Linckosides C – E, tiga glikosida steroid neuritogenik baru dari

bintang laut Okinawa, Linckia laevigata

1. Pendahuluan
Faktor pertumbuhan saraf (NGF) adalah yang pertama dan paling
berkarakter faktor neurotropik, dan penting untuk diferensiasi neuron,
pertumbuhan, kelangsungan hidup, fungsi pemeliharaan, dan pencegahan
penuaan di pusat dan sistem periferal.1–5 Meskipun NGF telah dipertimbangkan
sebagai kandidat obat untuk pencegahan dan pengobatan penyakit
neurodegeneratif, kimianya properti membatasi penggunaan medis NGF. Karena
itu, senyawa berat molekul rendah eksogen yang meniru atau meningkatkan
aktivitas neuritogenik NGF mungkin dikembangkan sebagai obat terapi yang
menjanjikan untuk mengobati neurodegenerative penyakit seperti penyakit
Alzheimer Garis sel PC12 berasal dari pheochromocytoma tikus sel telah
digunakan sebagai sistem uji in vitro untuk skrining zat tersebut oleh peneliti
karena diungkapkan sifat neuronal dalam menanggapi NGF.
Dalam pencarian kami sebelumnya untuk zat seperti itu dari alam sumber,
kami telah menemukan enam cerebrosides baru, termitomycesphins A – F, dari
jamur Cina yang dapat dimakan sebagai meniru kegiatan NGF. Selanjutnya, dua
glikosida steroid, linckosides A (1) dan B (2), telah diisolasi dari bintang laut
Okinawa, Linckia laevigata sebagai meniru dan sinergis dari kegiatan NGF.10 A
lebih lanjut pemeriksaan ekstrak bintang laut telah membawa kami ke pemurnian
tiga congener bernama linckosides C (3), D (4), dan E (5) (Gbr. 1). Dalam tulisan
ini, kami ingin melaporkan isolasi, struktur dan kegiatan biologis ini senyawa
bioaktif baru.
2. Hasil dan diskusi
2.1. Isolasi
Bintang laut L. laevigata (911 g, basah) dikumpulkan di Okinawa,
Jepang, dikeringkan dan diekstraksi dengan MeOH. Ekstrak MeOH dihilangkan
lemak dan kemudian dipartisi antara EtOAc dan air. Lapisan berair itu dikenakan
kromatografi kolom ODS diikuti oleh HPLC fase terbalik berulang untuk
menghasilkan linckosides C (3,0,0005%) dan D (4, 0,0006%). Pemeriksaan
sebuah Fraksi HPLC yang diperoleh dalam pekerjaan sebelumnya menggunakan
bintang laut lain (285 g, basah) 10 memberikan tambahan congener linckoside E
(5, 0,0008%).
2.2. Penjelasan struktural
 Linckoside C (3) memiliki formula molekul C41H70O14 ditentukan oleh
pengukuran SDM ESI-MS.

Gambar 1. Struktur linckosides A – E (1-5) dan beberapa senyawa steroid terkait

6-9. Tanda bintang di C-24 dan C-28 dari 3 dan 4 menunjukkan stereokimia
relatif.
Pita serapan IR pada 3421 cm 1 menunjukkan adanya gugus hidroksil. Spektrum
1H dan 13C NMR dari 3 serta percobaan HMQC menunjukkan adanya 10
oksimetin, 3 oksimetilena, 1 karbon kuaterner teroksigenasi, dan 1 gugus
metoksil (dH 2,82-4,30, dC 61,1-84,9), dua karbon anomer (dH 4.41 dan 4.17,
dC 104.6 dan 105.6, masing-masing), ikatan ganda bersubstitusi (dH 5.63, dC
126.9 dan 148.6) dan dua karbon sp3 kuaterner (dC 37.7 dan 45.1) (Tabel 1).
Sinyal proton dan karbon yang tersisa dikaitkan dengan enam metil, tujuh metin,
dan tujuh metilena. Resonansi karena proton dan karbon anomer dan banyak
fungsi teroksigenasi lainnya menunjukkan adanya dua bagian gula. Analisis
spektrum DQFCOSY dan HOHAHA mengarah pada penentuan struktur parsial
yang digambarkan dengan huruf tebal. ikatan pada Gambar 2. Meskipun korelasi
DQFCOSY antara H-23 dan H-24 tidak jelas, spektrum HOHAHA
mengkonfirmasi konektivitas mereka. Struktur parsial ini dihubungkan oleh
korelasi H-C jangka panjang yang diperoleh dari percobaan HMBC untuk
memberikan struktur kotor 3. Korelasi HMBC penting dirangkum dalam Gambar
2 dengan panah. Korelasi dari anomerik H-10 ke C-3 dan anomerik H-100 ke C-
29 mengungkapkan lokasi gugus gula. Gula yang terhubung ke C-3 ditentukan
sebagai 2-ethylxylopyranose oleh korelasi NOE dari H-10 / H-30, H-10 / H-50a,
H-20 / H-40, dan H-30 / H -50a (Gbr. 3), dan dengan perbandingan data 13C
NMR dengan data yang dilaporkan. Konfigurasi-b unit gula ini disimpulkan oleh
konstanta kopling J10-20 ¼ 7: 6 Hz. Gula gula lain yang terkait dengan C-29
ditentukan sebagai b-xylopyranose berdasarkan korelasi NOE dari H-100 / H-
300, H-100 / H-500a dan H-200 / H-400 (Gbr. 3) , konstanta kopling J100 –200
¼ 7: 6 Hz, dan data 13C NMR yang dilaporkan.

Gambar 2. Struktur kotor linckoside C (3) dengan korelasi NMR 2D.

Untuk menentukan stereokimia absolut gula bagian dari 3, metanolisis (HCl,
MeOH) diikuti oleh benzoilasi (p-Br-C6H4COCl dan 4-dimethylaminopyridine)
dilakukan untuk memberikan gula di dan tribenzoyl turunannya. Konfigurasi D
dari kedua bagian gula didirikan oleh CD pengukuran produk: metil 2,3,4-tri-O-
(p-bromobenzoyl) -a-D-xylopyranoside (CD: kmax = min 241/251 nm, Ul 8: 2 =
1: 5) dan metil 3,4-di-O- (p-bromobenzoyl) -2-O-metil-a-D-xylopyranoside (CD:
kmax = min 241/256 nm, Ul þ 13: 4 = 35: 0) .12 Konfigurasi-R pada C-20
ditentukan berdasarkan korelasi NOE dari H-18 / H-20 dan H-18 / H-21 (Gbr. 3),
dan kopling besar konstanta J17-20 ¼ 10: 0Hz yang menyarankan anti-hubungan
antara H-17 dan H-20. Sejak linckoside C (3) adalah turunan dihidro linckoside
D (4) yang diisolasi dari hewan yang sama, stereokimia relatif pada C-24 dan C-
28 seharusnya sama dengan 4 (lihat di bawah).
Linckoside D (4) memiliki formula molekul C41H68O14 ditentukan oleh
pengukuran SDM ESI-MS. Data 1H dan 13C NMR untuk 4 hampir
superimposable pada orang-orang dari 3 (Tabel 1) kecuali untuk sinyal sekitar
posisi C-22 dan C-23 dari rantai samping, yang digantikan oleh ikatan rangkap
di 4 (Gbr. 1). Ikatan rangkap pada C-22 – C-23 dikonfirmasi oleh Korelasi
DQFCOSY, dan trans-geometri adalah ditentukan dari konstanta kopling J22–23
¼ 15: 4 Hz. Konfigurasi-b dari kedua xylopyranoses ditentukan dari konstanta
kopling J10-20 ¼ 7: 6Hz dan J100 –200 ¼ 7: 5 Hz. Apalagi konfigurasi dari
bagian gula ditentukan dengan derivasi 4 dan pengukuran CD dengan cara yang
mirip dengan kasus 3. Dengan demikian, metanolisis dari 4 diikuti oleh
benzoylasi memberi dua turunan gula sama dengan yang diperoleh dari 3.
Konfigurasi 20R adalah ditugaskan atas dasar korelasi NOE dari H-18 / H-20 dan
H-18 / H-21 (Gbr. 4), dan kopling konstan J17–20 ¼ 12: 0 Hz. Selanjutnya relatif
stereokimia dari 24R *, 28S * ditunjukkan oleh Korelasi NOE dan konstanta
kopling ditunjukkan pada Gambar 4.
Linckoside E (5) memiliki formula molekul C39H66O14 ditentukan oleh
pengukuran SDM ESI-MS. Data 1H dan 13C NMR (Tabel 1) untuk 5 cukup
mirip dengan yang untuk linckoside A (1) kecuali untuk kekurangan sinyal
metilen karena C-28 dari 1. Lokasi
dua bagian gula ditentukan oleh HMBC korelasi dari H-100 ke C-3 dan dari H-
100 ke C-28. Sifat gula yang terhubung dengan C-3 ditentukan sebagai 2-O-
metil-b-D-xylopyranose berdasarkan pada Sinyal NMR karena gula ini dan
lingkungan inti steroid, yang superimposable pada mereka untuk linckosides
lainnya. Gula gula lain yang terkait C-28 ditentukan sebagai a-arabinofuranose
pada dasar DQFCOSY, korelasi NOE dari H-100 / H-300, H-100 / H-500a, dan
H-300 / H-500a, konstanta kopling J100 –200 ¼ 1: 8 Hz, dan data 13C NMR
untuk data yang dilaporkan.11 Untuk menentukan konfigurasi absolut di C-24, 5
dikonversi menjadi dearabinosyl linckoside E (6) dengan hidrolisis selektif.
Konfigurasi 24S dari 5 dengan demikian ditunjukkan oleh perbandingan 1H yang
dipilih Data NMR untuk 6 dengan data yang sesuai untuk beberapa senyawa
steroid terkait, 713, 8,14 dan 914 (Tabel 2, Gambar 1). Konfigurasi absolut
arabinofuranose 5 harus sama dengan linckoside A (1) diisolasi dari bintang laut
yang sama, meskipun tidak dikonfirmasi dengan cara kimia karena sejumlah
kecil Sampel.
Gambar 3. Korelasi NOE yang dipilih ditentukan oleh percobaan NOESY dari
linckoside C (3).

Gambar 4. Struktur parsial linckoside D (4) dengan korelasi NOE yang dipilih
dan konstanta kopling.

a Diukur dalam CD3OD pada 600MHz. Konstanta kopling (J dalam Hz) dalam
tanda kurung.
b Pergeseran kimia secara khusus dirujuk ke puncak pelarut pada dH 3,34 untuk
dibandingkan dengan data dalam Ref. 13 dan 14.
2.3. Aktivitas biologis
Aktivitas neuritogenik linckosides C-D (3-5) adalah dievaluasi menggunakan sel
PC12 dibandingkan dengan NGF dan congener sebelumnya yang terisolasi 1 dan
2. Gambar 5 menunjukkan peningkatan persentase tergantung waktu sel-sel
dengan hasil neurit jelas diinduksi pada Sel PC12. Konsentrasi diatur ke 25 atau
12,5 Lm itu adalah konsentrasi maksimum tanpa sitotoksisitas. Linckosides
menunjukkan peningkatan secara bertahap aktivitas, sedangkan aktivitas kendali
positif NGF (10 ng / mL) meningkat pesat dalam 3 hari kemudian mencapai
dataran tinggi. Kontrol pelarut tidak menginduksi setiap perkembangan neurite.
Linckosides B (2), C (3), dan D (4) yang memiliki xilosa pada rantai samping
menunjukkan signifikan aktivitas neuritogenik 62%, 56%, dan 73%, masing-
masing, pada hari ke 6 setelah perawatan. Aktivitas ini sebanding dengan NGF.
Di sisi lain tangan, linckosides A (1) dan E (5) yang memiliki arabinosa di rantai
samping menunjukkan kegiatan yang lebih rendah (33% dan 29%, masing-
masing) daripada yang lain. Hasil ini menunjukkan bahwa sifat gula bagian pada
rantai samping memainkan peran penting untuk aktivitas neuritogenik. Namun,
faktor struktural lainnya, misalnya jarak gula dari titik percabangan C-24, yang
ada atau tidaknya cabang metil di C-28 dan ikatan rangkap di C-22, tampaknya
tidak penting.

Semua linckosides secara signifikan meningkatkan NGF untuk diinduksi

pertumbuhan neurit sel PC12 (Gbr. 6). Pada hari ke 3 setelah perawatan, masing-
masing linckoside saja diinduksi saja

Gambar 5. Waktu aktivitas neuritogenik linckosides A – E (1-5) dibandingkan

dengan NGF sebagai kontrol positif. Aktivitas ini diwakili oleh persentase sel
PC12 dengan hasil neurit yang lebih panjang dari diameter sel. Semua
linckosides menunjukkan sitotoksisitas pada konsentrasi yang lebih tinggi
daripada yang ditunjukkan.

Gambar 6. Aktivitas neuritogenik NGF pada konsentrasi rendah, linckosides A –

E (1-5) pada konsentrasi yang ditunjukkan, dan campurannya. Efek sinergis
diamati dalam koeksistensi NGF dan linckoside.
10-20% pertumbuhan neurit pada konsentrasi 25 atau 12,5 lM. NGF pada
konsentrasi rendah 2 ng / mL hanya menginduksi pertumbuhan neurit 8%.
Namun, aktivitas rendah NGF ini meningkat hingga 86-92% dalam koeksistensi
linckosides A – E (1-5). Dengan demikian, perbedaan struktural dalam
linckosides memiliki sedikit efek pada fenomena sinergis antara NGF dan
linckosides. Aktivitas neuritogenik seperti NGF dari linckosides tergantung pada
keragaman struktural dari glikosida steroid ini, sedangkan peningkatan aktivitas
neuritogenik NGF tampaknya menjadi karakteristik umum linckosides.

3. Eksperimental

3.1. Prosedur umum

HPLC preparatif dilakukan pada sistem HPLC yang dilengkapi dengan pompa
HPLC cerdas JASCO PU-980 dan detektor UV / VIS cerdas JASCO UV-970.
Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan dengan pelat silika gel 60 F254
(Merck). Rotasi optik diukur pada polarimeter digital JASCO DIP-370.
Spektrum IR direkam pada JASCO FT / IR-7000S. HR ESI-TOF-MS direkam
pada Terapan Biosystems Mariner Biospectrometry Workstation menggunakan
polypropylene glikol dan PEG 600 sebagai standar kalibrasi dalam mode negatif
dan positif, masing-masing. Spektra NMR direkam pada spektrometer Bruker
AMX2-600. Pergeseran kimia NMR dalam d (ppm) dirujuk ke puncak pelarut
dC 49.0 dan dH 3,30 untuk CD3OD.
3.2. Ekstraksi dan isolasi
Bintang laut L. laevigata (911 g, basah) dikumpulkan di Pulau Akajima di
Okinawa, Jepang. Sampel beku-kering (400 g) bubuk dan direndam dalam
MeOH (3000mL) selama 5 hari pada suhu kamar. Supernatan dipisahkan dengan
penyaringan dan dipekatkan untuk menghasilkan 25,9 g ekstrak kasar, yang
dilarutkan dalam 90% MeOH berair (300 mL) dan kemudian dicuci dua kali
dengan heksana (150 mL). Fraksi metanol berair pekat dilarutkan dalam H2O
(300 mL) dan kemudian dicuci tiga kali dengan EtOAc (150 mL). Lapisan berair
dibekukan-kering untuk memberikan 20,6 g bubuk, yang dikromatografi pada
ODS (Cosmosil 75 C18-OPN, 100 g, Nacalai Tesque) dielusi dengan MeOH-
H2O (5: 5, 6: 4, 7: 3 , 8: 2, dan 10: 0) untuk membeli enam fraksi. Fraksi ketiga
(40,8 mg) dielusi dengan MeOH-H2O (8: 2) menjadi sasaran HPLC [TSKgel
ODS-120T (/ 20 · 250 mm), laju aliran: 8mL / menit, 77% aq MeOH] untuk
memberikan dua fraksi mengandung steroid glikosida (3,0 dan 3,5 mg, tR ¼ 53:
5–57: 5 dan 59,0-65,5 menit, masing-masing). Fraksi-fraksi ini secara individual
dimurnikan dengan HPLC [Develosil ODS-HG-5 (/ 10 · 250 mm), Nomura
kimia, laju aliran: 2 mL / menit, masing-masing 43% aq MeCN dan 41% aq
MeCN, masing-masing] untuk menghasilkan linckosides C ( 3) (2,0 mg, tR ¼
29: 0 mnt) dan D (4) (2,2 mg, tR ¼ 48: 4 mnt), masing-masing.
Di sisi lain, sebagian kecil (14,2 mg, tR ¼ 81: 0-108: 5 menit) dielusi sebelum 1
dan 2 dalam pemisahan HPLC preparatif, yang dilaporkan dalam makalah
sebelumnya menggunakan L. laevigata lainnya (285 g, wet wt), 10 selanjutnya
dikenai HPLC [TSKgel ODS-120T (/ 20 · 250 mm), 60-90% aq MeOH dalam
90 minlinear gradient] untuk menghasilkan linckoside E (5) (1.0 mg, tR ¼ 65: 0
min).
3.2.1. Linckoside C (3). Bedak tidak berwarna, ½ 25 D) 30 (c 0,10, MeOH), IR
(KBr) 3421, 2950, 1650, 1056, 880 cm 1; HR ESI-TOF-MS m = z 831.4737 (M
+ COOH), dihitung untuk C42H71O16 831.4742; untuk 1H dan 13C NMR lihat
Tabel 1.
3.2.2. Linckoside D (4). Bedak tidak berwarna, ½a 25D) 43 (c 0,12, MeOH), IR
(KBr) 3422, 2930, 1647, 1058, 982, 881 cm 1; HR ESI-TOF-MS m = z 829.4580
(M + COOH), dihitung untuk C42H69O16 829.4586; untuk 1H dan 13C NMR
lihat Tabel 1.
3.2.3. Linckoside E (5). Bedak tidak berwarna, ½ 25 D) 34 (c 0,06, MeOH), IR
(KBr) 3417, 2948, 1650, 1057, 882 cm 1; HR ESI-TOF-MS m = z 803.4424 (M
+ COOH), dihitung untuk C40H67O16 803.4429; untuk 1H dan 13C NMR lihat
Tabel 1.
3.3. Turunan gula dari 3
Linckoside C (3, 0,7 mg) dalam larutan HCl metanol anhidrat (1,4 M, 0,4 mL)
dipanaskan pada suhu 80 C dalam tabung tertutup selama 12 jam. Setelah
didinginkan, campuran reaksi dinetralkan dengan Ag2CO3 dan disaring, dan
supernatan diuapkan sampai kering di bawah N2. Residu dilarutkan dalam H2O
(3 mL) dan dicuci 3 kali dengan eter-heksana (1: 1) (3mL). Lapisan berair
dibekukan-beku, dilarutkan dalam piridin kering (1mL), dan kemudian
diperlakukan dengan p-bromobenzoil klorida (32 mg) dan 4-dimetilaminopiridin
(1 mg). Campuran diaduk pada 50 C selama 12 jam di bawah N2, dan kemudian
reaksi th dipadamkan dengan menambahkan H2O (0,5 mL). Setelah diaduk
selama 5 menit, larutan diuapkan dan residu ditangguhkan dalam air dan
diekstraksi 3 kali dengan CHCl3 (1,5 mL). Ekstrak CHCl3 gabungan dicuci
berturut-turut dengan NaHCO3 dan H2O berair jenuh. Setelah penguapan
pelarut, campuran benzoat dimurnikan dengan TLC preparatif [gel silika, Et2O-
heksana (3: 7)] untuk memberikan metil 2,3,4-tri-O- (pbromobenzoyl) -aD-
xylopyranoside (0,2 mg , Rf ¼ 0:38) dan campuran (Rf ¼ 0:12). Yang terakhir
selanjutnya dimurnikan dengan TLC [silika gel, Et2O-heksana (4: 6),
dikembangkan 3 kali] untuk memberikan metil 3,4-di-O- (p-bromobenzoyl) -2-
Omethyl-a-D-xylopyranoside (0,3 mg, Rf ¼ 0:44).
Metil 2,3,4-tri-O- (p-bromobenzoyl) -a-D-xylopyranoside: 10 CD (CHCl3) kmax
= min 241/251 nm ðDeþ 8: 2 = 1: 5Þ.
Metil 3,4-di-O- (p-bromobenzoyl) -2-O-metil-a-D-xylopyranoside: 10 CD
(CHCl3) kmax = min 241 / 256nm ðDeþ 13: 4 = 35: 0Þ.
3.4. Turunan gula dari 4
Linckoside D (4, 0,7 mg) menjadi sasaran metanolisis asam (1,4 M HCl dalam
MeOH) diikuti oleh benzoilasi dalam kondisi yang sama seperti yang telah
disebutkan. Campuran benzoat dimurnikan dengan TLC [silika gel, Et2O-
heksana (3: 7), dikembangkan 3 kali] untuk menghasilkan dua turunan gula
berikut.

Metil 2,3,4-tri-O- (p-bromobenzoyl) -a-D-xylopyranoside: Rf ¼ 0:63, CD

(CHCl3) kmax = min 240 / 252nm ðDe þ 4: 9 = 1: 6Þ.
Metil 3,4-di-O- (p-bromobenzoyl) -2-O-metil-a-D-xylopyranoside: Rf ¼ 0:26,
CD (CHCl3) kmax = min 240/256 nm ðDe þ 15: 9 = 37: 0Þ.
3.5. Hidrolisis parsial linckoside E (5) menjadi 6
Suatu larutan 5 (0,5 mg) dalam 50% asam asetat berair (1 mL) diaduk pada suhu
60 C selama 24 jam. Campuran reaksi diuapkan dan residu dilarutkan dalam H2O
(0,5 mL) dilewatkan melalui kartrid ODS (TOYOPAK ODS-M, TOSOH,
Jepang), yang dicuci dengan H2O (3 mL) dan kemudian dielusi dengan 100%
MeOH (3mL). Fraksi MeOH dilarutkan dalam MeOH (1 mL) diperlakukan
dengan kalium karbonat (5 mg) semalam pada suhu kamar. Campuran reaksi
dinetralkan dengan asam asetat (2LL) dan dikeringkan. Residunya dipisahkan
oleh KLT (silika gel, CHCl3 / MeOH¼5: 1, dikembangkan dua kali, Rf ¼ 0:27)
untuk memberikan 6 (0,3 mg) sebagai tidak berwarna bubuk: HR ESI-TOF-MS
m = z 649.3912 (M + Na) þ, cal cd untuk C34H58O10Na 649.3922; 1H NMR
(CD3OD, 600MHz) d 3.53 (1H, dd, J ¼ 11: 0, 5.0 Hz, H-28b), 3.46 (1H, dd, J ¼
11: 0, 5.0 Hz, H-28a), 1.83 ( 1H, m, H-25), 1,82 (1H, m, H-20), 1,63 (1H, m, H-
22b), 1,45 (1H, m, H-23b), 1,22 (1H, m, H- 24), 1,20 (1H, m, H-23a), 1,04 (1H,
m, H-22a), 0,94 (3H, d, J ¼ 7: 2 Hz, H-21), 0,89 (6H, d, J ¼ 6: 6 Hz, H-26, 27),
data lainnya identik dengan data untuk 5 (lihat Tabel 1).
3.6. Metode bioassay
Aktivitas biologis dievaluasi sesuai dengan metode yang dijelaskan dalam
makalah kami sebelumnya.8; 10 Secara singkat, dua puluh ribu sel PC12 dalam
media MEME (1 mL) ditempatkan di setiap sumur dari lempeng mikro 24-sumur
dan dikultur sebelumnya di bawah atmosfer yang dilembabkan. 5% CO2 pada 37
C. Dua puluh empat jam kemudian, media digantikan oleh 1mL media MEME
bebas serum yang mengandung 1% DMSO dan sampel uji. Dalam kasus untuk
evaluasi efek peningkatan NGF, media digantikan oleh 1mL media MEME bebas
serum mengandung 2,0 ng NGF (Recombinant Human b-NGF, R&D Systems)
selain sampel uji. Perubahan morfologis sel dipantau di bawah mikroskop fase
kontras pada setiap 24 jam hingga 6 hari. Sekitar seratus sel dihitung dari area
yang dipilih secara acak dan operasi ini diulang 3 kali.