Tujuan :
Mewarnai jaringan/sel sehingga dapat ditelaah
jenis, sifat jaringan/sel tersebut dengan
mikroskop
Non-vital
Pewarnaan Vital
Supravital
Non-vital
Pewarnaan dilakukan setelah jaringan difiksasi
preparat awetan
Vital
Pewarnaan dilakukan terhadap jaringan hidup.
Jaringan diharapkan mampu menyerap warna
atau memfagosit partikel-partikel zat warna
mengamati perubahan sifat makan pada
Paramecium (pewarnaan congo red)
Supravital
Pewarnaan vital yang sifatnya lebih khusus.
Misalnya pewarnaan mitokondria hidup pada
mukosa mulut (janus green B), pewarnaan hasil
kultur sel (tripan blue)
IPB-Miktek/IV/1
Zat Warna
Senyawa organik kompleks yang mempunyai
kemampuan khusus untuk mewarnai bagian-bagian sel
dan dapat dipertahankan di dalam jaringan/sel
IPB-Miktek/IV/2
3. Menurut kemampuan mewarnai jaringan
• Zat warna substantif : zat warna yang dapat
langsung mewarnai jaringan dengan baik.
Contoh : neutral red, Janus green B
• Zat warna ajektif : zat warna yang dapat
mewarnai jaringan dengan baik jika diberi
mordan. Contoh : haematoxylen Ehrlich
• Zat warna metakromatis : zat warna tunggal
yang dapat memberi variasi warna pada
jaringan yang berbeda. Misal : Toluidine blue,
Thionin memberi variasi warna antara biru
sampai merah violet
• Zat warna polikromatis : beberapa zat warna
bekerja sebagai satu unit dalam pewarnaan.
Misal : Giemsa kombinasi zat warna merah
dan biru dari gugusan eosin dan thiazin
Cara pewarnaan
1. Berdasar jumlah zat warna yang diberikan
• Pewarnaan tunggal : hanya menggunakan
satu macam zat warna. Contoh : pewarnaan
carmine untuk melihat kromosom
• Pewarnaan rangkap dua : menggunakan dua
macam zat warna. Contoh : pewarnaan
haematoxylen Ehrlich-eosin; dan pewarnaan
safranin-fastgreen
• Pewarnaan rangkap tiga : menggunakan tiga
macam zat warna. Contoh : pewarnaan
Mallory triple stain (kombinasi acid fuchsin,
anilin blue dan orange G)
• Pewarnaan rangkap empat : menggunakan
empat macam zat warna. Jarang digunakan.
IPB-Miktek/IV/4
2. Berdasar pengaruh zat warna terhadap bahan
yang diwarnai
•Pewarnaan efektif : zat warna yang diberikan
hanya mempengaruhi satu atau beberapa
bagian jaringan saja. Contoh : pewarnaan
toluidin blue terhadap jaringan mesenterium
sehingga yang akan terwarnai jelas hanya
granula mast-sel
•Pewarnaan difus : zat warna yang diberikan
akan mewarnai seluruh jaringan. Hampir
semua zat warna bersifat difus. Contoh : eosin
mewarnai seluruh sel atau jaringan, hanya
daya serap setiap organel tidak sama
IPB-Miktek/IV/5
4. Berdasar ketebalan zat warna yang diberikan
• Pewarnaan progresif : pewarnaan sangat tipis;
untuk memperoleh warna yang tepat pada
jaringan perlu waktu yang lama
• Pewarnaan regresif : pewarnaan sangat tebal;
untuk mendapat warna yang tepat dilakukan
penipisan sedikit demi sedikit. Proses
penipisan disebut diferensiasi
IPB-Miktek/IV/6
Contoh penggunaan zat warna
untuk jaringan tumbuhan
Bagian sel yang hendak Zat warna yang digunakan
diamati
Dinding selulosa Hematoksilin, dimana mordan
langsung dicampurkan, Fast
Green FCF, Aniline blue,
Bismarck Brown Y, Acid fuchsin
IPB-Miktek/IV/7
Pelarut yang baik untuk pewarna sintetik
Pewarna Air Alkohol Minyak cengkih
(%) Methyl cello
solve
Acid fuchsin (asam) X 70 -
Anilin blue (asam) X 50 -
Bismarck brown 4 - 70 -
(basa)
Crystal violet (basa) X - X
Eosin Y (asam) - 70 -
Erythrosin (asam) - 95 X
Fast Green FCF - 95 X
(asam)
Orange G (asam) - 100 X
Safranin O (basa) X 50 – 95 X
Larutan hematoksilin
Ada beberapa macam larutan hematoksilin
dengan komposisi yang berbeda berdasar :
1. Mordannya
2. Komposisi mordan dengan zat warna
3. Asam yang ditambahkan untuk preservasi
4. Cara oksidasi hematoksilin menjadi
hematin
Hematoxylin bukan zat warna (tidak berwarna)
teroksidasi hematin (berwarna)
Oksidator yang umum dipakai :
KMnO4, NaI, FeCl2, HgCl2
Tipe Mordan
1. Alum: (aluminium potasium sulfat, aluminium
amonium sulfat)
2. Iron (sekaligus oksidator):ferric klorida, ferric
amonium suffat)
3. Molybdenum: phosphomolybdic acic
4. Lead (garam Pb)
IPB-Miktek/IV/9
1. Hematoksilin dari Ehrlich (oksidasi alami)
Hematoksilin 2g
Alkohol absolut 100 ml
Kalium alum 15 g
Gliserol 100 ml
Asam asetat glasial 10 ml
Aquades 100 ml
Campur dan peram lebih kurang 3-4 bulan dalam
botol tertutup, tanpa pemberian oksidator
Kegunaan: sitologi, alga, fungi, lumut.
IPB-Miktek/IV/10
3. Weigert’s Iron Hematoksilin
a. Hematoksilin 1g
Alkohol absolut 100 ml
Dicampur dan dibiarkan matang selama 4 minggu
b.Lar. besi(30% aqueous ferric chloride) 4 ml
HCl 1 ml
Aquades 95 ml
Dicampur dan disaring
Saat akan dipakai, tuangkan larutan a dan b (1:1)
Kegunaan: sitologi, lumut.
4. Belling’s Iron-Acetocarmin
As.asetat glasial 90 ml
Aquades 110 ml
Dipanaskan hingga mendidih lalu di + kan
Carmin 1g
Setelah dingin di +kan
Ferric acetat (aqueous) beberapa tetes
Kegunaan: sitologi (sediaan smear kromosom)
IPB-Miktek/IV/11
6. Eosin Y
Eosin Y 1g
Aquades atau alkohol 70% 100 ml
9. Anilin Blue-Orange G
Anilin Blue 0,5 g
Orange G 2g
Phosphomolybdic acid 1g
Aquades 100 ml
IPB-Miktek/IV/14
Salah satu contoh pewarnaan progresif :
pewarnaan tunggal hematoksilin dgn mordan terpadu
adalah hemalum (alum hematoksilin) modifikasi dari
hemalum Meyer.
Sifat mewarnainya:
- selektif untuk selulosa, pektin, & miselium fungi.
- sangat selektif bagi inti sel (interfase) & kromosom.
- memberikan hasil yang memuaskan untuk organ
meristematik, benang sari, ovari bunga, materi
yang sedikit mengandung lignin, & jaringan yang
mengalami sedikit diferensiasi.
- kurang selektif bagi penonjolan kloroplas.
IPB-Miktek/IV/15
Tabel 1. Bagan alur pewarnaan tunggal
Progresif Hemalum
Xilol I
5 menit
Alkohol 70%
2-5 menit
Carbol-xilol
Alkohol 50% 5-10 menit
2-5 menit
Alkohol absolut II
5-10 menit
Alkohol 30%
2-5 menit Alkohol absolut I
5-10 menit
Air suling
1-2 menit Alkohol 95%
5-10 menit
Hemalum Alkohol 70%
5-30 menit 5-10 menit
Air suling Alkohol 50%
1 menit 2-5 menit
Air mengalir Alkohol 50%
2-5 menit 2-5 menit
IPB-Miktek/IV/16
Pewarnaan yang paling umum pada tumbuhan:
IPB-Miktek/IV/17
Tabel 2. Bagan pewarnaan ganda Safranin-fast green Tahap
awal pewarnaan dan interval waktu sama seperti tabel 1.
Air Xilol III
Beberapa kali
Xilol II
Alkohol 30%
Xilol I
Alkohol 50%
Carbol-xilol
Alkohol 70%
Alkohol absolut I
Alkohol 95%
Alkohol absolut II
Fast-green dalam
Alkohol 95%
5-30 detik Alkohol absolut I
IPB-Miktek/IV/18
Pewarnaan rangkap 3: Safranin (1% dlm air)
Kristal violet (0.5-1% dlm air)
Orange G (lrtn jenuh dlm.
minyak cengkeh)
Safranin:
mewarnai kromatin, lignin, kutin, & kloroplas.
Kristal violet:
mewarnai benang-benang gelendong, nukleoli, &
dinding selulosa.
Orange G:
sebagai diferensiator, disamping memberikan
pewarnaan latar belakang, sitoplasma dan
dinding selulosa.
IPB-Miktek/IV/19
Tabel 3. Bagan pewarnaan rangkap tiga
Tahap awal pewarnaan dan interval waktu sama seperti tabel 1.
IPB-Miktek/IV/20
Pewarnaan Mineral
1. Aluminium
Metode Solochrome azurine
Fiksatif:umum
Pewarna:0.2% aquosa Solochrome azurine
(chelating agent terhadap Al dan Be)
Metode:
1.Jaringan berupa sayatan parafin dicelup ke
xilol, alkohol dan ke suasana air.
2. Diwarna dengan 0.2% Solochrome azurine
selama 20 menit
3. Dicuci air
4. Dehidrasi dengan alkohol, penjernihan
dengan xilol dan diberi media balsam.
IPB-Miktek/IV/21
Pewarnaan Mineral
2. Garam Pb (Lead)
Metode Rhodizonate
Fiksatif:umum
Persiapan larutan pewarna:
Sodium rhodizonate 200 mg
Akuades 99 ml
Asam asetat glasial 1 ml
Metode:
1.Jaringan berupa sayatan parafin dicelup ke
xilol, alkohol dan ke suasana air.
2. Diwarna dengan larutan pewarna
selama 1 jam
3. Dicuci air
4. Rendam dalam pewarna tanding 0.1% light
green dalam 1% asam asetat selama 2 mnt.
4. Tutup dengan media gliserin 30%
(semi permanen).