 minggu setelah fusi
atau menggunakan sel myeloma dengan phase pertumbuhan dengan cara
memasukkan sel sebanyak 2000 sel per well padamikroplate kemudian setelah satu
minggu diuji dengan mikroskop fase kontras atau dilihat kadar protein dan jumlah sel
yang tumbuh. Jika jumlah selnya meningkat maka serum tersebut dapat digunakan
untuk hibridoma.
Prosedur
1. Mencit dimatikan dengan cara dislokasi bagian cervikal atau di beri kloroform.
2. Bagian yang akan difiksasi dibuat aseptis dengan ethanol 80%, kemudian kulit perut
dibuka.
3. Masukkan 1-2 ml PBS dengan pipet pasteur dan lakukanlah pipetisasi keluar masuk
dengan pelan-pelan (sedot dan tekan).
4. Cairan diambil dan dimasukkan kedalam tabung conical 15 ml yang diletakkan di
atas es agar makrofage tidak menempel pada dinding tabung.
5. Hitunglah makrofag dengan menggunakan haemositometer.
6. Lakukan sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 500 g.
7. Masukkan sedimentasi (pellet) kedalam tabung conical 50 ml yang mengandung
medium HAT sebagai medium seleksi sel hibridoma. Jumlah makrofag setiap lubang
(well) 104/50 µl atau 1,5 x 104/ lubang pada mikroplate 24 well.
Polyethylenglycol (PEG)
Dalam penggunaan PEG untuk fusi yang perlu diperhatrikan adalah berat
molekul bahan yang akan difusikan. Berat molekul yang sesuai dengan
menggunakan PEG adalah sekitar 1000-6000. Dalam penyimpanan PEG yang
efektif tidak boleh lebih dari 2 bulan.
HAT
Bahan kombinasi ini sering digunakan untuk seleksi hibridoma. Aminopterin
dalam HAT sangat sensitif terhadap sinar dan juga pada -20°C kurang stabil. Bahan
ini tidak boleh disimpan lebih dari 6 bulan, begitu juga seleksi HAT melalui
hypoxantin-Azasern-Selektion (HAZ).
2. Secara In Vivo
Produksi Antibodi Monoklonal pada Mencit
Boyce sudah membuat dan mengamati pada mencit setelah diinjeksi dengan
mineral oil dan mineral adjuvant terbentuk plasmacytoma. Dari efek inilah sehingga
dapat menstimulasi hibridoma sel untu dapat proliferasi di dalam ruang peritoneum
mencit. Adanya reaksi ini mengakibatkan berdatangan sel adheren seperti
granulosit, makrofage ke dalam ruang peritoneum. Sehingga dengan adanya
pertumbuhan sel hibridoma terlihat terjadi keradangan pada perut/ruang peritoneum
mencit. Hal ini menandakan immunoglobulin diproduksi berupa asites dalam perut
mencit.
Untuk dapat mengkoleksi cairan asites dari mencit dilakukan dengan cara
melakukan punksi. Cairan tersebut mengandung konsentrasi antibodi yang tinggi
dibandingkan dengan antibodi yang diproduksi dengan cara kultur sel. Kandungan
antibodi rata-rata yang didapat sekitar 1-20 mg/ml atau sekitart 100 sampai 1000 kali
antibodi monoklonal yang diproduksi di kultur sel.
Dalam pemilihan hewan coba biasanya dikaitkan dengan asal sel myeloma
dan sel limfa yang akan digunakan. Sebagai contoh, jika sel linie myeloma
X63.Ag8.653 berasal dari mencit balb/c dan kemudian difusikan dengan sel limfa
dari mencit balb/c pula, maka hewan coba yang paling baik untuk menumbuhkan sel
tersebut adalah menggunakan mencit balb/c. Meskipun dapat juga menggunakan
generasi hibrid F1 dari balb/c dengan strain lainnya.
Bahan yang sering digunakan sebagai priming antara lainmineral oil pristan
(2,6,10,14-tetramethyl pentadecan) dan sebuah rantai alkan. Serta ajuvant freund
incompletes. Agen lainnya yang juga dapat menstimulir makrofage yaitu
thioglykolaat dan proteose-pepton. Dari banyak bahan yang digunakan
untuk priming ini dan hasilnya yang paling baik adalah selainIncompleet Freund’s
Adjuvant (IFA).
Jika setelah sekali injeksi sel hibridoma ke dalam ruang peritoneum tidak
muncul adanya tumor, maka dapat diulangi sekali lagisetelah 2-5 hari atau dapat
dilakukan ulangan berkali-kali. Jadi efek dari priming adalah mempercepat
pertumbuhan sel hibridoma dalam rongga peritoneum mencit.
Pada mencit yang diberi priming pristan 10-20 hari sebelum diinjeksi dengan
sel hibridoma mempunyai kecenderungan pertumb uhan sel hibridoma lebih cepat
dibandingkan dengan pemberian priming 1 hari sebelum diinjeksi, dan asites yang
dibentukotomatis lebih cepat. Dari beberapa waktu pemberian priming di atas yang
paling baik untuk produksi asistes dan dapat menghasilkan antibodi yang tinggi
adalah pemberian priming 10 hari sebelum diinjeksi sel hibridoma.
Pengambilan Asites
Asites dapat diambil jika sudah terlihat adanya produksi asites. Asites dapat
diambil berkali-kali, sehingga didapatkan volume aistes lebih banyak. Kerugiannya
jika diambil lebih dari sekali terkadang mencit mati. Pengambilan dengan cara
punksi ini maksimal pengambilan aistes 4-6 kali. Agar dalam pengambilan
mendapatkan cairan asites yang banyak maka perlu diinjeksi terlebih dahulu
dengan 5 ml cairan fisiologis larutan kochsal sebelum pengambilan.
Sel hibridoma yang dipanen dari rongga perut mencit adalah merupakan sel
yang sudah adaptasi di dalam rongga perut oleh karena itu setelah dilakukan
pemanenan asites, sel dapat diinjeksikan kembali pada mencit baru tanpa didahului
dengan pemberian priming. Sel ini dapat disimpan pada -80°C dan tahan sampai 6
bulan.
1. Berlangsung lama dan harus aktif untuk adaptasikan sel dalam perut mencit dan
selanjutnya dilakukan kokultivasi secara in vitro selama 3 bulan.
4. Pembentukan tumor pada setiap hewan sekitar 2-5 ml/mencit dengan konsentrasi
antibodi maksimal mg IgG/ml.
Kualitas Hibridoma
Hibridoma dikatakan baik jika daya sintesis antibodi monoklonal tinggi.
Pernyataan ini sangat penting jika menginginkan produksi antiboodi monoklonal
dalam kapasitas yang cukup banyak. Apakah ingin memproduksi atau mendapatkan
kultur hibridoma 10 µg/ml atau 50 µg/ml. Sampai saat ini sel myeloma dapat
menginduksi sintesis antibodi monoklonal. Oleh karena itu sekarang teknik ini
berkembang pesat untuk memproduksi antibodi monoklonal anti human. Selain itu
juga tidak banyak ditemukan mutagenesis pada subklone. Dengan demikian melalui
teknologi gen teknik kemungkinan yang akan datang didapatkan sel yang baik,
sehingga menghasilkan fusi yang baik. (Rantam : 2003)
Efek samping yang paling umum adalah demam, menggigil dan gejala
mirip flu lainnya, seperti nyeri otot, nyeri kepala dan rasa letih. Umumnya cepat
berakhir setelah masa pengobatan berakhir. Kadang-kadang, pasien merasakan
flushing mendadak dan merasa panas di wajah. Hal ini biasanya berlangsung amat
singkat. Beberapa pasien mengalami mual (mual) atau muntah. Obat anti muntah
(anti-muntah) umumnya sangat efektif dalam mencegah maupun meringankan
gejala-gejala ini sehingga lebih dapat ditoleransi.
Kadang-kadang, pasien merasakan nyeri pada bagian tubuh yang merupakan lokasi
limfoma. Nyeri biasanya ringan dan dapat diatasi dengan obat anti-nyeri biasa.
BAB III
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
http://biologigonz.blogspot.com/2010/02/membuat-antibody-monoklonal.html. Diakses 25
April 2012.
Radji, Maksum. 2010. Imunologi & Virologi. Penerbitan PT. ISFI, Jakarta.
(Online),http://vivalapharmacy.blogspot.com/2011/03/teknologi-pembuatan-antibodi-
monoklonal.html. Diakses 25 April 2012.
Watson, James D., etc. 1988. DNA Rekombinan, Suatu Pelajaran Singkat. Erlangga,
Jakarta.
http://4putradaritimur.blogspot.com/2012/05/laporan-anti-bodi-monoklonal.html