Anda di halaman 1dari 22

PEWARNAAN JARINGAN

Tujuan :
Mewarnai jaringan/sel sehingga dapat ditelaah
jenis, sifat jaringan/sel tersebut dengan
mikroskop
Non-vital
Pewarnaan Vital
Supravital
Non-vital
Pewarnaan dilakukan setelah jaringan difiksasi
 preparat awetan

Vital
Pewarnaan dilakukan terhadap jaringan hidup.
Jaringan diharapkan mampu menyerap warna
atau memfagosit partikel-partikel zat warna
 mengamati perubahan sifat makan pada
Paramecium (pewarnaan congo red)

Supravital
Pewarnaan vital yang sifatnya lebih khusus.
Misalnya pewarnaan mitokondria hidup pada
mukosa mulut (janus green B), pewarnaan hasil
kultur sel (tripan blue)
IPB-Miktek/IV/1
Zat Warna
Senyawa organik kompleks yang mempunyai
kemampuan khusus untuk mewarnai bagian-bagian sel
dan dapat dipertahankan di dalam jaringan/sel

Pembagian zat warna


1. Menurut sifatnya
• Zat warna asam : garam-garam dari asam-asam
pembawa warna dengan radikal basa yang tidak
berwarna. Sebagian besar zat warna asam
adalah garam-garam dari K atau Na. Contoh :
fast-green, acid fuchsin
• Zat warna basa : garam-garam dari basa-basa
pembawa warna dengan radikal asam yang
tidak berwarna. Sebagian besar zat warna basa
adalah garam-garam dari klorida atau fosfat.
Contoh : safranin, basic fuchsin, haematoxylen
2. Menurut asalnya
• Zat warna alam : dari tumbuhan atau hewan.
Contoh : haematoxylen dari tumbuhan
Haematoxylon campechianum. Dan carmine
dari Coccus cacti, yaitu serangga yang hidup
pada kaktus Opuntia coccinellifera
• Zat warna sintetis : zat warna yang dibuat dari
sintesis bahan-bahan kimia secara buatan.
Contoh : basic fuchsin, acid fuchsin

IPB-Miktek/IV/2
3. Menurut kemampuan mewarnai jaringan
• Zat warna substantif : zat warna yang dapat
langsung mewarnai jaringan dengan baik.
Contoh : neutral red, Janus green B
• Zat warna ajektif : zat warna yang dapat
mewarnai jaringan dengan baik jika diberi
mordan. Contoh : haematoxylen Ehrlich
• Zat warna metakromatis : zat warna tunggal
yang dapat memberi variasi warna pada
jaringan yang berbeda. Misal : Toluidine blue,
Thionin  memberi variasi warna antara biru
sampai merah violet
• Zat warna polikromatis : beberapa zat warna
bekerja sebagai satu unit dalam pewarnaan.
Misal : Giemsa  kombinasi zat warna merah
dan biru dari gugusan eosin dan thiazin

Mordan : substansi yang dapat memfiksasi atau


mengikat zat warna pada jaringan yang diwarnai.

Counter stain (background stain) : zat warna yang


berfungsi untuk memberi warna kontras dengan zat
warna yang lebih dulu diberikan. Contoh
haematoxylen Ehrlich atau haematoxylen Meyer
yang bersifat basa diberi counter stain eosin (asam)
yang akan mewarnai sitoplasma.
IPB-Miktek/IV/3
4. Menurut pelarutnya
• Zat warna aquosa : zat warna yang dilarutkan
dengan aquades
• Zat warna spirituosa : zat warna yang
dilarutkan dalam etanol persentase tertentu
• Zat warna jenuh dalam minyak cengkeh

Cara pewarnaan
1. Berdasar jumlah zat warna yang diberikan
• Pewarnaan tunggal : hanya menggunakan
satu macam zat warna. Contoh : pewarnaan
carmine untuk melihat kromosom
• Pewarnaan rangkap dua : menggunakan dua
macam zat warna. Contoh : pewarnaan
haematoxylen Ehrlich-eosin; dan pewarnaan
safranin-fastgreen
• Pewarnaan rangkap tiga : menggunakan tiga
macam zat warna. Contoh : pewarnaan
Mallory triple stain (kombinasi acid fuchsin,
anilin blue dan orange G)
• Pewarnaan rangkap empat : menggunakan
empat macam zat warna. Jarang digunakan.

IPB-Miktek/IV/4
2. Berdasar pengaruh zat warna terhadap bahan
yang diwarnai
•Pewarnaan efektif : zat warna yang diberikan
hanya mempengaruhi satu atau beberapa
bagian jaringan saja. Contoh : pewarnaan
toluidin blue terhadap jaringan mesenterium
sehingga yang akan terwarnai jelas hanya
granula mast-sel
•Pewarnaan difus : zat warna yang diberikan
akan mewarnai seluruh jaringan. Hampir
semua zat warna bersifat difus. Contoh : eosin
mewarnai seluruh sel atau jaringan, hanya
daya serap setiap organel tidak sama

3. Berdasar cara pemberian zat warna


•Pewarnaan simultan : dua macam zat warna
atau lebih diberikan secara bersama dalam
satu waktu. Contoh : pewarnaan Mallory yang
terdiri dari anilin blue dan orange G; aksi
kedua zat warna ini berlangsung bersamaan
•Pewarnaan suksedan : zat warna diberikan
pada jaringan secara bergantian dan dengan
pencucian sendiri-sendiri. Contoh :
haematoxylen dan eosin; safranin dan fast
green

IPB-Miktek/IV/5
4. Berdasar ketebalan zat warna yang diberikan
• Pewarnaan progresif : pewarnaan sangat tipis;
untuk memperoleh warna yang tepat pada
jaringan perlu waktu yang lama
• Pewarnaan regresif : pewarnaan sangat tebal;
untuk mendapat warna yang tepat dilakukan
penipisan sedikit demi sedikit. Proses
penipisan disebut diferensiasi

Untuk zat warna basa, larutan diferensiasinya asam;


misalnya HCl 0,1% dan asam asetat 1%

Untuk zat warna asam, larutan diferensiasinya basa;


misalnya air ledeng

IPB-Miktek/IV/6
Contoh penggunaan zat warna
untuk jaringan tumbuhan
Bagian sel yang hendak Zat warna yang digunakan
diamati
Dinding selulosa Hematoksilin, dimana mordan
langsung dicampurkan, Fast
Green FCF, Aniline blue,
Bismarck Brown Y, Acid fuchsin

Dinding berkayu (berlignin) Safranin, Crystal violet


Dinding berkutin Safranin, Crystal violet,
Erythrosin
Lamela tengah Iron hematoxylin, Ruthenium red
(material cut fresh)
Kromosom/inti Iron hematoxylin, Safranin,
Crystal violet, Carmine, Methyl
green, Methylen blue
Mitokondria Iron hematoxylin,Janus green B
Achromatic figure (struktur Crystal violet, Fast Green FCF
akromatik) = tidak berwarna
= mis.sitoplasma
Fungi berfilamen pada Iron hematoxylin, Safranin O,
jaringan inang Fast Green FCF
Sitoplasma Eosin Y, Erythrosin B, Fast Green
FCF, Orange G or gold orange

Plastida Crystal/methyl violet


Iron hematoxylin

IPB-Miktek/IV/7
Pelarut yang baik untuk pewarna sintetik
Pewarna Air Alkohol Minyak cengkih
(%) Methyl cello
solve
Acid fuchsin (asam) X 70 -
Anilin blue (asam) X 50 -
Bismarck brown 4 - 70 -
(basa)
Crystal violet (basa) X - X
Eosin Y (asam) - 70 -
Erythrosin (asam) - 95 X
Fast Green FCF - 95 X
(asam)
Orange G (asam) - 100 X
Safranin O (basa) X 50 – 95 X

Catatan : X menandakan paling bagus sebagai pelarut

Formula untuk larutan stok pewarna


1. 0,5 – 1% larutan dalam air (tambahkan beberapa
tetes metil alkohol 50% sebagai pengawet)
2. 0,5 – 1% dalam alkohol (kadarnya bervariasi dari
50% hingga 95%)
3. Minyak cengkih (larutan jenuh); minyak
cengkih+alkohol absolut 1:1; minyak
cengkih+alkohol absolut+methyl cello solve 1:1:1
IPB-Miktek/IV/8
Pengolahan zat warna

Larutan hematoksilin
Ada beberapa macam larutan hematoksilin
dengan komposisi yang berbeda berdasar :
1. Mordannya
2. Komposisi mordan dengan zat warna
3. Asam yang ditambahkan untuk preservasi
4. Cara oksidasi hematoksilin menjadi
hematin
Hematoxylin  bukan zat warna (tidak berwarna)
 teroksidasi  hematin (berwarna)
Oksidator yang umum dipakai :
KMnO4, NaI, FeCl2, HgCl2

Mordan (Umum digunakan untuk pewarna


hematoksilin dan carmin).

Tipe Mordan
1. Alum: (aluminium potasium sulfat, aluminium
amonium sulfat)
2. Iron (sekaligus oksidator):ferric klorida, ferric
amonium suffat)
3. Molybdenum: phosphomolybdic acic
4. Lead (garam Pb)
IPB-Miktek/IV/9
1. Hematoksilin dari Ehrlich (oksidasi alami)
Hematoksilin 2g
Alkohol absolut 100 ml
Kalium alum 15 g
Gliserol 100 ml
Asam asetat glasial 10 ml
Aquades 100 ml
Campur dan peram lebih kurang 3-4 bulan dalam
botol tertutup, tanpa pemberian oksidator
Kegunaan: sitologi, alga, fungi, lumut.

2. Harris’s hematoksilin (penambahan


oksidator)
Hematoksilin 2.5 g
Alkohol absolut 25 ml
Kalium alum 50 g
Aquades 500 ml
Mercuri oksida (HgCl2) 1.25 g
Asam asetat glasial 20 ml
Hematoksilin di larutkan dalam alkohol, kemudian
di tambahkan kalium alum yang telah dilarutkan
dalam akuades hangat.Campuran di didihkan dan
ditambahkan merkuri oksida.Setelah dingin di
tambahkan asam asetat. Pewarna siap pakai.
Kegunaan: sitologi, protalia paku, rodophyta, fungi

IPB-Miktek/IV/10
3. Weigert’s Iron Hematoksilin
a. Hematoksilin 1g
Alkohol absolut 100 ml
Dicampur dan dibiarkan matang selama 4 minggu
b.Lar. besi(30% aqueous ferric chloride) 4 ml
HCl 1 ml
Aquades 95 ml
Dicampur dan disaring
Saat akan dipakai, tuangkan larutan a dan b (1:1)
Kegunaan: sitologi, lumut.

4. Belling’s Iron-Acetocarmin
As.asetat glasial 90 ml
Aquades 110 ml
Dipanaskan hingga mendidih lalu di + kan
Carmin 1g
Setelah dingin di +kan
Ferric acetat (aqueous) beberapa tetes
Kegunaan: sitologi (sediaan smear kromosom)

5. Grenacher’s Alum Carmin


Carmin 1g
Aluminium amonium sulfat 5% 100 ml
Campuran didiihkan selama 10-20 menit
Kegunaan: material utuh

IPB-Miktek/IV/11
6. Eosin Y
Eosin Y 1g
Aquades atau alkohol 70% 100 ml

7. Acid Fuchsin (Mallory)


Acid Fuchsin 0,5 g
Aquades 100 ml

8. Anilin Blue (Mallory)


Anilin Blue 1g
Aquades 100 ml

9. Anilin Blue-Orange G
Anilin Blue 0,5 g
Orange G 2g
Phosphomolybdic acid 1g
Aquades 100 ml

10. Neutral Red (Jensen)


Neutral Red 1% aquosa 10 ml
Akuades 100 ml
Asam asetat 1% aquosa 0,2 ml
IPB-Miktek/IV/12
TEKNIK PEWARNAAN
A. Sediaan Utuh
Prinsipnya :
• fiksasi
• pencucian
• mewarnai dengan pewarna aquosa atau
spirituosa
• dehidrasi
• penjernihan
• penempelan pada gelas benda
B. Sediaan Sayatan (metoda parafin)
 sayatan sudah tertempel pada gelas benda
Prinsipnya :
• membuang parafin dari sayatan (rendam
dalam xylol)
• membawa jaringan ke situasi pelarut zat
warna
• zat warna aquosa  ke situasi cair
• zat warna spirituosa  ke situasi pelarut,
zat warna misalnya etanol 70%, 50%, dsb
• pewarnaan
• dehidrasi
• penjernihan
• penutupan dengan gelas penutup
• perekat  kanada balsam, entelan
IPB-Miktek/IV/13
Contoh : bagan pewarnaan rangkap
Zat warna I aquosa
Zat warna II spirituosa (dalam etanol 70%)

xilol I tutup dengan entelan


(kanada balsam)
xilol II
xilol II
etanol 100%
xilol I
etanol 90%
etanol absolut

etanol 70% etanol 90%

etanol 50% cuci dengan


etanol 70%
etanol 30%
zat warna II
dalam etanol 70%
zat warna I
aquosa etanol 50%

cuci dengan air etanol 30%

IPB-Miktek/IV/14
Salah satu contoh pewarnaan progresif :
pewarnaan tunggal hematoksilin dgn mordan terpadu
adalah hemalum (alum hematoksilin)  modifikasi dari
hemalum Meyer.

 Sifat mewarnainya:
- selektif untuk selulosa, pektin, & miselium fungi.
- sangat selektif bagi inti sel (interfase) & kromosom.
- memberikan hasil yang memuaskan untuk organ
meristematik, benang sari, ovari bunga, materi
yang sedikit mengandung lignin, & jaringan yang
mengalami sedikit diferensiasi.
- kurang selektif bagi penonjolan kloroplas.

 Lama perendaman dalam pewarnaan:


- bervariasi  bergantung materi dan pengalaman.
sebagai contoh:
 sel telur bunga lili  bila difiksasi dengan Bouin
diwarnai selama 10 '
 bila difiksasi dengan Craf 
diwarnai selama 60 '
 benang sari bunga lili  diwarnai selama 30 '

IPB-Miktek/IV/15
Tabel 1. Bagan alur pewarnaan tunggal
Progresif Hemalum

Xilol Resin dan


2-5 menit Gelas penutup
 Xilol III
Alkohol absolut 5 menit
2-5 menit
 Xilol II
Alkohol 95% 5 menit
2-5 menit 

 Xilol I
5 menit
Alkohol 70%
2-5 menit
 Carbol-xilol
Alkohol 50% 5-10 menit
2-5 menit
Alkohol absolut II
 5-10 menit
Alkohol 30%
2-5 menit Alkohol absolut I
5-10 menit
 
Air suling
1-2 menit Alkohol 95%
5-10 menit

Hemalum Alkohol 70%
5-30 menit 5-10 menit

Air suling Alkohol 50%
1 menit 2-5 menit

Air mengalir Alkohol 50%
2-5 menit  2-5 menit
IPB-Miktek/IV/16
Pewarnaan yang paling umum pada tumbuhan:

pewarnaan ganda: safranin (2% dalam air)


fast-green (0.5% dlm alk. 95%)

Hasil: warna yang kontras dan komplementer.

 Warna yang kontras diperoleh bila:


- lignin, kromatin, dan kutin  merah cemerlang
- kloroplast  merah jambu-merah
- dinding selulosa dan sitoplasma  hijau

 Lama perendaman dalam pewarnaan:


- bervariasi  bergantung materi dan pengalaman
- perendaman dalam safranin: 1-12 jam
- perendaman dalam fast-green: 5-30 detik

IPB-Miktek/IV/17
Tabel 2. Bagan pewarnaan ganda Safranin-fast green Tahap
awal pewarnaan dan interval waktu sama seperti tabel 1.

Safranin dalam air Resin dan


1-12 jam Gelas penutup


Air Xilol III
Beberapa kali

 Xilol II
Alkohol 30%


Xilol I
Alkohol 50%

 Carbol-xilol
Alkohol 70% 
 Alkohol absolut I
Alkohol 95%

Alkohol absolut II
 
Fast-green dalam
Alkohol 95%
5-30 detik  Alkohol absolut I

IPB-Miktek/IV/18
Pewarnaan rangkap 3: Safranin (1% dlm air)
Kristal violet (0.5-1% dlm air)
Orange G (lrtn jenuh dlm.
minyak cengkeh)

Safranin:
mewarnai kromatin, lignin, kutin, & kloroplas.

Kristal violet:
mewarnai benang-benang gelendong, nukleoli, &
dinding selulosa.

Orange G:
sebagai diferensiator, disamping memberikan
pewarnaan latar belakang, sitoplasma dan
dinding selulosa.

Hasilnya memuaskan dan sering digunakan dalam


riset yang menyangkut studi sitologi dan patologi.

IPB-Miktek/IV/19
Tabel 3. Bagan pewarnaan rangkap tiga
Tahap awal pewarnaan dan interval waktu sama seperti tabel 1.

Safranin dalam air Resin dan


4-24 jam Gelas penutup

Air Xilol
3 x penggantian 2 x penggantian

Crystal violet Bilas dengan xilol
10 menit-1 jam dipipet
 
Air
3 x penggantian Bilas dengan minyak
Cengkeh-xilol (dipipet)

Alkohol 50%
 Amati diferensiasi
di bawah mikroskop
Alkohol 95%
dipipet
 Banjiri dengan minyak
Alkohol 95% cengkeh baru
dicelup
 Bilas dengan minyak
Alkohol absolut cengkeh (dipipet)
2-3 x penggantian

Orange G Orange G
dibanjiri  ditiriskan

IPB-Miktek/IV/20
Pewarnaan Mineral
1. Aluminium
Metode Solochrome azurine
Fiksatif:umum
Pewarna:0.2% aquosa Solochrome azurine
(chelating agent terhadap Al dan Be)

Metode:
1.Jaringan berupa sayatan parafin dicelup ke
xilol, alkohol dan ke suasana air.
2. Diwarna dengan 0.2% Solochrome azurine
selama 20 menit
3. Dicuci air
4. Dehidrasi dengan alkohol, penjernihan
dengan xilol dan diberi media balsam.

Hasil: Aluminium &Beryllium berwarna biru.

IPB-Miktek/IV/21
Pewarnaan Mineral
2. Garam Pb (Lead)
Metode Rhodizonate
Fiksatif:umum
Persiapan larutan pewarna:
Sodium rhodizonate 200 mg
Akuades 99 ml
Asam asetat glasial 1 ml

Metode:
1.Jaringan berupa sayatan parafin dicelup ke
xilol, alkohol dan ke suasana air.
2. Diwarna dengan larutan pewarna
selama 1 jam
3. Dicuci air
4. Rendam dalam pewarna tanding 0.1% light
green dalam 1% asam asetat selama 2 mnt.
4. Tutup dengan media gliserin 30%
(semi permanen).

Hasil: garam Pb berwarna merah dengan


background hijau
IPB-Miktek/IV/22

Anda mungkin juga menyukai