BAB I

PENDAHULAN

1.1 LATAR BELAKANG

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi
cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa
zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang
pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan
pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah
berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan
unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini
membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya
merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin
suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas.
Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,
gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.

Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi cairan
kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang
sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena
gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan
yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup
kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland
dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini
digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju
alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat
(sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun
peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya
dalam kimia organik

1
1.2 Rumusan Masalah

1. Pengertian HPLC
2. Jenis- jenis HPLC
3. Instrument HPLC
4. Prinsip kerja HPLC
5. Aplikasi HPLC
6. Manfaat Penggunaan HPLC
7. Kelebihan dan Kekurangan HPLC
8. Penggunaan alat
9. Analisa data
10. preparasi sampel

1.3 Tujuan

a. Mengetahui Pengertian HPLC

b. Mengetahui Jenis- jenis HPLC
c. Mengetahui Instrument HPLC
d. Mengetahui Prinsip kerja HPLC
e. Mengetahui Aplikasi HPLC
f. Mengetahui Manfaat Penggunaan HPLC
g. Mengetahui Kelebihan dan Kekurangan HPLC
h. Mengetahui cara pengoperasian alat
i. Mengetahui cara pengolahan data

2
 BAB II

PEMBAHASAN

A. PENGERTIAN

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana
fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa
analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu
teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern,
yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem
pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa
kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil
dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada
kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam
analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat
diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat
digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan
dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat
yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian
bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam
analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara
lain :

3
a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit
bisa dicapai.
b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena
pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.

c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram
(10-12 gram).
d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT
dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama
sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.

e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara
KCKT.
f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang
digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan
terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.

g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.

Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki
beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis
farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik
beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil
pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat
dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik
makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif
dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.

4
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun
metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis
yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis

2. Analisis ketidakmurnian (impurities)

3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)

4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

B. Jenis- Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih
polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya).
Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC
fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat
secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau
fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
5
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan
bufer.
Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau
pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya
spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah
dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang
paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena
sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga
pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi
oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam
dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga
solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul
solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian
molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal
ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara

6
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi
interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika
ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran
yang sangat kompleks.

C. Instrument HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,
dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

1 . Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

7
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase
gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan
mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam,
dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase Gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector,
fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC
merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.

Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar.
Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada
partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.

b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak
polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.

8
Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan
dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5.

2.Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu
nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan
aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3 ( Tiga ) jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:

a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan
piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung
dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,
sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah
berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong
yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan
bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000
psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

3. Tempat Injeksi
9
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum
dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis
atau manual melalui injeksi.
Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya
20 – 500 μL).

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan
aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi
tidak dipengaruhi

b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi
septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari
septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai,
volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke
dalam kolom.

Syarat- syarat injektor yang baik :

 Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
 Mudah digunakan
 Keberulangan tinggi

10
  Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.

Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :

Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor

Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 cm Diameter dalam 1 atau 2 mm

Fase diam Porous, silika ukuran kecil, silika
yang dimodofikasi secara kimiawi
(bonded phase), atau polimer- polimer
stiren/divinil benzen. Rata-rata
diameter paatikel 3,5 atau 10µm
dengan kisaran sempit.
Porous, silika ukuran kecil, silika
yang dimodofikasi secara kimiawi
(bonded phase), atau polimer-
polimer stiren/divinil enzen.
Rata-rata diameter partikel 3,5 atau
10 µm dengan kisaran sempit.

Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi

operasional (35-215 bar (70-350 bar)
Fase gerak Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau Hidrokarbon+pelarut terklorinasi
alkohol untuk fase normal. Untuk fase atau alkohol untuk fase normal.
terbalik (reversed phase) digunakan Untuk fase terbalik (reversed
metanol atau asetonitril + air atau phase) digunakan metanol atau
bufer.Kecepatan alir : 1-3 ml/menit asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir 10-100 µl/
menit.Modifikasi instrumen
Sistem
penghantaran pelarut yang
mampu memberikan kontrol
aliran di bawah 10µl/menit.Katup
injeksi sampekl bervolume

11
 kecil;sel detektor bervolume
kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif,
bekurannya ukuran partikel fase diam, akan tetapi lambat,konsumsi fase
akan tetapi umur kolom dengan gerak hanya ¼ dari kolom
ukuran partikel 3 µm lebih pendek. konvensional.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100
μl/menit). Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

1. Fase Diam

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi
secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.

2. Detektor

12
 Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;

b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
e signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Pendeteksian Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas

sensitifitas kecepatan alir suhu
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah

Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah

Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah

Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C

Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C

Spektometri massa Umum 10-10 Tidak Tidak ada

elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

D. Prinsip Kerja HPLC

13
 Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase
diam.
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang
paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan
tinggi untuk mendorong fasa gerak.

Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai
ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi
< golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang
paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang
mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat.
Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram.
Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara
dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun
memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di
dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada
kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan
untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang
khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang
khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses
separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam
sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram
dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan
menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
14
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih
mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya
melaui proses pelarutan saja.

E. Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru
yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya.

Kelebihan itu antara lain:

a . Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

b . Mudah melaksanakannya

c . Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

d . Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang
baik

e . Dapat digunakan bermacam- macam detektor

f . Kolom dapat digunakan kembali

15
g . Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.

h . Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC

dilakukan pada suhu kamar.

i . Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.

j. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat
tinggi seperti polimer

k . Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas

l. Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak
analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

m. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

n. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada
HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

o. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.

p. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram
(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,
Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC

q. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan
kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis
solven yang digunakan

r. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.
HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat
tersebut.

s. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak
menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena

16
 itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati
detector.

t. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.

Sedangkan kekurangannya adalah:

a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic

c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi

d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

E. Teknik Pengoperasian Alat

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui
apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya
dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi
17
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa,
waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran partikel)

 Komposisi yang tepat dari pelarut

 Temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi
sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

18
 senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda
menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi
yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap
dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang
dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya
menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan
yang salah dari pelarut.

F. Analisis Kromatogram/ interpretasi data

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak

mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah
mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa
yang dihasilkan.

Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui
jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut,
tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa
yang dihasilkan.

19
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.

Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan
sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam
sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat
mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X.
Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y
mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin
ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak
yang kecil.

G. Contoh Analisa

Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran

20
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk
hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat
kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

Penggunaan KCKT dalam bidang farmasi

Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat
baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan KCKT merupakan
metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi.

Berikut ini adalah beberapa contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :

Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak Detektor

Asetonitril-asam Fluoresen
Adriamisin (serum) C18 fosfat 0,01 N ph EK : 465 nm
2,3 (50:50) EM : 580 nm
Aktinomisin
C18 CH3CN-H2O (1:1) Elektrometer
(Serbuk)
KH2PO4 0,05M;
Allopurinol (tablet) C18; 4 x 30 cm UV 254 nm
1,5 ml/menit

1. Parasetamol:

Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida

21
 Rumus Molekul : C8H9NO2

Berat Molekul : 151,16

Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.

Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N,

mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino fenol

yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik.

`Asetaminofen merupakan pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada
penderita dengan keluhan saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan
yang tidak menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan
analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar
seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna.
Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam.
Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma.
Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.

Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses
analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu
larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC
dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini
dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya.
Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi.

Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada

perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat
akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom
dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah
detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV.

Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan

panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm

22
 Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik karena teknik
ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut
non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar
sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati
kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu
yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian
parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya
hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini
merupakan grafik antara intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu
retensi.

Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data
yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan
antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi
longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran
komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh kecepatan
komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju
alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran
partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter- parameter ini dapat
menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti pelebaran pada puncak.
Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan terjadinya overlapping analit
yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam
sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari grafik luas area terhadap konsentrasi
(ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat.

Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh
kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg
diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan
bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per tabletnya.

2. Kafein

Rumus struktur :
23
 Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin

Rumus Molekul : C8H10N4O2

Berat Molekul : 194,19

Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya

menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.

Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam

kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).

Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC yang
digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer, Kolom :
Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ).

Menggunakan asam asetat 70% dan methanol 30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri
dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap injection ke HPLC.

ANALISIS KUANTITATIF

Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak

Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan
bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar / konsentrasi zat
yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak,
yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan
sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan
komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:

Peak area
No
Kafein standar Kafein dalam sampel

1 2601417,40 2216635,31

24
Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis
dengan mengunakan persamaan :

Cx = Ax / Ap X Cp

= x 200 ppm

= 170,42 ppm

Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:

Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen
muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-komponen dapat
berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita harus mengasumsi
bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen

Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.

Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan
mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana
jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis.
Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau
asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.

Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan untuk
memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-kira 100
cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat tidak mungkin.
Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih dari 600
mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek, 2001).

25
Preparasi Sampel

· Sampel harus dalam bentuk larutan

· Untuk skala analisis sampel dalam mikroL , konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh
terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.

Konsentrasi maksimal adalah 40 ppm.

Preaparasi Fase Gerak

 fase Gerak ( eluen ) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk
air digunakan akuabidest. Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan milipore
kemudian diawagaskan ( di digest ) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan
udara terlarut.

 Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan untuk
menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.

· Tabung eluen yang diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang di gunakan.

BAB III
PENUTUP
Kesimpulan

a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.

b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan

senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner
(diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.

c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan
pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak

26
tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan
instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah
larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic,
harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya
mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press.
Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan
Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3

27
Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta

http://ruangdiskusiapoteker.blogspot.co.id/2012/06/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

http://paramita-kromatografi.blogspot.co.id/2012/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt_6.htm
l

28