BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian
Penelitian ini termasuk ke dalam metoda penelitian eksperimental dimana
di dalamnya terdapat perlakuan untuk memanipulasi objek penelitian dan
diperlukan kontrol sebagai pembandingnya. Kontrol penelitian yang digunakan
yaitu berupa objek penelitian yang tidak diberi perlakuan.

B. Desain Penelitian
Desain penelitian yang digunakan ialah Rancangan Acak Lengkap (RAL),
dimana setiap perlakuan diberikan kondisi yang homogen sehingga diharapkan
tidak ada faktor luar yang mempengaruhi aktivitas antibakteri ekstrak daun
patikan kebo terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis.
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metoda difusi agar. Mengacu
pada penelitian Ogbulie et al. (2007: 1544) yang menguji aktivitas antibakteri
ekstrak daun patikan kebo terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi dan Bacillus subtilis
pada konsentrasi 50, 100, 150, 200, dan 250 mg/ml, maka konsentrasi ekstrak
daun patikan kebo yang digunakan dalam penelitian ini ialah 0, 50, 100, 150,
200, 250 dan 300 mg/ml. Selain itu, sebagai uji lanjutan untuk menentukan nilai
Konsentrasi Hambat Minimum (KHM), maka dilakukan pula pengenceran ekstrak
hingga menjadi berbagai konsentrasi uji (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, dan 55
mg/ml). Pada penelitian ini digunakan antibiotik kloramfenikol sebagai kontrol
positif dan pelarut DMSO 30% sebagai kontrol negatif. Banyaknya pengulangan
dalam penelitian didasari oleh aturan rumus Gomez (1995), yaitu: (t) (r – 1) • 20,
dimana (t) adalah banyaknya perlakuan dan (r) adalah banyaknya pengulangan
yang dapat digunakan dalam penelitian eksperimental.
Berdasarkan rumus di atas, jika banyaknya perlakuan (t)=8, maka
banyaknya pengulangan adalah
8 (r – 1) • 20
8r – 8 • 20
8r • 28
r • 28
8
r • 3,5 atau r § 4
Dari perhitungan tersebut, maka penelitian dapat dilakukan dengan
pengulangan sebanyak lebih dari 3,5 atau dibulatkan menjadi empat kali. Namun,
peneliti mengambil pengulangan sebanyak lima kali dengan harapan agar data
lebih akurat.

C. Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi pada penelitian ini ialah tanaman patikan kebo (Euphorbia hirta)
yang tumbuh di sekitar kampus UPI, Bandung Utara. Adapun sampel yang
digunakan ialah tanaman patikan kebo (Euphorbia hirta) yang diujikan pada
bakteri Staphylococcus epidermidis.
D. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari hingga Juli 2008. Tempat
yang digunakan selama penelitian ialah Laboratorium Mikrobiologi dan
Laboratorium Fisiologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam (FPMIPA) Universitas Pendidikan Indonesia (UPI).

E. Alat dan Bahan Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah alat-alat untuk
keperluan sterilisasi, ekstraksi bahan, pengkulturan bakteri uji dan pengujian
aktivitas zat antibakteri, seperti yang tercantum pada tabel 3.1 dibawah ini.
Tabel 3.1 Daftar Alat Penelitian
No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah
1 Beker glass 100 ml 2 buah
2 Gelas ukur 10 ml, 50 ml, 250 ml 1 buah
3 Waterbath shaker incubator EYELA NTS-1300 1 buah
4 Pinset ņ 4 buah
5 Lemari inkubator Gallenkamp 1 buah
6 Autoklaf HL36AE 1 buah
7 Penggaris Milimeter 1 buah
8 Tabung reaksi 13 x 150 mm 26 buah
9 Labu erlenmeyer 50, 250, 500 dan 1000 ml 4 buah
10 Spidol permanen ņ 1 buah
11 Pipet ņ 3 buah
12 Cawan Petri Diameter 9 cm 30 buah
13 Blender National 1 buah
14 Micropipette SOCOEX CALIBRA 822 1 buah
 15 Timbangan analitik HF-300 1 buah
16 Box transfer ņ 1 buah
17 Kawat ose ņ 1 buah
18 Api spirtus ņ 1 buah
19 Vortex mixer SIBATA TTM-1 1 buah
20 Hot plate RCH-3 1 buah
21 Camera digital OLYMPUS 1 buah
22 Colony counter SIBATA 1 buah
23 Rotary evaporator EYELA N-N Serieus 1 buah
24 Gunting ņ 1 buah
25 Gelas arloji ņ 2 buah
26 Lemari es ņ 1 buah
27 pH meter UCHIDA KT-1A 1 buah
28 Spectrophotometer MILTON ROY 1 buah
Spectronic 20D
29 Tabung kuvet ņ 2 buah
30 Water destilator EYELA STILL ACE 1 buah
SA-2100 EI

Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah seperti yang

tercantum pada table 2 di bawah ini.
Tabel 3.2 Daftar Bahan Penelitian
No. Nama Bahan Jumlah
1 Medium NA (Nutrient Agar) 1,5 liter
2 Medium NB (Nutrient Broth) 1 liter
3 Biakan murni bakteri S. epidermidis
1 tabung
(ATCC 12228)
4 Daun patikan kebo (Euphorbia hirta) 100 gram
5 Etanol 95% 2 liter
 6 Dimethylsulfoxide (DMSO) 50 ml
7 Akuades 5 liter
8 Kloramfenikol 1 kapsul (250 mg)
9 Kertas saring Whatman No.1 4 lembar
10 Cakram kertas secukupnya
11 Kapas 1 bungkus
12 Benang kasur 1 gulung
13 Korek api 1 buah
14 Plastik tahan panas 1 bungkus
15 Kertas label 1 pak
16 NaCl 0,85% 1 liter
17 Air deion 500 ml
18 Alumunium foil 1 gulung
19 Karet 1 bungkus
20 Kain kassa 1 bungkus

F. Prosedur Kerja
Langkah penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap, yaitu tahap persiapan,
tahap pengujian, dan tahap pengolahan data.
1. Tahap Persiapan
a. Sterilisasi Alat dan Bahan
Dilakukan pengumpulan alat-alat yang akan digunakan kemudian
dilakukan pembuatan media NA (Nutrient Agar) dan NB (Nutrient Broth).
Setelah itu, semua alat dan bahan tersebut disterilisasi di dalam autoklaf selama
15 menit dengan mengatur tekanan sebesar 1,5 kg/cm2 (1 atm) dan suhu sebesar
121oC yang sebelumnya telah dibungkus dengan plastik tahan panas. Alat-alat
yang tidak tahan panas disterilisasi dengan cara disemprotkan etanol 70%.

b. Pembuatan Kurva Tumbuh Bakteri Staphylococcus epidermidis

Pada langkah ini diambil satu ose bakteri Staphylococcus epidermidis
yang dibiakan dalam medium NA (Gambar 3.1), lalu diinokulasikan pada labu
erlenmeyer yang berisi 10 ml media Nutrient Broth (NB) dan diinkubasikan
secara aerob pada waterbath shaker incubator bersuhu 37oC selama 24 jam.
Setelah itu, suspensi bakteri tersebut dicampurkan ke dalam 90 ml media NB
pada labu erlenmeyer yang lebih besar dan dihomogenkan selama 5 menit.
Kemudian, disiapkan medium NB sebagai blanko dan dimasukkan sebanyak 5 ml
ke dalam tabung kuvet untuk dilakukan pengaturan besarnya nilai transmitansi
hingga sebesar 100% pada alat spectrophotometer dengan panjang gelombang
570 nm. Setelah itu, pada kuvet lainnya dimasukkan 5 ml suspensi bakteri uji
yang telah diaktivasi dan dilakukan pula pengukuran nilai kekeruhannya.
Suspensi bakteri yang tersisa tetap diinkubasikan secara aerob dan setiap dua jam
sekali dilakukan pengukuran kekeruhan seperti sebelumnya. Pengukuran ini
dilakukan hingga jam ke-16 usia bakteri.
Dari nilai absorbansi yang diperoleh pada setiap usia pertumbuhannya,
maka dapat dibuat sebuah kurva tumbuh yang menunjukkan hubungan antara
besarnya nilai absorbansi dengan usia bakteri tersebut. Kurva tumbuh tersebut
dibuat dengan menggunakan program Microsoft Excel untuk mengetahui fase-
fase pertumbuhan bakteri uji, sehingga diketahui usia bakteri yang berada pada
fase pertumbuhan logaritmik. Bakteri S. epidermidis yang digunakan dalam uji
aktivitas antibakteri ialah bakteri yang memiliki laju pertumbuhan tertinggi
(Cappuccino & Sherman, 1987: 117).

Gambar 3.1 Kultur Murni Bakteri Staphylococcus epidermidis dalam

Medium NA berusia 1 hari
(Sumber: Koleksi Pribadi)

c. Pembuatan Kurva Baku Bakteri Staphylococcus epidermidis

Pembuatan kurva baku bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah
bakteri secara kuantitatif dengan metode cawan tuang (pour plate) yang
dihubungkan dengan besarnya nilai absorbansi yang didapat. Langkah ini
dilakukan saat usia bakteri berada pada fase logaritmik yaitu pada jam ke-4, 6
dan 8. Satu ose bakteri S. epidermidis diinokulasikan pada labu erlenmeyer yang
berisi 10 ml media Nutrient Broth (NB), lalu diinkubasikan secara aerob pada
waterbath shaker incubator bersuhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu, suspensi
bakteri tersebut dicampurkan ke dalam 90 ml media NB pada labu erlenmeyer
dan diaktivasi kembali hingga bakteri berusia pada fase logaritmik. Setelah
aktivasi selesai, dilakukan pengukuran besarnya nilai absorbansi pada
spectrophotometer untuk tiap usia fase logaritmik tersebut dan disiapkan larutan
NaCl 0,85% untuk dibuat pengenceran suspensi bakteri mulai dari pengenceran
10-1 hingga 10-10. Pengenceran 10-1 dibuat dengan cara mengambil 1 ml suspensi
bakteri uji yang telah diaktivasi dan dimasukkan pada tabung reaksi yang berisi 9
ml larutan NaCl 0,85%, lalu dihomogenkan dengan vortex. Kemudian pada
pengenceran 10-2, diambil 1 ml suspensi bakteri pada tabung pengenceran 10-1
tadi dan dicampurkan dengan 9 ml larutan NaCl 0,85% pada tabung lain,
begitupun pada pengenceran 10-3 sampai 10-10. Setelah pengenceran bakteri
dibuat, pada pengenceran 10-6 hingga 10-10 diambil 1 ml suspensi bakteri dan
dicampurkan dengan 9 ml medium Nutrient Agar (NA) cair kemudian
dihomogenkan pada cawan Petri. Pada metode cawan tuang ini dilakukan
replikasi dua kali (duplo) untuk tiap pengenceran bakteri. Medium yang telah
terisi bakteri tersebut dibiarkan beberapa lama hingga memadat dan
diinkubasikan secara aerob selama 24 jam pada suhu 37oC. Keesokan harinya
dilakukan penghitungan jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh pada medium
tersebut dengan menggunakan colony counter. Perkiraan jumlah bakteri
sebenarnya dapat diketahui dengan cara mengalikan jumlah koloni yang
terhitung dengan besarnya pengenceran. Data jumlah bakteri yang terhitung
pada usia logaritmik tersebut dihubungkan dengan nilai absorbansi yang telah
diukur sebelumnya, sehingga dapat dibuat sebuah kurva baku yang diperoleh dari
hasil analisis program Microsoft Excel. Konsentrasi bakteri uji yang digunakan
dalam uji aktivitas antibakteri diatur hingga berkonsentrasi 108 cfu/ml
(Cappuccino & Sherman, 1987: 75).
d. Identifikasi Tanaman Patikan Kebo (Euphorbia hirta)
Determinasi tanaman patikan kebo (Euphorbia hirta) dilakukan dengan
menggunakan acuan kunci determinasi Flora of Java (Backer & Brink, 1965)
untuk mengetahui ciri-ciri tanaman tersebut yang akan dipilih sebagai sampel
penelitian.

e. Ekstraksi Daun Patikan Kebo

Daun patikan kebo (Euphorbia hirta) yang diambil dari sekitar kampus
UPI, Bandung Utara dicuci dengan air bersih lalu dikering-anginkan (tidak
terkena sinar matahari langsung) selama satu minggu sampai daun kering. Daun
yang telah kering dihaluskan hingga berbentuk serbuk dengan menggunakan
blender dan dikumpulkan hingga sebanyak 20 gram. Daun kering dan serbuk
daun patikan kebo dapat dilihat pada Gambar 3.2. Serbuk daun tersebut
dicampurkan dengan pelarut etanol 95% sebanyak 250 ml dan disimpan pada
labu erlenmeyer. Labu tersebut ditutup dan dikocok setiap 30 menit sekali selama
6 jam lalu larutan tersebut dibiarkan (dimaserasi) selama 48 jam. Setelah itu,
larutan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman No.1. Kemudian,
hasil saringan tersebut diuapkan pelarutnya dengan menggunakan rotary
evaporator hingga didapatkan ekstrak kasar etanol. Serbuk daun yang masih
terlihat hijau setelah penyaringan dilarutkan kembali dengan etanol 95%
sebanyak 200 ml dan dimaserasi kembali selama 48 jam. Larutan tersebut
disaring dengan kertas saring whatman dan diekstraksi pula dengan rotary
evaporator. Ekstrak yang diperoleh kemudian dikumpulkan dan dihitung berat
totalnya. Ekstrak diasumsikan telah berkonsentrasi 100% dan siap diencerkan
menjadi berbagai konsentrasi dengan menggunakan pelarut DMSO
(Dimethylsulfoxide) 30%. Selanjutnya, ekstrak disimpan dalam botol gelap atau
botol bening yang ditutup alumunium foil pada suhu 5oC untuk mencegah
terjadinya perubahan kimiawi (Ogbulie et al., 2007: 1545).

Gambar 3.2 Daun Kering dan Serbuk Daun Patikan Kebo

(Sumber: Koleksi Pribadi)

f. Penyediaan Suspensi Bakteri Staphylococcus epidermidis

Biakan murni bakteri uji yang telah diperbanyak sebelumnya pada media
NA kemudian digunakan untuk pembuatan suspensi bakteri yang jumlahnya
diatur hingga 108 cfu/ml. Langkah ini dilakukan dengan cara menginokulasikan
satu ose bakteri ke dalam 10 ml mediun NB dan diaktivasi selama 24 jam pada
waterbath shaker dengan kecepatan 150 rpm. Setelah itu, 10 ml suspensi bakteri
tersebut dimasukkan ke dalam 90 ml medium NB yang baru kemudian diaktivasi
kembali sampai bakteri berusia fase logaritmik (jam ke-4). Besarnya turbiditas
suspensi bakteri diatur hingga mencapai jumlah yang diinginkan (108 cfu/ml).
Setelah diperoleh turbiditas suspensi bakteri yang diinginkan, maka suspensi
bakteri tersebut siap untuk diujikan.

g. Pengenceran Ekstrak Daun Patikan Kebo

Pada uji aktivitas antibakteri tahap awal, ekstrak kasar patikan kebo
diencerkan dengan pelarut DMSO 30% menjadi berbagai konsentrasi mulai dari
50, 100, 150, 200, 250 hingga 300 mg/ml (Ogbulie et al., 2007: 1544). Kemudian,
sebagai uji lanjutan untuk penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM),
dilakukan pula pengenceran ekstrak hingga berkonsentrasi 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45, 50, dan 55 mg/ml. Pada metode ini digunakan pelarut DMSO 30% sebagai
kontrol negatif dan antibiotik kloramfenikol 30 ȝg/ml sebagai kontrol positifnya.
Sebelum digunakan untuk uji aktivitas antibakteri, ekstrak disimpan dalam botol
gelap pada suhu 5oC untuk menghindari terjadinya perubahan kimiawi.

2. Tahap Pengujian
Pelaksanaan uji aktivitas antibakteri dilakukan secara aseptik dengan
metoda difusi agar. Cawan Petri diisi dengan medium NA yang telah dicairkan
sebelumnya sebanyak 9 ml dan dimasukkan 1 ml inokulum berkonsentrasi 108
cfu/ml. Kemudian, cawan digoyang perlahan agar bakteri tersebar merata dan
dibiarkan beberapa saat hingga medium memadat. Setelah itu, dilakukan
perendaman cakram kertas selama 2 menit pada larutan ekstrak daun patikan kebo
untuk berbagai konsentrasi yang telah disiapkan. Cakram kertas tersebut diambil
dengan pinset dan dibiarkan beberapa saat agar tidak terlalu basah, kemudian
diletakkan di atas media padat berisi bakteri tadi yang telah diberi label
sebelumnya. Satu cawan petri diisi oleh 5 buah cakram kertas untuk pengujian
awal dan diisi 7 buah cakram kertas untuk uji lanjutan (penentuan nilai KHM).
Pada setiap konsentrasi uji dilakukan replikasi sebanyak lima kali. Media
diinkubasikan secara aerob dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam, lalu
diukur diameter zona hambat yang terbentuk dengan menggunakan penggaris
ukuran milimeter.

3. Tahap Pengolahan Data

Data hasil penelitian yang normal dan homogen (setelah diuji dengan uji
Kolmogorov-Smirnov dan uji Levene’s) akan dianalisa dengan Analysis of Varians
(ANOVA) Satu Arah dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui ada
tidaknya pengaruh yang signifikan pemberian ekstrak daun patikan kebo terhadap
pertumbuhan bakteri S. epidermidis, kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey
untuk mengetahui perbedaan secara signifikan dari data satu kelompok perlakuan
ekstrak dengan kelompok lainnya.

G. Alur Penelitian
Alur penelitian dapat dilihat seperti pada Gambar 3.3 di bawah ini.

Pembuatan proposal penelitian

Penyiapan sampel penelitian (daun patikan kebo

dan bakteri Staphylococcus epidermidis)
 Persiapan alat dan pembuatan medium

Sterilisasi alat dan bahan

(kecuali daun patikan kebo)

Pengkulturan bakteri uji pada Identifikasi tanaman dan

media agar miring (NA) ekstraksi daun patikan kebo

Pembuatan kurva tumbuh dan Pengenceran ekstrak

kurva baku bakteri uji

Penyiapan suspensi bakteri uji

Uji aktivitas antibakteri

Pengukuran diameter daya hambat

Pengumpulan dan analisis data

Penentuan nilai KHM dan penarikan kesimpulan

Penyusunan laporan/skripsi

Gambar 3.3 Diagram Alur Penelitian