File PDF
File PDF
SKRIPSI
ERAWATI
0806364504
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi
ERAWATI
0806364504
ii
Segala puji dan syukur atas nikmat dan kasih sayang yang Allah SWT
limpahkan sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan skripsi
ini.Penulisan skrips iini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat
untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Departemen Farmasi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.
1) Ibu Dr. Berna Elya, M,Si., Apt. selaku pembimbing pertama dan Ibu Dr.
Katrin, MS., selaku pembimbing kedua, yang telah menyediakan waktu,
tenaga, dan pikiran untuk membimbing dan mengarahkan penulisan dalam
penyusunan skripsi ini, semoga segala bantuan dan bimbingan ibu mendapat
imbalan yang luar biasa disisi-Nya.
2) Ibu Prof. Dr. Yahdiana Harahap, MS., selaku Ketua Departemen Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia.
3) IbuDra. Azizahwati, MS., selaku Ketua Program Sarjana Ekstensi Farmasi
yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama penulis menempuh
pendidikan di Departemen Farmasi FMIPA UI.
4) Ibu Dra. Retnosari Andrajati, MS., Ph.D., Apt. selaku pembimbing akademik
yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama penulis menempuh
pendidikan di Departemen Farmasi FMIPA UI.
5) Bapak dan Ibu staf pengajar Departemen Farmasi FMIPA UI atas ilmu
pengetahuan dan bantuan yang telah diberikan selama penulis menempuh
pendidikan di Departemen Farmasi FMIPA UI.
6) Rekan-rekan mahasiswa Program Sarjana Reguler, Ekstensi, dan Paralel
Departemen Farmasi FMIPA UI atas kerjasamanya selama penyusunan skripsi
ini.
v
Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Erawati
NPM : 0806364504
Program Studi : Sarjana Farmasi
Departemen : Farmasi
Fakultas : Matematika danIlmuPengetahuanAlam
Jenis Karya : Skripsi
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, meyetujui untuk memberikan kepada Universitas
Indonesia Hak Bebas Royalti Nonekslusif (Non-exclusive Royalty-Free Right)atas karya saya
yang berjudul :
“Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Garcinia daedalanthera Pierre Dengan Metode DPPH
(1,1-Difenil Pikrilhidrazil) dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia dari Fraksi Paling Aktif”
Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Nonekslusif ini
Universitas Indonesia berhak menyimpan, mengalihmedia/format-kan, mengelola dalam bentuk
pangkalan data (database), merawat, dan memublikasikan tugas akhir saya selama tetap
mencantumkan nama saya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta.
Dibuat di :Depok
Pada tanggal :
Yang menyatakan
(Erawati)
vi
Nama : Erawati
Program studi : Sarjana Farmasi
Judul : Uji Aktivitas Antioksi dan Ekstrak daun Garcinia
daedalanthera Pierre dengan Metode DPPH (1,1-Difenil
Pikrilhidrazil) dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia
dari Fraksi Paling Aktif
vii
Name : Erawati
Study Program : Pharmacy
Title : Antioxidant Activity Test of Garcinia daedalanthera Pierre Leaves
With 1,1-Diphenyl Picrylhydrazyl (DPPH) Method and Chemical
Compounds Identification of The Most Active Fraction
Garcinia is one of the plants in Indonesia that have potential as antioxidants which can be used to
treat various diseases. Some of the active compounds in Garcinia genus which have antioxidant
activity are xanthones, flavonoids and alkaloids. The study was conducted to determine the
antioxidant activity and screening chemical compounds from leaves of Garcinia daedalanthera
Pierre, which is one species of the genus Garcinia. Measurement of antioxidant activity carried
out using the DPPH method. The results showed that the extracts of n-hexane, ethyl acetate, and
methanol have antioxidant activity, with IC 50 values were 56,780; 9,040 and 12,838 µg/mL,
respectively. In the ethyl acetate extract fractionation performed using vacuum liquid
chromatography and obtained eight fractions combined based on TLC results of the A, B, C, D,
E, F, G, and H. The fraction G was the most active fraction with IC50 value of 4,673 µg/mL. The
screening of chemical compounds in the fraction of G showed flavonoids, alkaloids and
saponins.
viii
ix
Halaman
Halaman
Tabel 4.1 Data Rendemen Ekstrak Daun Garcinia daedalanthera
Pierre ………………………………………………………. 51
Tabel 4.2 Identifikasi Kandungan Kimia Ekstrak Daun Garcinia
daedalanthera Pierre………………………………………... 52
Tabel 4.3 Nilai IC50 Ekstrak Daun Garciniadaedalanthera Pierre …… 53
Tabel 4.4 Data Uji Aktivitas Antioksidan Kuersetin (Pembanding) ….. 54
Tabel 4.5 Nilai IC50 Hasil Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Daun
Garcinia daedalanthera Pierre …………………………….. 55
Tabel 4.6 Identifikasi Kandungan Kimia Fraksi Aktif ………………... 57
xi
Halaman
Lampiran 1 Hasil Determinasi Garcinia daedalanthera Pierre …. 58
Lampiran 2 Cara PerhitunganNilai IC50 ………………………… 59
xii
BAB 1
PENDAHULUAN
Universitas Indonesia
1
Uji aktivitas..., Erawati, FMIPA UI, 2012
2
mencari pasangan elektron. Jika terbentuk dalam tubuh, akan menjadi reaksi
berantai dan menghasilkan radikal bebas baru yang jumlahnya terus bertambah,
radikal bebas yang berlebihan menyebabkan antioksidan seluler tidak dapat
menetralkannya sehingga berakibat pada kerusakan sel. Radikal bebas dapat
dijumpai pada lingkungan, beberapa logam (misalnya besi, tembaga), asap rokok,
polusi udara, obat, bahan beracun, makanan dalam kemasan, bahan aditif, dan
sinar ultraviolet dari matahari maupun radiasi (Inayah, 2006; Agarwal et al,
2006).
Radikal bebas yang merusak tubuh ini dapat dinetralisir oleh senyawa
antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat oksigen
reaktif dan radikal bebas dalam tubuh. Senyawa antioksidan ini akan
menyerahkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas sehingga menjadi
bentuk molekul yang normal kembali dan menghentikan berbagai kerusakan yang
ditimbulkan (Sashikumar, Maheshu, dan Jayadev, 2009).
Berdasarkan penelitian penelitian Atta-ur-Rahman (2001) senyawa-
senyawa yang mempunyai potensi sebagai antioksidan umumnya merupakan
senyawa flavonoid, fenolat, dan alkaloid. Senyawa flavonoid dan polifenolat
bersifat antioksidan, antidiabetik, antikanker, antiseptik, dan antiinflamasi,
sedangkan alkaloid mempunyai sifat antineoplastik yang juga ampuh menghambat
pertumbuhan sel-sel kanker.
Salah satu senyawa aktif yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan
adalah xanton. Selain itu, xanton juga berpotensi sebagai antikanker, antibakteri,
antiinflamasi, memelihara kesehatan sistem imun, mendukung kesehatan mental,
keseimbangan mikrobiologi, dan meningkatkan kelenturan sendi. Xanton atau
sering disebut xantenon, biasanya terdapat dalam tanaman keluarga Bonnetiaceae
(tumbuhan berbunga), dan Clusiaceae (keluarga manggis-manggisan)
(Paramawati, 2010).
Tumbuhan di Indonesia yang mempunyai potensi sebagai antioksidan
salah satunya adalah genus Garcinia. Berdasarkan penelitian sebelumnya terhadap
daun Garcinia benthami Pierre dari empat ekstrak yakni ekstrak n-heksan, etil
asetat, aseton dan metanol, telah diketahui bahwa ekstrak yang menunjukkan
Universitas Indonesia
aktivitas antioksidan adalah ekstrak aseton dan metanol dengan IC50 berturut-turut
34,69 dan 29,91 µg/mL (Amelia, 2011). Beberapa jenis lainnya juga memiliki
aktivitas antioksidan yang telah diteliti diantaranya adalah Garcinia lancilimba
(kulit batang) (Nian-Yun.Y. et al, 2007), Garcinia hombroniana (daun)
(Vatcharin Rukachaisirikul et al, 2005), Garcinia rigida (Elya, B. et al, 2008),
dan Garcinia mangostana (kulit buah) (Sunit S. et al, 2002).
Berdasarkan penelitian terdahulu Garcinia daedalanthera Pierre
merupakan salah satu jenis dari marga Garcinia yang belum banyak diteliti dan
diketahui belum ada penelitian tentang aktivitas antioksidan terhadap tumbuhan
ini, sehingga pada penelitian ini akan dilakukan uji aktivitas antioksidan ekstrak
daun Garcinia daedalanthera Pierre dengan menggunakan metode DPPH (1,1
Difenil-2-pikrilhidrazil). Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas sampel
yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat pada
panjang gelombang 517 nm dengan warna ungu gelap. Penangkap radikal bebas
menyebabkan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil
(Sashikumar, Maheshu, dan Jayadev, 2009).
Universitas Indonesia
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
4
Uji aktivitas..., Erawati, FMIPA UI, 2012
5
semu atau hampir tidak ada. Tangkai sarinya bersatu menjadi sebuah cincin
dibagian pangkal, atau menjadi 4-5 berkas pendek, bakal buah beruang 2-12,
biasanya berbentuk papilla. Bijinya besar, biasanya terbungkus oleh arilus yang
berisi banyak sari buah, embrionya berupa massa yang padat, hanyatersusun atas
hipokotil yang besar, sedangkan keping bijinya tidak ada. (Xi-Wen Li et al, 2009;
Sosef, 1998; Veirhejj, 1992).
Sekitar 450 jenis secara tropis terdapat di Afrika, Madagaskar, Asia,
Australia, Polinesia, dan Amerika. Buah dari kebanyakan jenis dalam marga ini
dapat dimakan. Garcinia mangostana merupakan jenis yang paling dikenal
masyarakat. Buah yang dihasilkan mengandung lebih dari 15% minyak. Resin
kuning beberapa jenis digunakan sebagai obat. Jenis seperti Garcinia hanburyi JD
Hooker merupakan obat dan resin berwarna kuning menjadi pewarna dengan
kualitas terbaik. Dari banyak jenis kayu Garcnia digunakan untuk membangun
rumah atau membuat mebel (Xi-Wen Li et al, 2009).
Universitas Indonesia
2.2 Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut
sehingga terpisah dari bahan yang tidak terlarut dengan pelarut cair. Simplisia
yang diekstraksi mengandung berbagai senyawa aktif yang dapat larut dan
senyawa aktif yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-
lain (Parameter Standar, 2000).
Metode ekstraksi yang digunakan dalam bidang farmasi meliputi
pemisahan bagian aktif tanaman berkhasiat obat dari komponen yang tidak aktif
dengan menggunakan pelarut selektif. Selama ekstraksi pelarut berdifusi kedalam
bahan tanaman yang padat dan melarutkan senyawa yang terkandung didalamnya
berdasarkan kepolaran yang sama (Ncube NS, et al; 2008).
Prosedur ekstraksi bertujuan untuk mendapatkan senyawa yang diinginkan
dan untuk menghilangkan komponen yang tidak diinginkan dari tanaman
menggunakan pelarut yang selektif. Ekstrak yang diperoleh setelah distandardisasi
dapat digunakan sebagai bahan obat-obatan seperti dalam bentuk tinktur atau
ekstrak cair dan dapat diproses lebih lanjut untuk dibuat dalam bentuk sediaan
seperti tablet dan kapsul. Tanaman yang diekstraksi mengandung campuran
kompleks dari metabolit seperti alkaloid, glikosida, terpenoid, flavonoid dan
lignan (Handa et al, 2008).
Beberapa metode yang digunakan dalam ekstraksi bahan alam antara lain :
2.2.1 Cara Dingin
a. Maserasi
Merupakan metode yang sederhana, tetapi masih digunakan secara luas.
Prosedurnya dilakukan dengan merendam bahan tanaman (simplisia) dalam
Universitas Indonesia
pelarut yang sesuai dalam wadah tertutup pada suhu kamar. Metode ini sesuai
baik untuk ekstraksi pendahuluan maupun untuk jumlah besar. Pengadukan
sesekali ataupun secara konstan (dengan menggunakan alat pengocok mekanik
untuk menjamin kehomogenan) dapat meningkatkan kecepatan ekstraksi. Proses
ekstraksi dapat dihentikan ketika tercapai keseimbangan antara konsentrasi
metabolit dalam ekstrak dan dalam bahan tanaman. Setelah ekstraksi, residu
bahan tanaman (maserat), harus dipisahkan dari pelarut. Hal ini melibatkan proses
pemisahan kasar dengan cara dekantasi, biasanya diikuti dengan tahap
penyaringan. Sentrifugasi mungkin diperlukan jika serbuk terlalu halus untuk
disaring.Untuk memastikan ekstraksi yang menyeluruh, umumnya dilakukan
maserasi pendahuluan, yang diikuti pemisahan dan penambahan pelarut baru
(fresh solvent) ke maserat. Hal ini bisa dilakukan secara periodik dengan semua
filtrat dikumpulkan.
Kelemahan utama dari maserasi adalah prosesnya cukup memakan waktu
yang lama, dapat berlangsung beberapa jam sampai beberapa minggu. Ekstraksi
secara menyeluruh juga dapat menghabiskan sejumlah besar volume pelarut dan
dapat berpotensi hilangnya metabolit. Selain itu, beberapa senyawa tidak
terekstraksi secara efisien jika kurang terlarut dalam temperatur kamar.Dilain
pihak, dikarenakan ekstraksi dilakukan pada temperatur kamar, maserasi tidak
menyebabkan degradasi dari metabolit yang tidak tahan panas (Parameter standar,
2000).
b. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan
cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Pada perkolasi,
serbuk tanaman direndam dalam pelarut pada sebuah alat perkolator, bentuknya
seperti kerucut terbalik. Perkolasi cukup sesuai baik untuk ekstraksi pendahuluan
maupun dalan jumlah besar. Bahan padat basah dimasukkan dalam jumlah yang
tepat kemudian didiamkan selama sekitar 4 jam dalam keadaan tertutup. Setelah
itu cairan penyari akan menetes melewati serbuk tanaman, mengganti pelarut yang
keluar berupa ekstrak. Seperti pada maserasi, untuk mengekstrak secara
menyeluruh dilakukan dengan penambahan pelarut yang baru (fresh solvent) dan
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
standar, 2000). Metode ini digunakan untuk ekstraksi bahan tanaman larut air dan
stabil terhadap panas (Remington 21th ed).
f. Sonikasi
Sonikasi adalah prosedur yang melibatkan penggunaan ultrasonik pada
frekuensi 20 kHz sampai 2000 kHz, hal ini dapat meningkatkan permeabilitas
dinding sel dan menghasilkan kavitasi. Meskipun sangat berguna, namun metode
ini membutuhkan biaya yang banyak terutama untuk penggunaan jumlah besar.
Kelemahan dari metode ini kadang-kadang memberikan efek buruk dari energi
ultrasonik pada frekuensi lebih dari 20 kHz melalui pembentukan radikal bebas
oleh komponen aktif dari tanaman yang tentu tidak diinginkan (Handa et al,
2008).
g. Homogenisasi jaringan tanaman
Metode ini telah cukup banyak digunakan untuk penelitian. Hal ini
disebabkan karena dapat digunakan untuk ekstraksi cara basah maupun kering,
dimana bagian tanaman segar diserbukkan dengan blender agar partikel menjadi
halus, selanjutnya ditambahkan pelarut dengan jumlah tertentu dan dikocok
dengan kuat selama 5 sampai 10 menit atau dibiarkan selama 24 jam, setelah itu
dilakukan penyaringan. Filtrat yang diperoleh dikeringkan lalu dilarutkan kembali
dengan pelarut, bila perlu dilakukan sentrifugasi untuk mendapatkan ekstrak
kental (Das et al, 2010).
h. Ekstraksi seri lengkap
Ekstraksi seri sempurna adalah metode umum yang melibatkan pelarut
dengan peningkatan kepolaran mulai dari non polar seperti heksan hingga pelarut
yang lebih polar seperti metanol untuk memastikan bahwa senyawa dengan
berbagai polaritas dapat diekstraksi (Das et al, 2010).
2.3 Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa yang mampu menghilangkan, membersihkan,
menahan pembentukan oksigen reaktif dan radikal bebas dalam tubuh. Radikal
bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil karena tidak memiliki elektron
yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya sehingga sangat reaktif untuk
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan maka warna
larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada panjang
gelombang 517 nm akan hilang.
2.4.2 Uji diena terkonjugasi (Shivaprasad, 2005; Pokorny, Yanishlieva, and
Gordon, 2011)
Prinsip uji diena terkonjugasi adalah pembentukan hidroperoksida dari
PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) menyebabkan konjugasi struktur pentadin.
Hal ini dapat diukur dengan adanya serapan pada 233-234 nm. Selama oksidasi
asam linoleat, ikatan rangkap diubah menjadi ikatan rangkap terkonjugasi yang
dapat dikarakterisasi oleh serapan UV kuat pada panjang gelombang 234 nm.
Meskipun yang diukur adalah komposisi hiperoksida, namun hasil yang terbentuk
berupa hidroperoksida yang terdekomposisi sebagai 9-hidroksioktadeka-10,12-
asam dienoat dan 13-hidroksioktadeka-9,11-asam dienoat yang mempertahankan
struktur terkonjugasi ini dan akan berperan dalam penentuan absorbansi. Aktivitas
tersebut dinyatakan dalam konsentrasi inhibisi (IC50).
2.4.3 Bilangan Para-anisidin (Pokorny, Yanishlieva, and Gordon, 2001)
Para-anisidin adalah bahan yang bereaksi dengan aldehid untuk
memberikan hasil serapan pada 350 nm. Bilangan dari para-anisidin di definisikan
sebagai serapan larutan yang dihasilkan dari 1 g lemak dalam larutan isoktan 100
mL dengan para-anisidin. Hasil yang dibentuk oleh reaksi dengan aldehid jenuh
(2-alkana) menyerap lebih kuat pada panjang gelombang tersebut, dan akibatnya
uji ini sangat sensitif terhadap bahan-bahan yang mengalami oksidasi. Meskipun
tes ini tidak dapat membedakan antara bahan yang mudah menguap maupun tidak,
umumnya lebih sensitif terhadap aldehid tak jenuh yang mudah menguap
dibanding aldehid jenuh dengan sifat yang sama, sehingga tes ini merupakan cara
yang cocok untuk menilai adanya oksidasi sekunder. Pengukuran bilangan para-
anisidin umumnya digunakan secara bersama dengan pengukuran bilangan
peroksida dalam menggambarkan tingkat oksidasi total.
Universitas Indonesia
PV= 0,01xNx1000/m
Dimana N adalah volume sodium tiosulfat yang digunakan pada titrasi sampel
dalam mL dan m adalah massa sampel minyak dalam gram. Sedangkan efisiensi
antioksidan (EA) dihitung menggunakan rumus :
EA = IPA/IPB
IPA,B adalah periode induksi (waktu dalam hari yang dibutuhkan untuk mencapai
bilangan peroksida pada 20 meq/kg minyak) pada pengujian sampel maupun
blanko. Hasilnya dipresentasikan pada rata-rata dua kali pengulangan.
2.4.5 Aktivitas penghambatan radikal hidroksil (Rosen and Rauckman, 1984;
Kosem et al, 2007; Shivaprasad, 2005).
Prinsip Penghambatan radikal hidroksil adalah pengukuran dengan
mereaksikan antara DMPO (5,5-dimetil-1-pirolin-N-oksida) dan radikal OH
secara adisi menghasilkan DMPO-OH yang dideteksi dengan spektrometer ESR.
Spektrum ESR diukur pada suhu kamar setelah mencampur 0,02 mL H 2O2 0,1
mM dengan 0,01 mL DMPO 0,05 mM, 0,05 mL ekstrak dan 0,02 mL Fe 2+ 0,05
mM menggunakan spektrometer ESR. Pengaturan parameternya adalah dengan
mengukur medan magnet eksternal 337,5 ± 5 mT pada frekuensi 100 kHz,
gelombang mikro 10 mW pada 9,43 GHz. Asam askorbat dan etanol digunakan
sebagai kontrol. Perbandingan penghambatan radikal hidroksil ekstrak diukur
dengan persamaan sebagai berikut :
Universitas Indonesia
Dimana hx dan h0 adalah reaksi intensitas signal ESR pada masing-masing sampel
uji maupun blanko. Aktivitas ini dinyatakan dengan penghambatan radikal
hidroksil.
2.4.6 Metode kekuatan pereduksi (Shivaprasad, 2005; Miladi and Damak, 2008)
Prinsip dari metode ini adalah peningkatan serapan dari reaksi
pencampuran berbagai konsentrasi dari ekstrak yang diuji dengan penambahan
dapar natrium fosfat dan kalium ferisianida. Peningkatan serapan menunjukkan
peningkatan aktivitas antioksidan. Pada metode ini senyawa membentuk
kompleks berwarna dengan kalium ferisianida, trikloroasetat dan besi (III) klorida,
yang ditambahkan setelah sentrifugasi dilakukan kemudian diukur pada panjang
gelombang 700 nm. Peningkatan serapan dari reaksi menunjukkan penurunan
kekuatan dari sampel.
2.4.7 Metode fosfomolibdenum (Shivaprasad, 2005; Prieto, Pineda dan Aguilar,
1999)
Kapasitas antioksidan total dengan pengujian metode fosfomolibdenum
didasarkan pada reduksi dari Mo (VI) menjadi Mo (V) oleh sampel analit dan
selanjutnya pembentukan kompleks warna hijau dari fosfat molibdenum (V) yang
mengandung antioksidan pada pH asam. Fosfomolibdenum adalah metode
kuantitatif untuk aktivitas antioksidan total yang dinyatakan sebagai jumlah yang
setara asam askorbat.
2.4.8 Metode ABTS (garam 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonikasid)
diamonium (Re et al,1999)
Garam diamonium ABTS (2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolin-6-
sulfonikasid) dengan prinsip pengujian dekolorisasi radikal kation merupakan
metode spektrofotometri yang banyak digunakan untuk pengujian aktivitas radikal
pada berbagai zat. Percobaan untuk skrining analisis dilakukan menggunakan uji
dekolorisasi ABTS yang ditingkatkan, dapat digunakan untuk senyawa hidrofilik
maupun lipofilik. ABTS dihasilkan dengan mengoksidasi larutan kation ABTS ●+
dengan kalium persulfat. Sejumlah 3 mL larutan kation ABTS dicampur dengan
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
mL. Hasil kromogen merah kompleks ferri (III) tiosianat dapat diukur pada 500
nm.
Inhibsi lipid peroksidase (LPI) dalam persen diukur dengan persamaan
berikut :
LPI (%) = [1-(A1-A2)/A0] x 100 %
A0 adalah absorban
Diamankontrol (campuran reaksi tanpa ekstrak), A 1 adalah absorban
sampel, dan A2 adalah absorban tanpa penambahan larutan kalium tiosianat.
Standar yang diguakan adalah α-tokoferol.
2.4.11 Metode CUPRAC (Apak et al, 2005)
Prinsip dari uji CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity)
adalah pembentukan kelat oleh bis (neukuproin) besi (II) menggunakan pereaksi
redoks kromogenik pada pH 7. Absorbansi dari pembentukan kelat Cu (I)
merupakan hasil reaksi redoks dengan mereduksi polifenol yang diukur pada
panjang gelombang 450 nm. Untuk spektrum Cu (I) Ne diperoleh dengan
mereaksikan asam askorbat berbagai konsentrasi dengan reagen CUPRAC.
Kondisi reaksi seperti konsentrasi reagen, pH, dan waktu oksidasi pada suhu
kamar dan peningkatan suhu pada percobaan dapat berasal dari sumber lain.
Kelebihan dari metode CUPRAC adalah pereaksi yang digunakan cukup
cepat bekerja, selekif, lebih stabil, mudah didapatkan dan mudah untuk
diaplikasikan.
2.4.12 Efek pembentukan hexanal (Ulbert and Roubicek, 1993)
Dua jenis aldehid, yakni heksanal dan pentanal biasanya adalah zat
volatil utama pada proses oksidasi lipid sekunder. Jumlah heksanal yang
dihasilkan berkorelasi dengan baik dengan adanya dekomposisi asam lemak tak
jenuh. Sejumlah pentanal yang terbentuk selama oksidasi biasanya secara
signifikan lebih rendah dari heksanal. Heksanal adalah hasil oksidasi sekunder,
karena itu peningkatan secara pesat selama proses oksidasi diamati setelah jeda
waktu tertentu (periode induksi). Efisiensi antioksidan (AE) pada ekstrak
tanaman dihitung dengan membagi periode induksi sampel (IP) dengan periode
induksi blanko.
Universitas Indonesia
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.2 Bahan
3.2.1 Tanaman
Tanaman yang diteliti adalah Garcinia daedalanthera Pierre yang
diperoleh dari Kebun Raya Bogor dan telah dideterminasi di Pusat Penelitian
Biologi-LIPI, Cibinong Bogor (Lampiran 1). Daun adalah bagian yang digunakan
dalam penelitian ini.
3.2.2 Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah n-heksan, etil
asetat, dan metanol teknis yang telah didestilasi; metanol p.a; lempeng KLT;
H2SO4 10 % sebagai penampak noda pada KLT; silika gel (70-230 mesh, E.
Merck 1.07734); asam klorida p.a (Merck); asam sulfat p.a (Merck); benzene p.a
(Merck); asam asetat anhidrat; asam borat; asam oksalat; besi (III) klorida; etanol
96 %; natrium hidroksida; serbuk magnesium; serbuk seng; gelatin; natrium
klorida; Mayer LP; Dragendorff LP; Bouchardat LP; Molisch LP; DPPH (Sigma-
Aldrich); dan kuersetin (Sigma-Aldrich).
3.3 Peralatan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender, peralatan
maserasi, penguap vakum putar (rotary evaporator Buchii), kolom kromatografi
vakum, vial dan botol penampung berbagai ukuran, pipet mikro (Eppendorf),
spektrofotometer UV-VIS (Hitachi), timbangan analitik, alat-alat gelas, lemari
pendingin dan alat uji antioksidan.
Universitas Indonesia
16
Uji aktivitas..., Erawati, FMIPA UI, 2012
17
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
sampai 1 jam. Setelah eluen mencapai garis depan, lempeng dikeluarkan dan
dikeringkan.
Bercak yang terbentuk diamati secara visual, dengan lampu UV pada
panjang gelombang 254 dan 366 nm, dan menggunakan pereaksi semprot untuk
menampakkan bercak yang tidak berwarna dan tidak berfluoresensi. Pereaksi
semprot yang digunakan adalah asam sulfat 10% yang dilanjutkan dengan
pemanasan.
Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan paling kuat dilanjutkan
dengan pemisahan menggunakan kolom kromatografi vakum untuk mendapatkan
fraksi-fraksi dari ekstrak yang aktif selanjutnya dilakukan uji aktivitas
antioksidan, sehingga didapatkan fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan
paling aktif.
3.4.6 Pemeriksaan Kandungan Kimia Hasil Fraksinasi
Terhadap fraksi paling aktif dilakukan pemeriksaan kandungan kimia
dengan prosedur yang sama pada pemeriksaan kandungan kimia ekstrak.
Pemeriksaan dilakukan menggunakan beberapa pereaksi kimia antara lain untuk
pereaksi alkaloid, flavonoid, glikosida antrakuinon, saponin, tanin, dan terpen.
3.4.6.1 Identifikasi alkaloid
Untuk mengidentifikasi alkaloid, ekstrak dilarutkan dengan etanol 96 %
kemudian ditambahkan asam klorida encer 2 N. Filtrat yang diperoleh disaring
kemudian diidentifikasi menggunakan pereaksi Mayer LP, Bouchardat LP,
Dragendorff LP, dan Solutio Iodii LP.
Pada penambahan Mayer LP, hasil positif ditandai dengan terbentuknya
endapan berwarna putih atau kuning. Hasil positif Dragendorff LP ditunjukkan
dengan terbentuknya endapan berwarna merah bata. Penambahan Bouchardat LP
memberikan hasil positif jika terbentuk endapan coklat sampai hitam dan dengan
penambahan solution iodii LP hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya
endapan coklat (Depkes RI, 1979).
3.4.6.2 Identifikasi flavonoid
a. Sebanyak 0,5 g ekstrak yang diuji dilarutkan dalam 1-2 mL etanol 96 %
kemudian ditambahkan 0,5 gram serbuk seng P dan 1 mL asam klorida encer 2 N,
Universitas Indonesia
didiamkan selama 1 menit lalu ditambahkan 5 tetes asam klorida pekat P. Jika
dalam waktu 2 sampai 5 menit terbentuk warna merah intensif hal tersebut
menunjukkan adanya flavonoid.
b. Sebanyak 0,5 g ekstrak dilarutkan dalam 1 mL etanol 96 % kemudian
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium P dan 5 tetes asam klorida pekat P. Jika
terbentuk warna merah jingga sampai merah ungu, menunjukkan adanya
flavonoid. Jika terbentuk warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon,
kalkon dan auron.
c. Sebanyak 1 g ekstrak yang diuji diuapkan hingga kering. Sisanya dibasahkan
dengan aseton P kemudian ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan
asam oksalat P. Secara hati-hati dipanaskan diatas penangas air dan hindari
pemanasan yang berlebihan. Sisa yang diperoleh dicampur dengan 5 mL eter P.
Perubahan warna diamati dengan sinar UV 366 nm. Adanya flavonoid
ditunjukkan dengan fluoresensi kuning (Depkes RI, 1979).
3.4.6.3 Identifikasi glikosida
Sebanyak 3 g ekstrak yang diuji ditambahkan 15 mL asam klorida 10 % LP,
direfluks selama 30 menit, didinginkan kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh
disari sebanyak tiga kali masing-masing dengan 12 mL eter P. Lapisan eter
dipisahkan dan dikumpulkan. Pada kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat
anhidrat P kemudian disaring dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50 0C. Sisa
dilarutkan dengan 2 mL metanol P. Larutan ini sebagai larutan percobaan (Depkes
RI, 1979).
a. Percobaan umum terhadap glikosida
Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan diatas penangas air, sisa
dilarutkan dalam 5 mL asam asetat anhidrat kemudian ditambahkan 10 tetes asam
sulfat pekat P, jika terbentuk warna biru atau hijau menunjukkan adanya terpen
atau sterol (reaksi Liebermann-Buchard). Sebanyak 1 mL larutan percobaan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diuapkan di atas penangas air. Sisa
ditambahkan 1 mL air dan 5 tetes Molisch LP lalu ditambahkan secara hati-hati 10
tetes asam sulfat P. Jika terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan
menunjukkan adanya ikatan gula (reaksi Molisch ) (Depkes RI, 1979).
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Ekstraksi
Serbuk kering daun Garcinia daedalanthera Pierre sebanyak 1,5 kg
dimaserasi dengan pelarut dengan kepolaran meningkat mulai dari 6 L n-heksan, 8
L etil asetat dan selanjutnya 8 L metanol selama masing-masing 6 hari dilakukan
sebanyak 5 kali untuk memperoleh filtrat dari masing-masing ekstrak yang masih
dapat dituang. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar vakum
pada suhu lebih kurang 500C kemudian diuapkan diatas waterbath pada suhu
<500C sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan metanol
berturut-turut yaitu 70, 90, dan 165 g. Data rendemen ekstrak dapat dilihat pada
Tabel 4.1.
Universitas Indonesia
24
Uji aktivitas..., Erawati, FMIPA UI, 2012
25
Pelarut yang pertama kali digunakan pada awal ekstraksi adalah n-heksan
yang bersifat non-polar dengan tujuan untuk menghilangkan lemak dan
mengekstraksi senyawa-senyawa yang bersifat non-polar seperti asam lemak,
sterol, kumarin, dan beberapa terpenoid. Etil asetat dengan tingkat kepolaran
menengah digunakan untuk mengekstraksi senyawa dengan polaritas menengah
seperti flavonoid, tanin dan beberapa alkaloid. Sedangkan metanol yang lebih
polar dari etil asetat digunakan untuk mengekstraksi senyawa polar seperti
flavonoid, glikosida, tanin, dan beberapa alkaloid (Sarker et al, 2006).
Universitas Indonesia
1,1-Difenil-2-pikrilhidazil 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazin
Gambar 4.1 Reaksi antioksidan dengan DPPH
[Sumber :Molineux, 2004]
Universitas Indonesia
160:40, 150:50, 140:60, 130:70, 120:80, 110:90, 100:100, 90:110, 80:120, 70:130,
60:140, 50:150, 40:160, 30:170, 20:180, 10:190, 0:200) dan etil asetat-
metanol(190:10, 180:20, 170:30, 160:40, 150:50, 140:60, 130:70, 120:80, 110:90,
100:100, 90:110, 80:120, 70:130, 60:140, 50:150, 40:160, 30:170, 20:180, 10:190,
200:0). Setiap 200 mL eluat ditampung sehingga diperoleh 41 fraksi lalu
dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Fraksi yang memiliki pola
kromatogram sama digabung sehingga diperoleh 8 fraksi gabungan yakni fraksi
A, B, C, D, E, F, G, dan H. Data selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 4.5.
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan sebagai
berikut :
a. Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan yang diteliti adalah etil asetat
dengan IC50 9,040 µg/mL diikuti oleh metanol dan n-heksan dengan IC50
berturut-turut 12,838 dan 56,780 µg/mL
b. Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbesar yaitu fraksi G dengan nilai
IC50 sebesar 4,673 µg/mL yang mengandung senyawa golongan flavonoid,
alkaloid dan saponin.
5.2 Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menemukan senyawa-
senyawa murni dari daun Garcinia daedalanthera Pierre dan dilakukan
identifikasi serta uji aktivitas antioksidan dari senyawa isolat.
29 Universitas Indonesia
DAFTAR ACUAN
Agarwal, A., Thompson, A., Kothari, S., Plessis, Stefan S du. (2010). Free
Radicals: Their Beneficial and Detrimental Effects on Sperm
Function. Indian Journal of Experimental Biology,48, 425-435.
Apak. R., Guclu, K., Ozyurek, M., Karademir, S.E. (2004). A Novel Toal
Antioxidant Capacity Index for Dietary Polyphenols, Vtamin C and
E, Using Their Cupric Ion Reducing Capability in the Presence of
Neocuproine: CUPRAC Method. J. Agric. Food Chem., 52, 7970-
7981.
Apak, R., Guclu, K., Ozyurek, M., Karademir, S.E., Altun, M. Total
Antioxidant Capacity Assay of Human Serum Using Copper (II)-
Neucuproine as Chromogenic Oxidant: The CUPRAC Method.
Free Radic. Res., 39, 949-961.
30 Universitas Indonesia
Elya, B., He, H. P., Kosela, S., Hanafi, M., Hao X.J. (2008). A New
Cytotoxic Xanthone from Garcinia rigida. Journal of Fitoterapia,
79, 182-184.
Evans W.C. (2002). Trease and Evans Pharmacognosy 15th Ed. London:
W.B. Saunders.
Handa, S.S., Khanuja, S.P.S., Longo G., Rakes D.D. (2008). Extraction
Technologies for Medicinal and Aromatic Plants. Trieste:
International Centre for Sciences and High Technology, 21-25.
Universitas Indonesia
Lautan, J. (1997). Radikal Bebas Pada Eritrosit dan Leukosit. Cermin Dunia
Kedokteran, 116, 49-52.
Linuma and Tosa., Tanaka &Yonemori. (1996). Two Xanthones from Root
Bark of Calophyllum inophyllum. Phytochemistry 35, (2), 527-532.
Universitas Indonesia
Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Panal, A.,Yang, M., Rice-Evans, C.
(1999). Antioxidant Acitivity Applying an Improved ABTS
Radical Cation Decolorization Assay. Free Radical Biol.Med., 26,
1231-1237.
Remington, J.P. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21th Ed.,
773-774.
Rosen, G.M and Rauckman, E.J. (1984). Spin Trapping of Superoxide and
Hydroxyl Radicals. Method Enzymol,105, 198-209.
Sarker, D., Latif Z., Gray.I., Alexander. Ed. (2006). Natural Product
Isolation. New Jersey: Humana Press.
Universitas Indonesia
Sunit, S., Orapin Komutiban, A., Piniti R.,Nitirat C., Nattapat L., Apichart,
S. (2006). Xanthones from the Green Fruit Hulls of Garcinia
mangostana. Journal of Natural Product, 65, 761-763.
Universitas Indonesia
Xi-Wen Li, Jie Li., Robson, Norman K. B., Stevens, P. (2009). Clusiaceae
in Flora of China Vol. 13. Beijing: Science Press and Missouri
Botanical Garden Press,1.
Universitas Indonesia
Pemisahan ekstrak
Gambar 4.3. Bagan Alur Ekstraksi dan Uji Aktivitas Antioksidan Daun Garcinia
daedalanthera Pierre
Fraksi 1-41
Universitas Indonesia
Uji DPPH
Gambar 4.4. Bagan Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Daun Garcinia daedalanthera
Pierre
Universitas Indonesia
25
y = 0.788x + 5.257
20 R = 0.966
% Hambatan
15
10
0
0 5 10 15 20
Konsentrasi (µg/mL)
100
y = 3.928x + 14.49
90
R = 0.981
80
70
% Hambatan
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
Konsentrasi (µg/mL)
Gambar 4.6. Kurva Persamaan Regresi Penetapan IC50 Ekstrak Etil Asetat
Universitas Indonesia
y = 2.565x + 17.07
70
R² = 0.912
60
50
% Hambatan 40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
Konsentrasi (µg/mL)
60
y = 14.12x + 18.05
50 R = 0.99
% Hambatan
40
30
20
10
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Konsentrasi (µg/mL)
Universitas Indonesia
100
y = 3.017x + 35.90
90
R² = 0.992
80
70
% Hambatan 60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
Konsentrasi (µg/mL)
Universitas Indonesia
A B C
Keterangan :
A = ekstrak n-heksan
B = ekstrak etil asetat
C = ekstrak metanol
Universitas Indonesia
Gambar 4.11 Uji Kualitatif Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Daun Garcinia
daedalanthera Pierre
Universitas Indonesia
A B C
A B C
A B C
Fraksi G
Keterangan : A = Dragendorff, B = Mayer, C = Bouchardat
Universitas Indonesia
A B A B A B
1 2 3
Keterangan :
A = Reaksi dengan penambahan serbuk seng, B = Reaksi dengan penambahan serbuk
magnesium, 1 = Kontrol positif daun Benalu mangga (Dendrophthoe Pentandra), 2 =
Ekstrak etil asetat, 3 = Fraksi G
Gambar 14.13. Hasil Identifikasi Golongan Flavonoida Pada Ekstrak Etil Asetat
dan Fraksi G
Universitas Indonesia
Terjadi
endapan
a b c d
Tidak terjadi
endapan
A B C A B C
3 2
Keterangan :
a = kontrol negatif HCl dengan Pb (II) Asetat (tanpa ekstrak); b = reaksi dengan penambahan
HCl + gelatin; c = reaksi dengan penambahan HCl + Na-gelatin; d = reaksi dengan
penambahan HCl + Pb (II) Asetat; A = reaksi dengan penambahan HCl + gelatin; B = reaksi
dengan penambahan HCl + Na-gelatin; C = reaksi dengan penambahan FeCl 3; 1 = kontrol
positif daun Teh (Camellia sinensis); 2 = ekstrak Etil Asetat; 3 = fraksi G
Gambar 14.14. Hasil Identifikasi Tanin Pada Ekstrak Etil Asetat dan Fraksi G
Universitas Indonesia
A B C
Keterangan :
A = reaksi pengocokan pada kontrol positif menggunakan Liquiritae Radix; B = reaksi
pengocokan pada ekstrak etil asetat; C = reaksi pengocokan pada fraksi G
Gambar 14.15. Hasil Identifikasi Saponin pada Ekstrak Etil Asetat dan Fraksi G
A B C
Keterangan :
A = kontrol positif menggunakan Rhei radix; B = Ekstrak etil asetat; C = Fraksi G
Gambar 14.16. Hasil Identifikasi Antrakinon pada Ekstrak Etil Asetat dan Fraksi
G
Universitas Indonesia
Tidak
Terdapat terdapat
cincin cincin
ungu ungu
A B C
Keterangan : A = kontrol positif menggunakan Nerii Folium; B = ekstrak etil asetat; C = fraksi G
Gambar 14.17. Hasil Identifikasi Glikosida pada Ekstrak Etil Asetat dan Fraksi G
A B C
Keterangan : A = kontrol positif menggunakan Hirtae Herba; B = ekstrak etil asetat; C = fraksi
G
Gambar 14.18. Hasil Identifikasi Terpen pada Ekstrak Etil Asetat dan Fraksi G
Universitas Indonesia
A B C D E F G H
Gambar 4.19. Hasil Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Daun Garcinia daedalanthera
Pierre
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Absorbans
Konsentrasi % Persamaan IC50
Sampel Blanko Sampel
(µg/mL) Inhibisi linier (µg/mL)
uji
12,5 0,595 6,593407
y = 0,788x
25 0,564 11,45997
Ekstrak n- + 5,257
heksan 50 0,637 0,539 15,38462 r = 0,966 56,780
75 0,512 19,62323
12,5 0,493 22,60597
y = 3,928x
25 0,361 43,3281
Ekstrak + 14,49
Etil asetat 50 0,637 0,22 65,46311 r = 0,981 9,040
75 0,048 86,18524
12,5 0,512 19,62323
y = 2,565x
25 0,399 37,36264
+ 17,07
Ekstrak 50 0,637 0,291 54,31711 r = 0,912 12,838
Metanol
75 0,247 61,22449
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Tabel 4.5. Nilai IC50 Hasil Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat Daun Garcinia
daedalanthera Pierre
Universitas Indonesia
75
0,201 69,40639
12,5 y = 3,017x
0,359 45,35769
25 + 35,90
0,306 53,42466
G 50 0,657 r = 0,992 4,673
0,156 76,25571
75
0,058 91,17199
12,5 y = 1,077x
0,457 30,4414
25 + 27,52
0,429 34,7032
H 50 0,657 r = 0,996 20,872
0,386 41,2481
75
0,345 47,48858
Universitas Indonesia
Tanin Gelatin 10 % -
NaCl-Gelatin -
FeCl3 -
Glikosida Molisch LP -
Antrakuinon Benzene P + -
NaOH 2N
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia