Attachment
Attachment
ABSTRAK
Angiogenesis merupakan peristiwa pertumbuhan pembuluh darah baru, yang memungkinkan sel
kanker mendapatkan suplai nutrisi dan oksigen, sehingga dapat terus bertahan hidup. Pasak bumi
(Eurycoma longifolia, Jack) merupakan salah satu tanaman asli Indonesia yang memiliki potensi anti
kanker. Ekstrak metanol, butanol, kloroform, dan air dari akar pasak bumi terbukti memiliki efek sitotoksik
terhadap beberapa sel kanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiangiogenik ekstrak
metanol akar pasak bumi pada CAM embrio ayam. Uji penghambatan angiogenesis dilakukan dengan
membagi telur berembrio umur 8-9 hari dalam 8 kelompok perlakuan. Kelompok I sebagai kontrol paper
disc, kelompok II sebagai kontrol bFGF, kelompok III sebagai kontrol bFGF+ pelarut DMSO 0,8%, kelompok
IV, V, VI, VII dan VIII sebagai kelompok uji penghambatan angiogenesis, pada paper disc diberi bFGF 1 ng/μL
dan ekstrak metanol akar pasak bumi berturut-turut dengan dosis 20, 40, 60, 80 dan 100 μg/mL. Setelah
diinkubasi selama 3 hari (umur embrio12 hari), telur dibuka dan isi telur dikeluarkan, kemudian CAM yang
melekat pada cangkang diamati secara makroskopik dan mikroskopik. Ekstrak metanol akar pasak bumi
memberikan aktivitas antiangiogenik mulai kadar 40 μg/mL. Peningkatan konsentrasi ekstrak metanol akar
pasak bumi meningkatkan aktivitas penghambatan angiogenesis.
ABSTRACT
Angiogenesis is a neovascularization process which its function is to supply nutrient and oxygen for
cell survival. Pasak bumi is one of the Indonesian original plants having anti cancer activity. Extract of
methanol, buthanol, kloroform, and water akar pasak bumi was proved to have cytotoxic effect on cancer cell
culture. This research aim to know activity of antiangiogenic extract of metanol akar pasak bumi at
chorioallantoic membrane of chicken embryo. Antiangiogenic activity test conducted by divide 8-9 days old
egg embrio into 8 groups. Group I as paper disc control, group II as bFGF control, group III as bFGF control +
DMSO 0.8% solvent, group IV, V, VI, VII, and VIII as groups of treatment. Each groups of treatment were gave
by bFGF 1ng/µL extract of metanol akar pasak bumi respectively with concentration 20, 40, 60, 80 and 100
µg/mL concentration. After 3 days incubation, then the chorioallantoic membrane macroscopic and
microcospically analized. The antiangiogenic activity extract of metanol akar pasak bumi at chorioallantoic
membrane bFGF induce at used concentration, that is start from 40 µg/mL concentration. The increases of
the concentration also increase the prohibition activity to angiogenesis.
udara dan kerabang di atas embrio disucihamakan telur menjadi 2 bagian dimulai dari cangkang yang
dengan alkohol. Selanjutnya pada kedua daerah dekat dengan rongga udara, setelah itu membran
tersebut dibuat lubang kecil menggunakan sebuah korio alantois yang melekat pada cangkang
mini drill. diamati secara makroskopik dan mikroskopik.
Udara dari ruang udara diaspirasi dengan Pengamatan secara makroskopik dilakukan
bola karet sampai berpindah dari kutub ke dengan bantuan kaca pembesar, sedangkan
kerabang bagian atas telur. Perlakuan ini pengamatan secara mikroskopik dilakukan
dilakukan dengan posisi telur horisontal, di ruang terhadap preparat histologi dari CAM telur
gelap, dan melalui candling, sehingga ruang udara tersebut (Jenie et al., 2006)
buatan yang terbentuk di atas embrio dapat Parameter yang diamati dalam penelitian
terlihat. Kerabang telur di atas embrio dipotong adalah banyaknya pembuluh darah baru atau
dengan gergaji (mini drill) untuk membuat lubang respon angiogenesis pada CAM setelah pemberian
segi empat dengan luas 1 cm2. Melalui lubang ini ekstrak metanol akar pasak bumi (E. longifolia).
bFGF dan larutan uji diimplantasi ke dalam Evaluasi efek anti angiogenesis secara
membran korio alantois yang telah terbentuk, makroskopik dilakukan dengan menggunakan
setelah sebelumnya telur disucihamakan lagi dan modifikasi metode Knighton et al. (1977).
dimasukkan dalam laminar air flow dengan posisi Modifikasi yang dilakukan dengan menghitung
horisontal dengan ruang udara buatan terletak di jumlah pembuluh darah baru pada atau di sekitar
bagian atas. Subyek uji berupa telur dibagi dalam paper disc, kemudian diubah dalam skor. Data
8 kelompok (masing-masing kelompok perlakuan yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan
terdiri dari 5 telur), sebagai berikut: uji Kruskal Wallis dan Mann Whitney. Pengamatan
kelompok I adalah telur dengan implantasi secara mikroskopik dilakukan dengan mengamati
paper disc. preparat histologi CAM.
kelompok II kelompok telur terinduksi adalah
telur dengan implantasi paper disc termuati HASIL DAN PEMBAHASAN
bFGF 10 ng. Uji anti angiogenesis ini dilakukan
kelompok III kelompok kontrol bFGF + pelarut menggunakan metode yang dikemukakan oleh
adalah kelompok telur dengan implantasi paper Ribatti et al. (1997) yang telah dimodifikasi oleh
disc termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO 0,8 Jenie et al. (2006) yaitu tidak menggunakan
%) sebanyak 10 μL. gelatin sponges sebagai pembawa sediaan uji
kelompok IV, V, VI, VII dan VIII merupakan telur tetapi menggunakan paper disc steril. Penggunaan
yang digunakan untuk melihat efek paper disc memiliki kelemahan terutama
penghambatan ekstrak metanol akar pasak berkaitan dengan kemampuan daya serapnya.
bumi (E. longifolia) berturut-turut dengan dosis Selain itu pengamatan terhadap pembuluh darah
20, 40, 60, 80 dan 100 μg/mL. baru terganggu oleh adanya pembuluh darah asal
Telur pada kelompok perlakuan ini diberi dimana paper disc diimplankan dan adanya reaksi
implantasi paper disc ditambah bFGF 10 ng dan inflamasi non-spesifik, sehingga menyulitkan
ekstrak metanol akar pasak bumi (E. longifolia), ketika dilakukan kuantifikasi respon angiogenesis.
dengan variasi konsentrasi. Setelah diberi Namun modifikasi ini kemudian dikontrol dengan
perlakuan, telur diinkubasi pada suhu 39 °C menambah satu variabel pada percobaan yaitu
dengan kelembaban relatif 60 % selama 3 hari kelompok kontrol paper disc untuk meminimalisir
atau 72 jam (Ribbati et al., 1997), kemudian telur kelemahan tersebut.
dibuka (umur 12 hari) dan isi telur dikeluarkan.
Telur dibuka dengan cara menggunting cangkang
Tabel II. Hasil pengamatan angiogenesis kelompok kontrol bFGF + pelarut dan kelompok perlakuan
ekstrak metanol akar pasak bumi
Kelompok Perlakuan N Skor
1 Kontrol bFGF + pelarut 4 +3
2 bFGF + ekstrak metanol kadar 20 μg/ mL 4 +3
3 bFGF + ekstrak metanol kadar 40 μg/ mL 4 +2
4 bFGF + ekstrak metanol kadar 60 μg/ mL 4 +2
5 bFGF + ekstrak metanol kadar 80 μg/ mL 4 +2
6 bFGF + ekstrak metanol kadar 100 μg/ mL 4 +1
Kelompok kontrol berikutnya adalah terbentuk pada keseluruhan CAM, sehingga paper
kelompok kontrol paper disc dan pemberian disc bisa digunakan sebagai media pembawa
induktor bFGF untuk mengetahui potensi induktor dalam metode ini. Pada kelompok kontrol bFGF
tersebut terhadap munculnya pembuluh darah terlihat banyak sekali percabangan pembuluh
baru pada paper disc maupun disekitar paper disc. darah baru dari pembuluh darah CAM yang
Pada pembuatan seri kadar senyawa uji digunakan terbentuk sebelumnya dan terlihat di dalam paper
pelarut DMSO 0,8 % sehingga perlu diketahui disc maupun pada daerah di sekeliling paper disc.
apakah pelarut berpengaruh terhadap Berdasarkan hal ini berarti pemberian bFGF
pengamatan pada CAM atau tidak. Maka dilakukan memang benar bisa menginduksi terjadinya
kontrol pula terhadap paper disc yang diberikan angiogenesis. Pengamatan kelompok kontrol bFGF
induktor bFGF dan ditambahkan pelarut. Hasil + pelarut DMSO menunjukkan hasil yang tidak
pengamatan makroskopik terhadap ketiga kontrol jauh berbeda dengan penampakan CAM kelompok
tersebut tersaji pada tabel I dan gambar 1. kontrol bFGF. Terdapat banyak sekali pembuluh
Pengamatan secara makroskopik terhadap CAM darah baru terbentuk di dalam paper disc maupun
kelompok kontrol paper disc, menunjukkan bahwa pada daerah di sekeliling paper disc dengan pola
angiogenesis di dalam paper disc, maupun pada radial. Berdasarkan pengamatan ini, tampak
daerah di sekitar paper disc memperlihatkan bahwa pelarut yang digunakan tidak
gambaran yang sama dengan angiogenesis yang mempengaruhi keadaan CAM, sehingga dapat
Gambar 2. Pengamatan makroskopik pembentukan pembuluh darah pada kelompok perlakuan ekstrak.
Semakin tinggi kadar, kerapatan pembuluh darah di sekitar paper disc semakin berkurang.
Seri kadar ekstrak pada uji antiangiogenik ekstrak Factor, yaitu bFGF berinteraksi dengan sel
metanol akar pasak bumi didasarkan pada uji endothelial melalui reseptor tirosin kinase dan
sitotoksisitas yang dilakukan oleh Mustofa dan reseptor heparan sulfate proteoglycan (HSPGs) di
Qomariah. (2004), menunjukkan efek sitotoksik permukaan sel. Keseimbangan antara
dari ekstrak metanol pada sel HeLa dengan IC50 = penyimpanan dan pelepasan bFGF di matriks
46,9 – 58,6 μg/mL. Mengacu pada nilai IC50 ekstra selular mungkin adalah suatu pengaturan
tersebut maka dibuatlah 5 seri kadar dari ekstrak efek biologi dari faktor pertumbuhan ini di
metanol yaitu 20, 40, 60, 80 dan 100 μg/mL. Data endothelium. Angiogenesis merupakan suatu
uji anti angiogenesis ekstrak metanol akar pasak proses kompleks, dimana terjadi keseimbangan
bumi tersaji pada tabel II dan gambar 2. antara faktor pro angiogenik dan antiangiogenik.
Hasil pengamatan makroskopik terlihat Jadi untuk melakukan penghambatan
bahwa semakin tinggi kadar ekstrak, angiogenesis, penetralan terhadap salah satu
penghambatan terhadap angiogenesis juga faktor pro angiogenik (bFGF) sudah cukup untuk
semakin besar. Hal ini bisa dilihat dari kepadatan mengganggu proses keseimbangan angiogenesis
pembuluh darah yang semakin berkurang (Ribatti, 2002).
pada paper disc maupun disekitar paper disc. Penelitian mengenai anti angiogenesis
Pemberian ekstrak metanol kadar 20 μg/mL pada ekstrak metanol akar pasak bumi belum
belum memperlihatkan aktivitas penghambatan pernah dilakukan sehingga mekanisme
angiogenesisnya, baru pada pada kadar 40 μg/mL penghambatanyapun belum jelas diketahui.
mulai terlihat adanya penghambatan. Hasil uji Penghambatan angiogenesis merupakan sebuah
statistika Kruskal Wallis menunjukkan bahwa tawaran yang menarik untuk target terapi dengan
antara kelompok kontrol dan kelompok uji ekstrak toksisitas yang rendah. Berdasarkan pada
metanol dengan 5 seri kadar terdapat perbedaan kecepatan mutasi yang rendah pada kestabilan
penghambatan angiogenesis yang signifikan. Pada genetik sel endotelial, terapi antiangiogenik
uji Mann Whitney antara kadar 40 μg/mL, 60 adalah langkah awal untuk terapi tumor spesifik
μg/mL dan 80 μg/mL ekstrak tidak terdapat (Kleinsmith et al., 1999). Target terapi kanker
perbedaan penghambatan angiogenesis yang dengan penghambatan angiogenesis langsung
signifikan dengan skor yang sama-sama +2 dan pada sel endotelial yaitu sel pembentuk pembuluh
baru pada kadar 100 μg/mL ekstrak terjadi darah baru kemungkinan juga sangat
perbedaan penghambatan yang sangat signifikan berhubungan dengan mekanisme target terapi
dengan skor +1. Hasil uji ini menunjukkan bahwa kanker yang lain seperti menginduksi apoptosis
ekstrak metanol memiliki potensi sebagai anti terhadap sel endotelial, menghambat terjadinya
angiogenesis. proliferasi sel endotelial serta menghambat
Pemeriksaan mikroskopik respon terjadinya metastasis karena pembuluh darah
angiogenesis perlu dilakukan untuk mengetahui baru yang akan digunakan untuk metastasis dari
lebih jelas perubahan-perubahan yang terjadi sel kanker tidak terbentuk.
pada pembuluh darah CAM akibat perlakuan Penelitian mengenai efek senyawa hasil
ekstrak dan membandingkannya dengan isolasi ektrak metanol akar pasak bumi dalam
gambaran mikroskopik kelompok kontrol yang menginduksi apoptosis terhadap kultur sel HeLa
diberi induktor kanker dan pelarut DMSO. dilakukan Nurkhasanah and Pihie. (2006) yang
Gambaran mikroskopik ini hanya untuk kemungkinan berhubungan dengan mekanisme
mendukung hasil dari gambaran makroskopik. penghambatan angiogenesis secara langsung pada
Gambaran histologi (Gambar 3) sel endhotelial yaitu menghambat terjadinya
menunjukkan perubahan-perubahan yang terjadi migrasi dan proliferasi sehingga pembuluh darah
pada pembuluh darah CAM kelompok perlakuan baru tidak terbentuk. Pada proses ini, bila ada sel
bila dibandingkan dengan kelompok kontrol. Pada endhotelial yang tetap lepas bermigrasi
kelompok kontrol, terlihat jumlah pembuluh kemungkinan bisa dihambat melalui mekanisme
darah baru yang jauh lebih banyak bila dibanding apoptosis sehingga sel endhotelial tersebut tidak
pada kelompok perlakuan, sehingga bisa bisa berproliferasi membentuk pembuluh darah
menggambarkan bahwa ekstrak akar pasak bumi baru. Penghambatan pembentukan pembuluh
memiliki aktifitas anti angiogenesis pada suatu darah ini kemungkinan juga sangat berperan
kadar tertentu. Berdasarkan penelitian ini, dalam menghambat terjadinya metastasis karena
diketahui bahwa ekstrak metanol akar pasak bumi pembuluh darah baru juga menjadi salah satu
mampu menghambat angiogenesis meski belum jalan sel kanker untuk metastasis. Ada
bisa dipastikan mengenai mekanisme aksi kemungkinan metastasis sel kanker dengan cara
penghambatannya. Ada pun mekanisme yang lain yaitu melalui sistem limfatik, tapi masih perlu
terjadi pada pelepasan bFGF sebagai Growth studi lebih lanjut, apakah ekstrak metanol akar
pasak bumi dalam studi ini mempunyai Mustofa dan Qomariah N., 2004, Aktivitas
kemampuan untuk menghambat metastasis Antiplasmodial in vitro dan Sitotoksik Akar
melalui pembuluh limfa. Pasak Bumi terhadap malaria di Kalimantan
Selatan, Medika, 3, 147-152
KESIMPULAN Nurhanan M.Y., Hawariah L.P.A, Ilham A.M., Shukri,
Ekstrak metanol akar pasak bumi M.A.M, 2005, Cytotoxic Effects of the Root
mempunyai aktivitas antiangiogenik mulai kadar Extracts of Eurycoma longifolia,
40 μg/mL. Peningkatan konsentrasi ekstrak Jack,Phytother. Res. 19:994-996
metanol akar pasak bumi meningkatkan aktivitas Nurkhasanah and Pihie A.H.L., 2006, Apoptotic Cell
penghambatan angiogenesis. Death Induced by Eurycomanone
(Eurycoma longifolia, Jack) in Human
DAFTAR PUSTAKA Cervical Carcinoma Cells, Proceeding of
Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid V, International Conference on Mathematics
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, and Natural Sciences
hal 212-215. Ribatti, D., Gulandaris, A.,Bastaki, M., Vacca,A.,
Folkman, J,1996, Fighting Cancer by Attaching its Lurlalo, M., Roncali, L., Presta, M.,1997, New
Blood Supply, Scientific American 19: 116- Model for Study of angiogenesis and
119 Antiangiogenesis in The Chick Embryo
Giavazzi, R., Albini, A., Bussolino, F., DeBraud, F., Chorioallantoic Membrane: The Gelatin
Presta, M., Ziche, M., Costa, A., 2000, The Sponge/ Chorioallantoic Membrane Assay, J
biological basis for antiangiogenic therapy Vasc Res, 34: 455-463.
(meeting report), European Journal of Ribbati, D., Vacca, A., Presta, M., 2002, The
Cancer., 36: 1913-1918. discovery of angiogenic factors: A historical
Hanahan, D and Weinberg, R.A., 2000, The review, General Pharmacology., 35:227-231.
Hallmark of Cancer, Cell.,100:57-68. Sengupta, S., Toh S.A., Sellers L.A., Skepper, J.N.,
Jenie R.I., Meiyanto, E., Murwanti, R., 2006, Efek Koolwijk, P., Leung, H.W., Yeung H.W.,
antiangiogenik ekstrak etanolik daun Wong, R.N.S., Sasisekharan R., Fan, T.P.D,
sambung nyawa (Gynura procumbens 2004, Modulating Angiogenesis : The Yin
(Lour.) Merr pada membran korio alantois and the Yang in Ginseng, Circulation.
(CAM) embrio ayam, Majalah Farmasi 110:1219-1225
Indonesia, 17(1):50-55 Sun, X., Ding, Y., Yan, X., Wu, L., Li, Q., Ceng, N., Qiu,
Kleinsmith, L.J., Kerrigan, D, Kelly., 1999, Y., Zhang, M., 2004, Angiogenic synergistic
Angiogenesis,http://press2.nci.nih.gov/scie effect of basic fibroblast growth factor and
ncebehing/angiogenesis/angio00.html, vascular endothelial growth factor in an in
(diakses bulan Agustus 2008). vitro quantitative microcarrier-based three-
Knighton, D., D. Ausprunk, D.Tapper, and J. dimensional fibrin angiogenesis system,
Folkman, 1977, Avascular and Vascular World J Gastroenterol 2004; 10(17): 2524-
Phases of Tumor Grrowth in The Chick 2528
Embrio. Br.J. Cancer 35 no. 347-356.