MAKALAH KIMIA INSTRUMEN

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Nama : Deviasti yuni ardiyani

No. / NIS : 10 / 9863
Kelas : 4 Kimia 2

SMK N 1 (STM Pembangunan) Temanggung

Jl. Kadar Maron Sidorejo kotak pos 104 Telp (0293)4901639 Temanggung
Web: www.stembatema.sch.id. Email: smkn1.marontmg@yahoo.co.id

2018/2019

BAB I
 PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan
antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat
padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903
menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun.
Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke
bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas
permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase
yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak
mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi
empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi cairan
kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah
mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi.
Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama.
Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat
menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja
pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter
kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1).
Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan
kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal,
HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik

B. Rumusan Masalah
1. Pengertian HPLC
2. Jenis- jenis HPLC
3. Instrument HPLC
4. Prinsip kerja HPLC
5. Aplikasi HPLC
6. Manfaat Penggunaan HPLC
7. Kelebihan dan Kekurangan HPLC
8. Penggunaan alat
 9. Analisa data
10. Preparasi sampel

C. Tujuan
a. Mengetahui Pengertian HPLC
b. Mengetahui Jenis- jenis HPLC
c. Mengetahui Instrument HPLC
d. Mengetahui Prinsip kerja HPLC
e. Mengetahui Aplikasi HPLC
f. Mengetahui Manfaat Penggunaan HPLC
g. Mengetahui Kelebihan dan Kekurangan HPLC
h. Mengetahui cara pengoperasian alat
i. Mengetahui cara pengolahan data

BAB II
PEMBAHASAN

A. Pengertian KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (H
PLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase
geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa
analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai
suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern,
yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan
yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa
kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari
kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom,
fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung
dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan
sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan
untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG,
namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada
pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

B. Jenis-jenis KCKT
1. Kromatografi Adsorbsi
 Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya
solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau
fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer.
Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH
fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang
terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut
dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan
dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak
air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan
kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan
ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus
(lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh
lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan
terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak
melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.
Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-
kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam
interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

C. Instrumen/Komponen High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat
untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi
cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :
1 . Wadah fase gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing
(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu
detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.

Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak
dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah
satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum
dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan
piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung
dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,
sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah
berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacement
 Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong
yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan
bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara
otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop
dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan
aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil
clan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum
Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir.
Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel
kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.
c. Loop Valve
Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang
sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD,
sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka
sampel akan masuk ke dalam kolom.

Syarat- syarat injektor yang baik :

 Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
 Mudah digunakan
 Keberulangan tinggi
 Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
4. Kolom
 Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.

Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :

Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan Panjang 25 dan 50 cm
25 cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran Porous, silika ukuran kecil,
kecil, silika yang silika yang dimodofikasi secara
dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau
kimiawi (bonded phase), polimer-polimer stiren/divinil
atau polimer-polimer benzen.Rata-rata diameter
stiren/divinil partikel 3,5 atau 10µm dengan
benzen.Rata-rata kisaran sempit.
diameter partikel 3,5 atau
10µm dengan kisaran
sempit.
Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasional (35-215 bar (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut

terklorinasi atau alkohol terklorinasi atau alkohol untuk
untuk fase normal. Untuk fase normal. Untuk fase terbalik
fase terbalik (reversed (reversed phase) digunakan
phase) digunakan metanol atau asetonitril + air
metanol atau asetonitril + atau bufer.Kecepatan alir 10-
air atau bufer.Kecepatan 100 µl/menit.Modifikasi
alir : 1-3 ml/menit instrumen
Sistem penghantaran pelarut
yang mampu memberikan
kontrol aliran di bawah
10µl/menit.Katup injeksi sampel
bervolume kecil;sel detektor
 bervolume kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat Sangat efisiensi dan sensitif,
dengan bekurannya akan tetapi lambat,konsumsi
ukuran partikel fase fase gerak hanya ¼ dari kolom
diam, akan tetapi umur konvensional.
kolom dengan ukuran
partikel 3 µm lebih
pendek.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:
 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100
μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar
dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara
kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan.
5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.
 Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
 mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
 mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat
kecil;
 stabil dalam pengopersiannya;
 mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
 signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran
dinamis linier);
 tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Jenis Maksimum Peka Sensitivitas
Pendeteksian sensitifitas terhadap suhu
kecepatan
alir
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
Elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

D. Prinsip Dasar High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-
senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase
mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang
mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan
tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.
Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat:
 Fasa Normal
 Fasa gerak nonpolar
 Fasa diam polar
 Fasa Terbalik
 Fasa gerak polar
  Fasa diam nonpolar

E. Prinsip Kerja High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan
asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang
paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang
mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat
RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka
kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di
dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom
yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa
carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk
tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk
analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh
pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram
akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram
dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan
menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample
jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke
HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit
mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
 F. Perawatan High Performance Liquid Chromatography(HPLC)
Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom, namun juga
pada bagaimana kolom digunakan secara umum, kolom yang sering digunakan adalah
Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baiksifat permukaan fisikokimia, berbagai ikatan
kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut protic.

Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.
 Stabilitas Ph
Kolom HPLC yang stabil dalam rentang Ph 2 sampai 8. Jika mengukur nilai Ph, pengukuran
harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut protic. HPLC kolom
dapat digunakan di luar rentang Ph. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai
Ph 1 untuk beberapa fasa diam.Fase stasioner didasarkan pada proti gel ultra murni juga dapat
digunakan pada rentang Ph yang lebih tinggi, sampai untuk Ph 11, tergantung pada sifat kimia
pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu
menyerang permukaan proti dan oleh karena itu dapat digunakan pada Ph lebih tinggi.
 Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat
stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di
lebih dari 40 Mpa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam
kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram
 Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari
kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan
mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.
 Penyimpanan Kolom
1. Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang digunakan
dalam terakhiranalisis.
2. Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir prot, kolom harus
dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
3. Untuk penyimpanan jangka panjang, proti kolom tersebut harus dapat disimpan dalam
pelarut protic. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%.Yang terbaik adalah
pelarut Asetonitril.

G. Kegunaan High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

 HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
  Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
 Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
 Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
 Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
 Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
 Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa
H. Kelebihan dan Kelemahan High Performance Liquid Chromatography(HPLC)
a. Kelebihan dari alat HPLC antara lain:
 Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang
tinggi.
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
 Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
 Kolom dapat digunakan kembali.
 Waktu analisa cukup singkat.
 HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak
stabil.
 Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
 Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

b. Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

 Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
 Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diamdengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali
dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
 BAB III

PENUTUP

Simpulan
Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair
dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan
beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam
tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan
kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya
diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut
(kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC.
Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini
mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

DAFTAR PUSTAKA
1. http://kimia40.blogspot.com/2016/10/makalah-kromatografi-cair-kinerja.html
Diakses pada 30 September 2019 pukul 12.30
2. http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html?m=1
Diakses pada 30 september 2019 pukul 12.40
3. http://laporannurainisolihat.blogspot.co.id/2015/02/makalah-kimia-analitik-kromatografi.html
Diakses pada 30 september 2019 pukul 13.00
4. https://www.academia.edu/37223745/KAJIAN_KANDUNGAN_PEMANIS_SINTETIS_NAT
RIUM_SAKARIN_DAN_NATRIUM_SIKLAMAT_DALAM_MINUMAN_CUP_YANG_TI
DAK_TERCANTUM_KADARNYA_DI_PASAR_TRADISIONAL_UJUNG_BERUNG_TU
GAS_AKHIR_Diajukan_untuk_Memenuhi_Syarat_Sidang_Tugas_Akhir
Diakses pada 30 September 2019 pukul 13.15
 ANALISA PEMANIS (SAKARIN) PADA SAMPEL MINUMAN
KEMASAN METODE KCKT

A. Alat
 Labu ukur, pipet ukur
 Pipet mikro
 Gelas kimia
 Timbangan analitik
 Corong
 Membran filter (kertas whatman No.42)
 Syiringe 20 µl (penyuntik sampel)
 Seperangkat alat KCKT Hitachi seri D-7000 buatan Jerman
 Kolom reverse phase (C18) dengan panjang 125 mm dan diameter dalam 4 mm
 Komputer

B. Bahan
 Larutan standar natrium sakarin yang diperoleh dari BPOM
 Metanol (HPLC grade, Merck)
 Asetonitril (HPLC grade, Merck)
 Aquabidest

C. Prosedur
a. Preparasi sampel
1. menyaring sampel menggunakan membran filter (kertas whatman no. 42) dan disonikasi
selama 10 menit.
b. Pembuatan larutan sakarin
1. Menimbang 5 mg natrium sakarin
2. Encerkan dalam labu takar 25 ml dengan menggunakan aquabidest sampai tanda batas
3. Dari larutan tersebut dipepet sebanyak 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, dan 6 ml kemudian
dilarutkan dan diencerkan dalam labu takar 10 ml dengan menggunakan aqubidest sampai
tanda batas
4. Kemudian larutan tersebut diukur luas area dan waktu retensinya dengan menggunakan
KCKT
c. Pengkondisian Alat untuk Pemanis Sintetis Natrium Sakarin
Kondisi optimum KCKT pada penelitian ini menurut metode Yuliany 2005 yang
dimodifikasi yang dicapai dengan menggunakan kolom oktadesilsilana (C18) dengan ukuran
partikel 5 µm, panjang kolom 125 mm dan diameter dalam 4 mm (pada suhu 27oC). Metode
isoktratik dilakukan pada penelitian ini dengan fase gerak Asetonitril : Air (5 : 95) dengan laju
alir 1 ml/menit, detektor yang digunakan adalah ultravoiolet pada panjang gelombang 200 nm
serta volume sampel yang diinjeksikan 20 µl
D. Data pengamatan

Sampel Tanggal Luas Kurva Konsentrasi

(Kemasan Cup) Kadaluarsa (AU) (ppm)
Sari Buah 07-042013 7235066 46,67
( Merk X ) 14-04-2013 9681199 63,75
30-04-2013 9421613 61,92
05-05-2013 8968045 58,71
28-05-2013 8023986 52,03
04-06-2013 8503596 55,42
22-06-2013 9586197 63,08
26-06-2013 10868662 72,15
04-07-2013 9049788 59,29
Sari Kelapa 01-02-2014 8482887 110,56
( Merk X) 28-02-2014 3145969 35,08
27-03-2014 3160300 35,29
02-05-2014 Td Td
04-05-2014 td Td
01-06-2014 td Td
04-06-2014 td Td
14-06-2014 6299498 76,68
19-06-2014 td Td
01-07-2014 td Td
Keterangan: AU = Absorban unit; td = tidak terdeteksi.

E. Kesimpulan
Hasil analisis tersebut menunjukkan bahwa keseluruhan sampel tidak melebihi batas
maksimum penggunaan natrium sakarin yang tercantum dalam permenkes RI No.
722/Menkes/Per/IX/1988 untuk minuman ringan yaitu sebesar 300 ppm. Sehingga sampel
layak dikonsumsi.