LAPORAN BIOLOGI MOLEKULER II

PROJECT 1

DETEKSI DAGING BABI PADA PRODUK OLAHAN PANGAN

DOSEN : MAHARANI PERTIWI K. S.SI., M. BIOTECH

Di susun oleh kelompok 4 kelas A1 :

1. I Dewa Ayu Nike Kusnia (2240017013)

2. Fahrus fahmi (2240017015)
3. Nihayatussa’diyah (2240017016)
4. Siti basiroh (2240017017)
5. Riyadah (2240017018)

UNIVERSITAS NAHDLATUL ULAMA SURABAYA

D-IV ANALIS KESEHATAN
2018-2019
 DETEKSI DAGING BABI PADA PRODUK OLAHAN PANGAN

STANDAR KOMPETENSI

 Mahasiswa memiliki keterampilan dalam :

1. Isolasi DNA
2. Uji kualitatif dan kuantitatif DNA (Elektroforesis, Spektrofotometer, Nanodrop)
3. Tehnik amplifikasi asam nukleat (PCR) dalam diagnostik

KOMPETENSI DASAR

1. Melakukan isolasi DNA dari sampel jaringan dan sampel maknan

2. Melakukan uji kualitatif dan uji kuantitatifDNA(Elektroforesis,Spektrofotometer,Nanodrop)
3. Terampil dalam tehnik amplifikasi asam nukleat (PCR) dalam diagnostik

INDIKATOR

Mahasiswa mampu untuk :

1. Menyiapkan alat dan bahan serta melakukan isolasi DNA

2. Melakukan uji kualitatif dan kuantitatif DNA hasil isolasi
3. Menyiaokan alat dan bahan serta melakukan tehnik PCR dalam diagnostik

TUJUAN

1. Meningkatkan kemampuan tehni isolasi DNA

2. Mengaplikasikan tehnik PCR dalam mendeteksi gen babi dalam produk olahan

A. PENDAHULUAN
Makanan yang di konsumsi pada masyarakat muslim pada khususnya haruslah bebas dari
kontaminan bahan yang diharamkan Allah SWT. Babi merupakan salah satu hean yang di
gunakan sebagai bahan penambah citarasa maupun zat aditif pada makanan.teknologi
molekuler dapat digunakan sebagai solusi alternatif yang akurat untuk memastikan apakah
suatu sampel makanan mengandung kontaminan babi. Tehnik ini digunakan dengan
melakukan isolasi DNA pada sampel makanan. Tehnik olekuler yang dapat digunakan
sebagai metode identifikasi kontaminan daging babi secara tepat atau rapid test adalah tehnik
PCR. Untuk mengamplifikasi DNA babi, maka primer yang digunakan adalah primer spesifik
DNA babi. Sebagai contoh, primer spesifik yang biasa di gunakan adalah gen sitokrom b.
B. ALAT DAN BAHAN
1. Alat

Mikrosentrifuge tube 1,5 ml Inkubator

Microsentrifuge tube PCR Mesin thermocycler
Botol sampel steril Elektroforesis gel mini
Tabung sentrifuge 15 ml steril Vortex
Mikropipet Oven

2. Bahan

DNA isolation kit TAE buffer 10×

PBS steril Agarose
Sampel daging babi Ethidium bromida (EtBr)
PCR master mix Lisozim/proteinase K
Sampel makanan Akuades steril
Primer pork-F: ATG AAA CAT TGGA CTA Loading dye 6×
CT CCTACTATTTACA
Primer pork-P: Isopropanol
CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG
50 mM EDTA (Ph 8,0) Ethanol absolute
Nutrient broth Etanol 70%
Nutrient agar SDS

C. CARA KERJA
1. Koleksi sampel olahan makanan
 Sampel produk olahan makanan di ambil dari beberapa sumber, dengan
dokumentasi sebagai berikut :
No Lokasi/sumber Ciri fisik sampel Keterangan
1. Sosis
2. Bakso
 Sapel makanan daging babi (kontrol positif) diambil sebanyak 10 gr dan di
masukkan dalam botol steril
  Sampel makanan dapt di simpan dalam lemari pendingin
2. Isolai total DNA dari daging babi dan sampel olahan makanan
 Sebanyak 30 mg sampel daging/olahan makanan digerus dengan mortar steril di
masukkan dalam dabung ependorf 1,5 ml yang beirisi 500µl buffer TEN/STE,
 Tabung di vortex dan ditambah 20µl proteinase K (10mg/ml) dan 50µl (10% SDS,
kemudian di vortex)
 Larutan dihomogenisasi menggunakan shaking water bathpada suhu 55⁰C selama
2 jam. Larutan di tambah 50µl 5M NaCl, 400µl CIAA, lalu diputar pelan-pelan
pada temperatur ruang selama 1,5 jam
 Tabung disentrifuge 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang tebentuk
dipindah ke tabung baru, ditambahkan 50µl 5M NaCl dan 1 ml etanol absolut, di
kocok, dan diinkubasi di freezer selama 1 jam
 Setelah inkubasi selesai, campuran tersebut disentrifuge lagi 8000 rpm selama 5
menit, kemudian dibuang supernatannya
 Pellet ditambahkan 1 ml etanol 70%, dan disentrifuge lagi 8000 rpm selama 5
menit
 Supernatan dibuang dan ditiriskan sampai tidak ada larutan yang tertinggal
 Sisa etanol dikeringkan selama 30-60 menit, kemudian ditambah 50 µl TE RNAse
(10mg/ml), divortex dan di inkubasi pada suhu 37⁰C elama 3 jam.
 Setelah inkubasi ditambah 200 µl air destilasi steril, 200 µl fenol, 200
µlkloroform, dihomogenkan menggunakan tangan dan disentrifuge 8000 rpm
selama 10 menit
 Supernatan dipindah ke tabung baru, kemudian ditambah 25 µl etanol absolute
dingin dan di inkubasi pada suhu -20⁰C selama 1 jam
 Setelah inkubasi selesai, disentrifuge 8000rpm 10 menit, supernatan di buang dan
tiriskan sehingga semua larutan terbuang
 DNA di tamhan TE dan disimpan pada suhu ruang sampai di gunakan
 Jika akan di gunakan pada hari berikutnya disimpan pada suhu 4⁰C
3. Analisis kualitas DNA (spektrofotometer)
 Siapkan contih DNA yang akan di ukur
 Apabila DNA disimpan dalam freezer, maka tunggu sampai semua larutan
mencair dengan sempurna
 Ambil 10 µl contoh DNA dan masukkan dalam tabung ependorf 1,5 ml
 Tambahkan 1990 µl akuades steril
  Vortex larutan selama 10 detik
 Hidupkan uv-vis spektrofotometri dan atur panjang gelombang yang diperlukan,
yaitu 260 dan 280 nm
 Masukkan 2 ml aquades steril ke dalam kuvet 1 sebagai blanko dan masukkan
setiap contoh DNA yang telah diencerkan sehingga volumenya menjadi 2 ml ke
dalam kuvet 2
 Muncul nilai aborbansi tiap contoh DNA pada λ260nm dan λ280nm
 Menghitung nilai kemurnian DNA dengan rumus nilai absorbansi contoh DNA
λ260nm dibagi dengan nilai absorbansi contoh DNA λ280nm
4. Analisis kualitas DNA (elektroforesis)
 Kualitas dan integritas DNA diperiksa menggunakan elektroforesis dengan
konsentrasi gel agarose 0,8%
 Sebanyak 2 µl hasil isolasi ditambahkan 8 µl akuades steril dan 2 µl loading dye
6×
 Sebagai pembanding λ DNA lodder digunakan dan diletakkan pada sumur pertama
 Elektroforesis dijalankan pada tegangan 50 volts smpai DNA bermigrasi ± 1 cm
diatas batas bawah
 Gel di rendam dalam larutan staining EtBr (0,5 µl/ml) selama 30 menit, lalu
diambil dan di masukkan dalam ddH2O selama 20 menit
 Setelah itu gel siap untuk difoto
 Kuantitas DNA ditentukan dengan membandingkan ketebalan pita DNA sampel
dengan pita standart λ DNA lodder
5. Amplifikasi template DNA dengan polymerase chain reaction (PCR)
 Amplifikai DNA dilakukan ddengan menggunakan PCR, dengan komposisi
sebagai berikut :
No Bahan volume Keterangan
Green master mix
1.
Primer F
2.
Primer R
3.
Akuades steril
4.
Total volume
  Semua bahan dimasukkan dalam mikrosentrifuge tube PCR
 Mesin thermocycler diatur dengan susunan sebagai berikut :
No Tahap Suhu Waktu Keterangan
Pre-denaturasi 98⁰C 2 menit
1.
Denaturasi 95⁰C 30 detik 30 siklus
2.
Annealing 61⁰C 30 detik 30 siklus
3.
Extension 72⁰C 40 detik 30 siklus
4.
Final extension 72⁰C 3 menit
5.

 Hasil PCR selanjutnya di simpan pada suhu 4⁰C

6. Analisis hasil PCR dengan elektroforesis gel agarose
 Sebanyak 5µl hasil amplifikasi DNA dengan PCR dicampurkan dengan loading dye
 Sampel di-loading ke dalam gel agarose elektroforesis dengan konsentrasi 1%
dalam 1× TAE buffer
 Elektroforesis diatur dengan arus listrik 50V selama 30 menit (hingga warna
indikator mencapai 1 cm dari tepi bawah gel
 Gel di inkubasi dalam larutan EtBr selama 30 menit
 Pengamatan pita DNA menggunakan UV transluminator
 Fragmen yang terlihat dibandingkan dengan kontrol positif (daging babi) yang
memiliki ukuran 584 bp
D. HASIL PENGAMATAN

No Perlakuan Dokumentasi
. ISOLASI DNA TOTAL
1. Sebanyak 30 mg sampel daging/olahan
makanan digerus dengan mortar steril di
masukkan dalam dabung ependorf 1,5 ml
yang beirisi 500µl buffer TEN/STE.

2. Tabung di vortex dan ditambah 20µl

proteinase K (10mg/ml) dan 50µl (10%
SDS, kemudian di vortex)

3. Larutan dihomogenisasi menggunakan

shaking water bathpada suhu 55⁰C selama
2 jam. Larutan di tambah 50µl 5M NaCl,
400µl CIAA, lalu diputar pelan-pelan
. pada temperatur ruang selama 1,5 jam

4. Tabung disentrifuge 3000 rpm selama 5

menit. Supernatan yang tebentuk dipindah
. ke tabung baru, ditambahkan 50µl 5M
NaCl dan 1 ml etanol absolut, di kocok,
dan diinkubasi di freezer selama 1 jam
5. Setelah inkubasi selesai, campuran tersebut
disentrifuge lagi 8000 rpm selama 5 menit,
kemudian dibuang supernatannya Pellet
ditambahkan 1 ml etanol 70%,

6. Sentrifuge dengan kecepatan 8000 rpm

selama 5 menit Supernatan dibuang dan
ditiriskan sampai tidak ada larutan yang
tertinggal
.
7. Sisa etanol dikeringkan selama 30-60
menit, kemudian ditambah 50 µl TE RNAse
(10mg/ml), divortex dan di inkubasi pada
. suhu 37⁰C elama 3 jam.

8. Setelah inkubasi ditambah 200 µl air

destilasi steril, 200 µl fenol, 200
µlkloroform, dihomogenkan menggunakan
. tangan dan disentrifuge 8000 rpm selama 10
menit

.
9. Supernatan dipindah ke tabung baru,
kemudian ditambah 25 µl etanol absolute
dingin dan di inkubasi pada suhu -20⁰C
selama 1 jam
.
.10. Setelah inkubasi selesai, disentrifuge
8000rpm 10 menit, supernatan di buang dan
tiriskan sehingga semua larutan terbuang

.11. DNA di tamhan TE dan disimpan pada suhu

ruang sampai di gunakan Jika akan di
gunakan pada hari berikutnya disimpan
pada suhu 4⁰C

. ANALISIS KUALITAS DNA

(SPEKTROFOTOMETER)

1. Siapkan contih DNA yang akan di ukur

Apabila DNA disimpan dalam freezer,
. maka tunggu sampai semua larutan mencair
dengan sempurna

2. Ambil 10 µl contoh DNA dan masukkan

dalam tabung ependorf 1,5 ml Tambahkan
1990 µl akuades steril dan vortex
.

3. Masukkan 2 ml aquades steril ke dalam

kuvet 1 sebagai blanko dan masukkan setiap
contoh DNA yang telah diencerkan
sehingga volumenya menjadi 2 ml ke dalam
kuvet 2
4. Muncul nilai aborbansi tiap contoh DNA
pada λ260nm dan λ280nm
Menghitung nilai kemurnian DNA dengan
rumus nilai absorbansi contoh DNA
λ260nm dibagi dengan nilai absorbansi
contoh DNA λ280nm
 Analisis kualitas DNA (elektroforesis)
1. Kualitas dan integritas DNA diperiksa
menggunakan elektroforesis dengan
konsentrasi gel agarose 0,8% Sebanyak 2 µl
hasil isolasi ditambahkan 8 µl akuades steril
dan 2 µl loading dye 6×

2. DNA diletakkan pada well / sumuran yang

ada di elektroforesis Elektroforesis
dijalankan pada tegangan 50 volts smpai
DNA bermigrasi ± 1 cm diatas batas bawah

3. Gel di rendam dalam larutan staining EtBr

(0,5 µl/ml) selama 30 menit, lalu diambil
dan di masukkan dalam ddH2O selama 20
menit

4. Amati hasil dengan uv transluminator

AMPLIFIKASI TEMPLATE DNA

DENGAN POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR)

1.
E. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini kami membahas tentang ”DETEKSI DAGING BABI PADA
PRODUK OLAHAN PANGAN” produk olahan pangan merupakan makanan atau minuman
hasil dari proses pengolahan dengan cara atau metode tertentu, dengan atau tanpa bahan
tambahan. Adapun tujuan dari dilakukannya praktikum ini adalah untuk meningkatkan
kemampuan tehnik isolasi DNA, mengaplikasikan tehnik PCR dalam mendeteksi produk
olahan serta mengetahui adanya kandungan gen babi dalam produk olahan pangan. Sampel
yang kami gunakan dalam analisi ini adalah sosis dan bakso daging yang beredar di pasar-
pasar bebas. Kami sengaja membeli produk sosis dan bakso yang tidak mempunyai merk dan
tidak terdapat label HALAL.
Hal pertama yang kami lakukan yaitu isolasi DNA total dari daging babi (sebagai kontrol
positif) dan sampel olahan makanan (sosis dan bakso). Daging babi dan sampel masing-
masing di timbang sebanyak 30mg dengan menggunkan timbangan analitik. Kemudian
sampel dan daging di gerus atau di haluskan dengan menggunakan mortar steril. Setelah halus
daging babi dan sampel di masukkan dalam tabung ependorf 1,5 ml. Sebanyak 500µl larutan
buffer TEM yang berfungsi untuk memperoleh DNA yang di isolasi dari sampel. Proses
penggerusan tersebut merupahan tahap pertama dalam proses isolasi DNA dimana sampel di
lisiskan selnya terlebih dahulu secara fisik.
Kemudian sebanyak 20µl larutan proteinase K di tambahkan ke dalam sampel yang
berfungsi untuk menutus atau memotong ikatan peptida. Sebanyak 50µl larutan SDS 10%
juga di tambahkan ke dalam sampel yang berfungsi untuk melisiskan membran pada daging
babi dan sampel. Suspensi kemudian di homogenkan dengan shiking water bath pada suhu
55oC selama 2 jam. Setelah proses inkubasi berlangsung kemudian sebanyak 50µl larutan
NaCl di tambahkan ke dalam tabung yang berfungsi untuk menggabungkan pellet kembali
dengan larutan yang telah ditambahkan (Istanti,annie.1990) , 400 phenol yang berfungsi untuk
mendenaturasi protein dan 400 cloroform yang berfungsi untuk mengekstrak dan
mengendapkan komponen polisakarida didalam buffer ekstraksi yang mengkontaminasi
larutan. Setelah semua larutan dimasukkan dalam tube di putar pelan-pelan pada suhu ruang
selama 1,5 jam yang berfungsi supaya larutan tercampur sempurna.
Setelah proses inkubasi berlangsung kemudian tube disentrifuge dengan kecepatan 3000
rpm selama 5 menit yang bertujuan untuk memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal, sehingga substansi yang lebih berat akan
berada didasar tabung. Supernatan yang terbentuk dipindah ke tabung baru lalu sebanyak 50µl
NaCl dan 1 ml etanol absolute yang bertujuan untuk mmepermudah terjadinya presipitasi pada
DNA yang bersifat transparan agar dapat di amati pada benang-benang DNA yang
ditambahkan kedalam tube. Kemudian larutan dihomogenkan menggunakan tangan dan
inkubasi selama satu malam. Setelah proses inkubasi selesai dilakukan larutan disentrifuge
dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit kemudian supernatant dibuang. Pellet yang
tebentuk dari proses sentrifugasi sebelumnya kemudian ditambah sebanyak 1 ml larutan
etanol 70% yang berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif
dan DNA bermuatan negatif. Setelah penambahan larutan etanol