EFEK SITOTOKSIK DAN EKSPRESI GEN p53 & Bcl-2 EKSTRAK DAN

FRAKSI DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis) TERHADAP

SEL KANKER PAYUDARA T47D

PROPOSAL TESIS
Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat mencapai
Derajat sarjana Strata-2
Program Pascasarjana Ilmu Farmasi
Minat Farmasi Sains

HALAMAN JUDUL

Diajukan oleh:

Priscila Wahyu Christiana

SBF 141810199

Kepada
PROGRAM STUDI S-2 ILMU FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA
Juni 2019
 PENGESAHAN
PROPSAL PENELITIAN

ii
 DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL................................................................................................ i
PENGESAHAN PROPSAL PENELITIAN ........................................................... ii
DAFTAR ISI .......................................................................................................... iii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. vi
DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii
BAB I PENDAHULUAN .................................................................................. 1
A. Latar Belakang Masalah .................................................................. 1
B. Perumusan Masalah ......................................................................... 4
C. Tujuan Penelitian ............................................................................. 4
D. Kegunaan Penelitian ........................................................................ 4
E. Keaslian Penelitian .......................................................................... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 7
A. Tinjauan Tanaman Rosemary .......................................................... 7
1. Sistematika Tanaman Rosemary .............................................. 7
2. Kandungan Kimia..................................................................... 7
3. Aktivitas Farmakologi .............................................................. 7
B. Tinjauan Kanker Payudara .............................................................. 9
1. Pengertian kanker payudara ..................................................... 9
2. Epidemiologi Kanker Payudara................................................ 9
2.1. Distribusi dan Frekuensi Kanker Payudara Berdasarkan
Orang............................................................................... 9
2.2. Distribusi dan Frekuensi Kanker Payudara Berdasarkan
Tempat dan Waktu. ....................................................... 10
3. Faktor Risiko Kanker Payudara ............................................. 10
3.1 Faktor Usia. ................................................................... 10
3.2 Faktor Usia. ................................................................... 11
3.3 Menopause Usia Lanjut. ............................................... 11
3.4 Riwayat Adanya Penyakit Tumor Jinak. ...................... 11
4. Tanda dan Gejala Kanker Payudara ....................................... 11
5. Stadium kanker payudara ....................................................... 12
6. Penatalaksanaan Medis yang Tepat ........................................ 14
6.1 Operasi (Pembedahan). ................................................. 14
6.2 Radioterapi. ................................................................... 15
6.3 Kemoterapi. ................................................................... 15
6.4 Terapi Hormon. ............................................................. 15
7. Sel T47D................................................................................. 15
C. Sel Vero ......................................................................................... 16
D. Gen p53 ......................................................................................... 17
E. Gen Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) .................................................... 17
F. Uji Sitotoksisitas............................................................................ 18
1. Tinjauan uji sitotoksisitas ....................................................... 18
1.1 Perhitungan secara langsung (metode haemocytometer).
....................................................................................... 19
1.2 Metode MTT assay. ...................................................... 19

iii
 G. Uji indeks Selektivitas ................................................................... 21
H. Ekstraksi ........................................................................................ 21
1. Pengertian ............................................................................... 21
2. Ekstrak .................................................................................... 21
3. Maserasi.................................................................................. 21
4. Fraksinasi................................................................................ 22
I. Imunositokimia .............................................................................. 22
J. Landasan Teori .............................................................................. 23
K. Hipotesis ........................................................................................ 24
L. Kerangka Pikir ............................................................................... 25
BAB III METODE PENELITIAN ..................................................................... 26
A. Populasi dan Sampel...................................................................... 26
B. Variabel Penelitian ........................................................................ 26
1. Identifikasi variabel utama ..................................................... 26
2. Klasifikasi variabel utama ...................................................... 26
3. Definisi operasional variabel utama ....................................... 26
C. Alat dan Bahan .............................................................................. 27
D. Jalannya Penelitian ........................................................................ 28
1. Determinasi Tanaman............................................................. 28
2. Pengambilan Sampel .............................................................. 28
3. Pembuatan Serbuk daun rosemary ......................................... 28
4. Identifikasi organoleptis serbuk daun rosemary ..................... 28
5. Standarisasi ekstrak ................................................................ 28
5.1 Penetapan susut pengeringan. ....................................... 28
5.2 Penetapan kadar air. ...................................................... 29
5.3 Penentuan bobot jenis. .................................................. 29
6. Pembuatan ekstrak dan fraksi daun rosemary ........................ 29
7. Identifikasi Kandungan Ekstrak Rosemary ............................ 31
7.1. Identifikasi alkaloid. ..................................................... 31
7.2. Flavonoid. ..................................................................... 31
7.3. Identifikasi fenol. .......................................................... 31
7.4. Identifikasi saponin. ...................................................... 31
7.5. Identifikasi tannin. ........................................................ 31
7.6. Identifikasi terpenoid. ................................................... 32
8. Identifikasi Kandungan Ekstrak daun rosemary dengan KLT 32
8.1 Uji terpenoid. ................................................................ 32
8.2 Uji alkaloid.................................................................... 32
8.3 Uji flavonoid. ................................................................ 32
9. Pembuatan Medium Kultur. ................................................... 33
10. Panen sel ................................................................................. 33
11. Pembuatan larutan uji. ............................................................ 33
12. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT ...................... 34
13. Uji selektivas .......................................................................... 34
14. Uji Ekspresi p53 dan Bcl-2 dengan metode imunositokimia . 35
E. Analisa Data .................................................................................. 35
1. Analisis nilai IC50 ................................................................... 35

iv
 F. Jadwal Penelitian ........................................................................... 38
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 39

v
 DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Reaksi yang terjadi pada MTT assay (Riss et al., )2013) .................... 20
Gambar 2. Kerangka pikir penelitian .................................................................... 25
Gambar 3. Skema pembuatan ekstrak dan fraksi .................................................. 30
Gambar 4. Jalannya Penelitian .............................................................................. 37

vi
 DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Klasifikasi Kanker Payudara Berdasarkan Sistem TNM (UICC/AJCC) 13
Tabel 2. Jadwal pelaksanaan kegiatan ................................................................. 38

vii
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Kanker adalah penyebab kematian nomor dua di dunia, dan bertanggung
jawab atas 9,6 juta kematian pada tahun 2018. Secara global, sekitar 1 dari 6
kematian disebabkan oleh kanker. Kanker adalah pertumbuhan cepat sel-sel
abnormal dalam tubuh yang dapat menyebabkan penyakit, dapat menyerang
jaringan di sekitarnya hingga organ yang lain. Kanker merupakan jaringan tumor
destruktif yang menyerang jaringan sehat atau ketika sel-sel tumor metastasis di
organ lain. Metastasis adalah penyebab utama kematian akibat kanker. Terapi
yang dapat dilakukan yaitu memperlambat pertumbuhan tumor dan
memperpanjang hidup pasien atau meningkatkan kualitas hidup (American
Cancer Society, 2016).
Kanker payudara adalah kanker yang paling sering menyerang wanita.
Keganasan menyumbang sekitar 1 dari 10 kanker di dunia dan didiagnosis pada
satu juta wanita setiap tahun (Sasco AJ, 2003). Kanker payudara adalah penyebab
kematian kanker yang paling sering kedua pada wanita, setelah kanker paru-paru,
dan penyebab utama kematian akibat kanker pada mereka yang berusia 20-59
tahun di Amerika (Jemal A, 2008).
Banyak obat kanker yang menimbulkan efek samping dan resisten.
Sampai sekarang belum ada obat kanker yang aman dan efektif, sehingga perlu
dikembangkan obat baru dengan efek terapi yang baik (Heti, 2008). Salah satu
upaya alternatif pengobatan kanker adalah pemanfaatan dari bahan alam yang
potensi potensial untuk dikembangkan sebagai pengobatan kanker payudara.
Sel T47D merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan
tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continous cell line sering
dipakai dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penangannya,
memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi serta
mudah diganti dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi (Burdall et al., 2003).
Sel T47D memiliki morfologi seperti sel epitel. Sel ini dikulturkan dalam media

1
 2

DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin, diinkubasi dalam CO2 inkubator 5%

dan suhu 370C (Abcam, 2007). Sel kanker payudara T47D mengekspresikan
protein p53 yang termutasi. Misssence mutation terjadi pada residu 194 (dalam
zinc-binding domain, L2), sehingga p53 tidak dapat berikatan dengan response
elemen pada DNA. Hal ini mengakibatkan berkurang bahkan hilangnya
kemampuan p53 untuk regulasi siklus sel.
Gen Bcl-2 dan p53 keduanya dikaitkan dengan kematian sel secara
apoptosis. Bcl-2 dapat menghambat apoptosis. Pola penyimpangan ekspresi Bcl-2
telah ditemukan pada berbagai kanker manusia dan telah terbukti mengubah
resistensi obat pada kanker. Protein Bcl-2 mengatur dan memediasi proses di
mana mitokondria berkontribusi pada kematian sel yang dikenal sebagai jalur
apoptosis intrinsik. Jalur ini diperlukan untuk perkembangan embrio normal dan
untuk mencegah kanker. Di sisi lain, p53 berfungsi sebagai penekan tumor dengan
menghentikan siklus sel pada fase G1 dan dengan memicu apoptosis. Ekspresi
p53 yang berlebihan menginduksi apoptosis pada tumor kolon manusia dan sel
leukemia. Sebaliknya, ketiadaan p53 fungsional dikaitkan dengan
ketidakmampuan sel untuk menjalani apoptosis yang mengarah pada
pengembangan berbagai keganasan (Michael J, et al, 2015).
Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) adalah daun dari keluarga
Lamiaceae yang sebagian besar terdistribusikan di daerah Mediterania. Polifenol
utama yang ditemukan dalam ekstrak rosemary termasuk asam diterpenes
carnosic dan asam rosmarin (Peng chu et al, 2007). Dalam beberapa penelitian,
asam carnosic ditemukan menjadi senyawa yang paling efektif dalam kaitannya
dengan aktivitas antikanker (Einbond et al, 2012). Kandungan dalam asam fenolik
rosemary adalah diterpenes carnosic, carnosol, dan methyl carnosate, serta asam
fenolik rosmarinic dan asam caffeic (Celiktas Y, 2010).
Uji MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazolium
bromide) didasarkan pada konversi MTT menjadi kristal formazan oleh sel-sel
hidup, yang menentukan aktivitas mitokondria. Prinsip uji MTT adalah bahwa
untuk sebagian besar sel aktivitas mitokondria konstan, dan dengan demikian
peningkatan atau penurunan jumlah sel yang hidup terkait secara linier dengan
 3

aktivitas mitokondria. Aktivitas mitokondria sel direfleksikan oleh konversi

garam tetrazolium MTT menjadi kristal formazan, yang dapat dilarutkan untuk
pengukuran yang homogen. Dengan demikian, setiap kenaikan atau penurunan
jumlah sel yang layak dapat dideteksi dengan mengukur konsentrasi formazan
yang tercermin dalam kepadatan optik (OD) menggunakan pembaca plat pada 540
dan 720 nm.
Daun rosemary yang diekstraksi menggunakan metanol menggandung
berbagai senyawa kimia antara lain asam betulinat, asam oleanolat, dan asam
ursolat, yang mempunyai khasiat sebagau antikanker. Ekstrak metanol daun
rosemary telah ditemukan uuntuk menghambat proliferasi sel kanker seperti
kanker paru-paru dengan nilai IC50 sebesar 24,08 µg/mL. Efek sitotoksik ekstrak
metanol rosemary pada sel kanker payudara T47D menunjukkan nilai IC 50 13,95
µg/mL dan mampu menginduksi apoptosis 19,68%. Asam betulinat pada sel
kanker seviks HeLa juga memiliki aktivitas antiproliferatid sel dengan nilai IC50
sebesar 30,43 µM dan mampu menginduksi apoptosis (Xu et al, 2014).
Pada penelitian sebelumnya, pemberian ekstrak metanol daun rosemary
terhadap model sel kanker payudara T47D yang dapat mengekspresikan Erα.
Pengujian yang dilakukan untuk melihat viabilitas sel yaitu dengan metode 3-
[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT).
Kemampuan apoptosis sel ekstrak rosemary diuji dengan metode Annexin V
Fluos dan ekspresi Erα sel T47D dengan uji imunositokimia. Hasil penelitian
menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 13,95 µg/ml (Anggraeni, 2015).
Penelitian yang lain yaitu pemberian ekstrak metanol rosemary terhadap
sel kanker serviks HeLa. Metode yang digunakan adalah MTT assay dan uji
imunositokimia untuk melihat ekspresi gen Bcl-2. Hasil uji viabilitas sel
menunjukkan ekstrak metanol rosemary memiliki nilai IC50 sebesar 320 µg/mL
dan menginduksi apoptosis sebesar 27%.
Berdasarkan penelitian diatas dapat disimpulkan bahwa belum dilakukan
uji aktivitas sitotoksik dan ekspresi protein Bcl-2 dan p53 ekstrak dan fraksi daun
rosemary terhadap kultur sel kanker T47D. Oleh karena itu perlu dilakukan
 4

penelitian lebih lanjut tentang tentang aktivitas sitotoksik dan ekspresi protein
Bcl-2 dan P53 ekstrak daun rosemary terhadap kultur sel kanker T47D.

B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dijelaskan, permasalahan yang
diteliti dalam penelitian ini adalah :
1. Apakah ekstrak dan fraksi daun Rosemary (Rosmarinus officinalis) memiliki
aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker T47D dan berapa nilai IC50nya?
2. Fraksi manakah yang lebih baik, dan termasuk golongan apa senyawa
aktifnya?
3. Bagaimana indeks selektivitas terhadap sel Vero?
4. Apakah senyawa kimia ekstrak dan fraksi rosemary (Rosmarinus Officinalis)
dapat mempengaruhi ekspresi gen Bcl-2 dan p53?

C. Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui apakah ekstrak dan fraksi daun Rosemary (Rosmarinus
officinalis) memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker T47D dan nilai
IC50.
2. Untuk mengetauhi fraksi manakah yang lebih baik, dan golongan senyawa
aktifnya.
3. Untuk mengetahui selektivitas terhadap sel Vero.
4. Untuk mengetahui pengaruh senyawa kimia ekstrak dan fraksi rosemary
(Rosmarinus Officinalis) terhadap ekspresi gen Bcl-2 dan p53.

D. Kegunaan Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan memberikan tambahan data ilmiah
sebagai sumber acuan pemanfaatan daun Rosemary (Rosmarinus officinalis) baik
untuk penelitian lebih lanjut maupun dalam pengobatan tradisional guna
pengobatan alternatif kanker payudara.
 5

E. Keaslian Penelitian
Penelitian ini sepanjang penelusuran pustaka belum pernah dilakukan
sebelumnya. Penelitian serupa yang telah dilakukan oleh Anggraeni (2015)
ekstrak rosemary menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 13,95 µL/mL dan
dapat menginduksi apoptosis 19,68%, nekrosis 77,33%, dan dapat menekan
ekspresi ERα 91-93% pada sel T47D.
Penelitian yang lain, dilakukan oleh Lela (2017) ekstrak metanol
rosemary menunjukkan efek sitotosik lemah dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL,
dan jalur kematian sel pada konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak
metanol daun rosemary dapat menginduksi apopotosis sebesar 27% pada uji
flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam. Hasil uji imunositokimia daun
rosemary dapat menekan kuat ekspresi protein Bcl-2 pada konsetrasi ½ IC50 pada
sel kanker serviks.
Penelitian yang dilakukan oleh Margaritha (2014) rosemary diekstraksi
dengan supercritical fluid extraction. Sel kanker yang di gunakan salah satunya
adalah T47D. Viabilitas sel diuji dengan metode MTT assay menggunakan 24-
well plate. Hasil didapatkan nilai IC50 80µg/mL. Efek penghambatan obat
antitumor yang saat ini digunakan dalam terapi kanker payudara terhadap
viabilitas sel tumor dinilai dengan uji MTT dan dibandingkan dengan efek obat
yang dikombinasikan dengan SFRE. Setiap molekul kemoterapi diuji dalam
subtipe tumor di mana ia diterapkan dalam pengaturan klinis. Hasil menunjukkan
bahwa setiap kombinasi yang diuji menghambat viabilitas sel tumor ke tingkat
yang secara signifikan lebih tinggi daripada obat kemoterapi saja.
Penelitian (Celiktas et al, 2010) menggunakan ekstrak metanolik dan
superkritis rosemary dipanen dari tiga lokasi yang berbeda di Tukey. Selanjutnya,
enam ekstrak dan senyawa aktif, asam carnosic, dan asam rosmarinic
diaplikasikan pada berbagai lini sel kanker manusia termasuk NCI-H82 (manusia,
paru-paru sel kecil, karsinoma), DU-145 (manusia, prostat, karsinoma), Hep- 3B
(manusia, hitam, hati, karsinoma, hepatoseluler), K-562 (leukemia myeloid kronis
manusia), MCF-7 (manusia, payudara, adenokarsinoma), PC-3 (manusia, prostat,
adenokarsinoma) dan MDA-MB-231 (Manusia, payudara, adenokarsinoma)
 6

dengan uji MTT. Hasil menunjukkan ekstrak CO2 superkritis memiliki efek
antiproliferatif yang unggul dibandingkan dengan ekstrak soxhlet. Meskipun
ekstrak menunjukkan berbagai efek sitotoksik terhadap garis sel yang berbeda,
nilai IC50 yang relatif rendah berkisar antara 12,50 dan 47,55 μg / ml dicapai
terhadap K-562, menjadi garis sel yang paling sensitif. Selain itu, asam carnosic
menyebabkan viabilitas sel terendah dengan nilai berkisar antara 13 hingga 30%
pada konsentrasi 19μM setelah 48 jam perawatan, menghasilkan efek
antiproliferatif yang unggul.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Tinjauan Tanaman Rosemary

1. Sistematika Tanaman Rosemary
Daun Rosmarinus Officinalis L. adalah famili dari Lamiaceae dan berasal
dari Mediterania. Klasifikasi rosemary adalah sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Superdivision : Spermatophyta
Division : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Subclass : Asteridae
Order : Lamiales
Family : Lamiaceae
Genus : Rosmarinus L.
Species : officinalis
Binominal name : Rosmarinus officinalis (BPOM RI, 2008).
Nama lain : Rosmarin (Jawa), Rosemary (Inggris), Romemary
(India), Rusmari (Tamil)
2. Kandungan Kimia
Senyawa kimia aktif dari rosemary (Rosmarinus Officinale) yaitu asam
rosmarinat, asam kafeat, asam klorogenat, asam karnosolat, rosmanol, carnosol,
rosmariquinonel dan banyak antioksidan alami lainnya, asam ursolat, asam
glukosat dan alkaloid rosmarisin. Minyak rosemary mengandung ester (2-6%)
sebagian besar sebagai borneol, cineoles dan beberapa terpene, terutama a-pinene
dan camphene. Di antara senyawa-senyawa ini, CA dan RA menjadi fokus
perhatian para peneliti sebagai agen terapi potensial (Curvelier et al, 1994)
3. Aktivitas Farmakologi
Rosemary memiliki banyak aktivitas farmakologi yang telah di uji pada
hewan uji. Pemberian minyak rosemary melalui inhalasi maupun melalui rute oral

7
 8

dapat merangsang SSP, aktivitas pernapasan dan alat gerak pada tikus. Ekstrak
alkohol dari R. Officinalis menunjukkan aktivitas antidepresan pada model uji
imobilitas yang diinduksi berenang paksa pada tikus (Matsunaga K, 1997).
Rosemary telah digunakan secara empiris sebagai agen koleretik dan
hepatoprotektif dalam pengobatan tradisional. Efek ini dibuktikan secara
eksperimental dengan menggunakan etanol terliofilisasi dan ekstrak air kecambah
muda R. officinalis yang telah menunjukkan aktivitas koleretik dan memberikan
perlindungan terhadap karbon tetraklorida yang diinduksi hepatotoksisitas pada
tikus. Hasil terbukti dengan peningkatan yang signifikan dalam aliran empedu dan
pengurangan yang signifikan dalam enzim hati plasma ketika ekstrak diberikan
sebagai pretreatment sebelum karbon tetraklorida, tetapi tidak ada perlindungan
ketika ekstrak diberikan setelah itu. Telah ditunjukkan bahwa ekstrak air
kecambah muda R. officinalis memiliki aktivitas antilipoperoksidan, karena
mengurangi pembentukan malonaldehida secara signifikan, dalam mannej yang
tergantung pada dosis dan secara signifikan menurunkan pelepasan lactico
dehydrogenase (LDH) dan aspartate aminotransferase. (ASA T), dengan demikian
mengkonfirmasi tindakan antihepatotoksik dari R.officinalis (Joyeux et al, 1990).
Ekstrak daun Rosemary officinalis L. banyak digunakan sebagai
antioksidan dalam industri makanan dan terbukti aman dengan tidak
menghasilkan toksisitas akut pada hewan percobaan (Loliger, 1898). Potensi
ekstrak rosemary untuk menghambat tumorigenesis mammae yang diinduksi
secara kimiawi pada tikus betina dan untuk mencegah pembentukan adisi
karsinogen-DNA dalam sel epitel mamalia telah diselidiki. Suplemen makanan
dengan 1% (b / b) ekstrak rosemary pada tikus yang diinduksi dengan 7, 12-
dimethylbenz (a) antrasena (DMBA) secara signifikan menurunkan tumorigenesis
payudara sebesar 47% dan menghambat total pengikatan in vivo dari DMBA ke
DNA sel epitel mamalia oleh rata-rata 42%, menunjukkan bahwa penggunaan
ekstrak rosemary dan konstituen antioksidan individu sebagai agen kemopreventiv
untuk tumorigenesis memerlukan penyelidikan lebih lanjut (Singletary et al,
1991).
 9

B. Tinjauan Kanker Payudara

1. Pengertian kanker payudara
Kanker adalah penyakit yang berkaitan dengan pertumbuhan cepat sel-sel
abnormal dalam tubuh dan dapat menyerang jaringan di sekitarnya yang sehat dan
menyebar ke organ lain. Kanker adalah faktor penting dalam beban penyakit
global. Perkiraan jumlah kasus baru setiap tahun diperkirakan akan meningkat
dari 10 juta pada tahun 2002 menjadi 15 juta pada tahun 2025, dengan 60% dari
kasus tersebut terjadi di negara-negara berkembang.
Kanker payudara tetap merupakan penyakit umum dan sering fatal, kanker
yang paling sering didiagnosis pada wanita. Lebih dari 1,2 juta wanita didiagnosis
menderita kanker payudara setiap tahun di seluruh dunia.
Meskipun etiologi kanker payudara tidak diketahui, banyak faktor risiko
dapat mempengaruhi perkembangan penyakit ini termasuk faktor genetik,
hormonal, lingkungan, sosiobiologis dan fisiologis. Selama beberapa dekade
terakhir, sementara risiko kanker payudara telah meningkat di negara industri dan
berkembang sebesar 1% –2% per tahun, tingkat kematian akibat kanker payudara
telah sedikit menurun.
Kanker payudara memperlihatkan proliferasi keganasan sel epitel yang
membatasi duktus dan lobus payudara. Sel-sel ini kemudian berlanjut menjadi
karsinoma in situ dan menginvasi stroma. Kanker membutuhkan waktu 7 tahun
untuk tumbuh dari satu sel menjadi massa yang cukup besar untuk dapat di
palpasi (kira-kira berdiameter 1 cm). Pada ukuran itu, sekitar 25% kanker
payudara sudah mengalami metastatis (Prince & Wilson, 2003).
Kanker Payudara dapat muncul akibat akumulasi kerusakan genetik.
Beberapa gen bertanggung jawab terhadap sebagian besar kanker payudara
herediter, tapi banyak gen predisposisi bertanggung jawab terhadap kasus
sporadik. Mutasi yang terjadi pada gen predisposisi seperti p53, BRCA1 dan
BCRA2 yang cenderung bertindak melalui perbaikan DNA memperngaruhi
kestabilan gen.
2. Epidemiologi Kanker Payudara
2.1. Distribusi dan Frekuensi Kanker Payudara Berdasarkan Orang.
Kanker payudara merupakan kanker yang paling banyak terjadi pada perempuan.
 10

Diperkirakan jumlah kasus baru tidak kurang dari 1.050.346 per tahun. Kanker
payudara sering terjadi pada wanita di atas usia 40-50 tahun (Rasjidi, Imam,
2010). Hal ini, didukung oleh penelitian Winda (2015) yang mengutip penelitian
May Laura Situmorang yang mengatakan bahwa penderita kanker payudara
terbanyak pada usia > 40 tahun (Rahmadani & Winda, 2015). Umur merupakan
faktor yang penting dalam menentukan prevalensi kanker payudara. Worldwide
cancer melaporkan di Inggris antara tahun 2009 dan 2011, sekitar 80% dari kasus
kanker payudara didiagnosis pada perempuan berusia > 50 tahun, dan sekitar
seperempat (24%) didiagnosis pada perempuan berusia 75 dan lebih (American
Cancer Society, 2011). Sedangkan berdasarkan jenis kelamin. Kanker payudara
juga dapat terjadi pada laki-laki, walaupun kemungkinan laki-laki itu sangat kecil
sekali yaitu 1 : 1000 (Mulyani & Nuryani, 2013). Berdasarkan penelitian Winda
(2015) yang mengutip penelitian Yenti L. Gaol (2010) bahwa di RS Dr. Pirngadi
Medan, proporsi kanker payudara pada laki-laki adalah 2% dari 148 kasus
(Rahmadani & Winda, 2015).
2.2. Distribusi dan Frekuensi Kanker Payudara Berdasarkan Tempat
dan Waktu. Kanker payudara merupakan jenis kanker yang menduduki peringkat
pertama. Gambaran umum prevalensi kanker payudara di dunia dapat
digambarkan sebagai berikut (Bustan, 2007):
Secara umum kanker payudara lebih banyak ditemukan dinegara maju
dibandingkan negara sedang berkembang. Hal ini terutama dikaitkan dengan
tingkat sosial dan gaya hidup masyarakat di masing- masing negara yang berbeda.
Satu dianatara 10 wanita Amerika terserang kanker payudara.
Urutan kedudukan kanker payudara dibandingkan dengan jenis kanker
lainnya bervariasi antar negara di dunia, juga bervariasi urutan dikalangan negara-
negara Asia.
3. Faktor Risiko Kanker Payudara
3.1 Faktor Usia. Semakin tua usia seorang wanita, maka risiko untuk
menderita kanker payudara akan semakin tinggi. Pada usia 40-64 tahun adalah
kategori usia paling berisiko terkena kanker payudara, terutama bagi mereka yang
 11

mengalami menopause terlambat yaitu setelah umur 55 tahun (Mulyani &

Nuryani, 2013). Berdasarkan penelitian (Pulungan, 2010) yang mengutip
penelitian Azamris tahun 2006 mengatakan bahwa di RS M. Djamil Padang
dengan desain case control diperkirakan risiko kelompok usia ≥40 tahun terkena
kanker payudara 1,35 kali lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok wanita
usia < 40 tahun (OR = 1,35) (Pulungan, 2010).
3.2 Faktor Usia. Semakin tua usia seorang wanita, maka risiko untuk
menderita kanker payudara akan semakin tinggi. Pada usia 40-64 tahun adalah
kategori usia paling berisiko terkena kanker payudara, terutama bagi mereka yang
mengalami menopause terlambat yaitu setelah umur 55 tahun (Mulyani &
Nuryani, 2013). Berdasarkan penelitian Pulungan, R.M (2010) yang mengutip
penelitian Azamris tahun 2006 mengatakan bahwa di RS M. Djamil Padang
dengan desain case control diperkirakan risiko kelompok usia ≥40 tahun terkena
kanker payudara 1,35 kali lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok wanita
usia < 40 tahun (OR = 1,35) (Pulungan, 2010).
3.3 Menopause Usia Lanjut. Hasil penelitian Pulungan R.M (2010)
Menopause setelah usia 55 tahun meningkatkan risiko untuk mengalami kanker
payudara. Kurang dari 25% kanker payudara terjadi pada masa sebelum
menopause sehingga diperkirakan awal terjadinya tumor terjadi jauh sebelum
terjadinya perubahan klinis. (Pulungan, 2010).
3.4 Riwayat Adanya Penyakit Tumor Jinak. Beberapa tumor jinak
pada payudara dapat bermutasi menjadi ganas, seperti atipikal duktal hyperplasia
(Rasjidi et al, 2009). Wanita dengan hyperplasia atipikal mempunyai risiko 5,0
kali lebih besar untuk terkena kanker payudara (RR = 5,0) dan yang hyperplasia
tipikal mempunyai risiko 4,0 kali lebih besar untuk terkena kanker payudara (RR
= 4,0) (Briston, 2008).
4. Tanda dan Gejala Kanker Payudara
Gejala dan pertumbuhan kanker payudara tidak mudah dideteksi karena
awal pertumbuhan sel kanker payudara tidak dapat diketahui dengan gejala
 12

umumnya baru diketahui setelah stadium kanker berkembang agak lanjut, karena
pada tahap dini biasanya tidak menimbukan keluhan. Penderita merasa sehat,
tidak merasa nyeri, dan tidak mengganggu aktivitas. Benjolan tanpa rasa sakit
adalah tanda awal kanker payudara pada sebagian besar wanita. Gumpalan ganas
yang khas adalah soliter, unilateral, padat, keras, tidak teratur, dan tidak bergerak.
Perubahan puting jarang terlihat. Kasus yang lebih lanjut hadir dengan edema
kulit yang menonjol, kemerahan, kehangatan, dan indurasi.
Tanda yang mungkin muncul pada stadium dini adalah teraba benjolan
kecil di payudara yang tidak terasa nyeri. Sedangkan, gejala yang timbul saat
penyakit memasuki stadium lanjut semakin banyak, seperti : timbulnya benjolan
yang semakin lama makin mengeras dengan bentuk yang tidak beraturan, saat
benjolan membesar baru terasa nyeri dan terlihat puting susu tertarik ke dalam
yang tadinya berwarna merah muda berubah menjadi kecoklatan, serta keluar
darah, nanah, atau cairan encer dari puting susu pada wanita yang tidak hamil
dengan kulit payudara mengerut seperti kulit jeruk.
5. Stadium kanker payudara
Stadium penyakit kanker adalah suatu keadaan dari hasil penilaian dokter
saat mendiagnosis suatu penyakit kanker yang diderita pasiennya, sudah sejauh
manakah tingkat penyebaran kanker tersebut baik ke organ atau jaringan sekitar
maupun penyebaran ketempat lain. Stadium hanya dikenal pada tumor ganas atau
kanker dan tidak ada pada tumor jinak. Untuk menentukan suatu stadium, harus
dilakukan pemeriksaan klinis dan ditunjang dengan pemeriksaan penunjang
lainnya yaitu histopatologi atau PA, rontgen, USG, dan bila memungkinkan
dengan CT scan, scintigrafi, dll.
Tahap penyakit didasarkan pada luas dan ukuran tumor primer (T1-4), ada
dan luasnya keterlibatan kelenjar getah bening (N1-3), dan ada atau tidak adanya
metastasis jauh (M0-1). Sistem pementasan menentukan prognosis dan membantu
keputusan pengobatan. Secara sederhana, tahapan ini dapat direpresentasikan
sebagai berikut:
 13

Tabel 1. Klasifikasi Kanker Payudara Berdasarkan Sistem TNM (UICC/AJCC)

Stadium T N M
0 Tis N0 M0
I T1 N0 M0
IIA T0 N1 M0
T1 N1 M0
T2 N0 M0
IIB T2 N1 M0
T3 N0 M0
IIIA T0 N2 M0
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1-N2 M0
IIIB T4 N0 M0
T4 N1 M0
T4 N2 M0
IIIC Tiap T N3 M0
IV Tiap T Tiap N M1

Keterangan :
Tumor (T): T akan diikuti oleh angka 0-4. Ini untuk memberi tahu Anda seberapa
besar tumor yang terjadi. Contohnya, “T0: berarti tidak ada tumor yang bisa
diukur. Semakin tinggi angkanya, semakin besar tumornya.
Nodus (N): N akan diikuti oleh angka 0-3. Ini dimaksudkan untuk memberi tahu
Anda jika kanker telah menyebar ke kelenjar getah bening. Kelenjar ini
merupakan kelenjar yang melawan virus dan bakteri sebelum menginfeksi bagian
tubuh Anda. “N0” berarti kelenjar getah bening Anda tidak terlibat. Semakin
tinggi angkanya, maka semakin banyak penyebaran sel kanker di kelenjar getah
bening.
Metastasis (M): M diikuti oleh 0 atau 1. Jika kanker sudah menyebar ke organ
dan jaringan di bagian tubuh lainnya maka Anda akan diklasifikasikan sebagai
“M1”. Sedangkan jika belum ada penyebaran, kondisi kanker tersebut dinyatakan
“M0”.
Berdasarkan teknik tersebut maka, terdapat pembagian stadium klinik,
yaitu (Yustiana, O., 2013) :
Stadium I : Tumor dengan garis tengah <2 cm dan belum menyebar keluar
dari payudara
 14

Stadium IIA : Tumor dengan garis tengah 2-5 cm dan belum menyebar ke
kelenjar getah bening ketiak, atau tumor dengan garis tengah
<2 cm tetapi sudah menyebar ke kelenjar getah bening ketiak
Stadium IIB : Tumor dengan garis tengah lebih besar dari 5 cm dan belum
menyebar ke kelenjar getah bening ketiak atau tumor dengan
garis tengah 2-5 cm tetapi sudah menyebar ke kelenjar getah
bening ketiak
Stadum IIIA : Tumor dengan garis tengah <5 cm dan sudah menyebar ke
kelenjar getah bening ketiak disertai perlengketan satu sama
lain atau perlengketan ke struktur lainnya.
Stadium IIIB : Tumor telah menyusup keluar payudara yaitu ke dalam kulit
payudara atau ke dinding dada dan tulang dada
Stadium IV : Tumor telah menyebar keluar daerah payudara dan dinding
dada, misalnya ke hati, tulang, atau paru-paru. Kondisi dimana
ukuran tumor bisa berapa saja, tetapi telah menyebar ke lokasi
yang jauh, yaitu tulang, paruparu,liver atau tulang rusuk.
Ciri-ciri pada stadium IV, antara lain : Tumor seperti pada yang lain
(stadium I, II, dam III). Tetapi sudah disertai dengan kelenjar getah bening aksila
supra-klavikula dan metastasis jauh. Tindakan yng harus dilakukan adalah
pengangkatan payudara. Tujuan pengobatan pada stadium ini adalah paliatif
bukan lagi kuratif (menyembuhkan).
6. Penatalaksanaan Medis yang Tepat
Penatalaksanaan medis tergantung dari stadium kanker didiagnosis yaitu
dapat berupa operasi/pembedahan, radioterapi, kemoterapi, dan terapi hormonal
(Suyatno & Emir, 2010).
6.1 Operasi (Pembedahan). Operasi adalah terapi untuk membuang
tumor, memperbaiki komplikasi, dan merekonstruksi efek yang ada. Semakin dini
kanker payudara ditemukan kemungkinan sembuh dengan operasi semakin besar.
Jenis-jenis operasi yang dilakukan untuk mengobati kanker payudara, antara lain :
mastektomi (mengangkat seluruh payudara beserta kankernya), lumpektomi
(mengangkat sebagian payudara pada jaringan yang mengandung kanker), dan
 15

pengangkatan kelenjar getah bening (KGB) ketiak. Ada 2 indikasi melakukan

operasi pada penderita kanker, yaitu diagnostik untuk memperoleh data patologi
yang cepat tentang tumor apakah jinak atau ganas dan untuk memberi petunjuk
kepada ahli bedah menentukan sikap tindakan apa yang akan diambil dan
terapeutik untuk mengobati penderita kuratif dan paliatif.
6.2 Radioterapi. Radioterapi merupakan pengobatan dengan melakukan
penyinaran ke daerah yang terserang kanker, dengan tujuan untuk merusak sel-sel
kanker. Radioterapi untuk kanker payudara biasanya digunakan sebagai terapi
kuratif dengan mempertahankan mamma dan sebagai terapi paliatif (tambahan).
6.3 Kemoterapi. Kemoterapi adalah proses pemberian obat-obatan anti
kanker dalam bentuk pil cair, kapsul atau infus yang bertujuan untuk membunuh
sel kanker tidak hanya pada payudara tetapi juga seluruh tubuh. Efek dari
kemoterapi adalah pasien mengalami mual dan muntah serta rambut rontok karena
pengaruh obat-obatan yang diberikan saat kemoterapi. Kemoterapi biasanya
diberikan 1-2 minggu sesudah operasi. Kemoterapi merupakan pendekatan
sistematis untuk membunuh sel-sel kanker yang bertambah banyak (Tagliaferri,
M., et al 2002)
6.4 Terapi Hormon. Pemberian hormon dilakukan apabila penyakit telah
sistemik berupa metastasis jauh. Terapi hormonal biasanya diberikan secara
paliatif sebelum kemoterapi. Masing-masing sel mempunyai 2 jenis reseptor.
Reseptor hormon positif yaitu sel kanker yang mempunyai cukup banyak reseptor
hormon. Reseptor hormon negatif yaitu sel kanker yang mempuyai sedikit atau
tidak ada reseptor hormon. (Dewa & Gede, 2000)
7. Sel T47D
Sel T47D merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor
duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continous cell line sering
dipakai dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penangannya,
memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi serta
mudah diganti dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi (Burdall et al., 2003).
Sel T47D merupakan sel kanker yang mengekspresikan p53 yang telah termutasi
sehingga resisten terhadap mekanisme apoptosis (Junedi et al. 2010). Pada sel ini,
 16

p53 mengalami missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding domain
L2) sehingga p53 kehilangan fungsinya. Jika p53 tidak dapat mengikat response
element pada DNA, maka akan mengurangi atau menghilangkan kemampuannya
dalam meregulasi siklus sel dan memacu apoptosis. Sel ini dapat kehilangan ER
apabila kekurangan estrogen pada jangka waktu lama selama percobaan in vitro.
Oleh karena itu, sel ini digunakan pada model untuk penelitian resistensi obat
pada pasien dengan tumor payudara yang memiliki p53 termutasi (Abcam 2007).
Sel T47D adalah model sel kanker payudara yang belum resisten terhadap
agen kemoterapi doxorubicin, tetapi diketahui memiliki gen p53 yang telah
termutasi (Junedi et al., 2010). Gen p53 pada sel ini mengalami miss
ensemutation, sehingga kehilangan fungsinya. Jika p53 tidak dapat mengikat
responseelement pada DNA, maka akan mengurangi atau menghilangkan
kemampuannya dalam meregulasi siklus sel dan memacu apoptosis (Schafer et al.
2000).

C. Sel Vero
Merupakan model sel normal yang dalam uji sitotoksisitas antikanker
dapat digunakan sebagai subjek uji untuk mengamati selektifitas senyawa
antikanker tersebut. Vero cell line diambil dari ginjal African Green Monkey
dewasa pada 27 Maret 1967 oleh Y. Yasamura dan Y.Kawakita dari Universitas
Chiba, Jepang. Semula, sel Vero ditumbuhkan dalam media yang berisi 0,5%
laktalbumin hidrolisat, 0,1% ekstrak yeast dan 0,1% polivinil pirolidon dalam
98% Earle’s BSS dan 2% calf serum. Konsentrasi calf serum akhirnya dinaikkan
menjadi 5%. Kemudian sel dibawa ke laboratorium Virologi Nasional Amerika.
Mulai keturunan ke-97, sel Vero ditumbuhkan dalam 10% FBS (Fetal Bovine
Serum), media Morgan, Morton dan Parker, dan 95% MEM (Minimum Essensial
Med) dengan aa non-essensial dan Earle’s BSS dan 5% FBS (Rebecca, 2000). Sel
Vero digunakan secara luas pada studi replikasi virus dan uji penyakit pes. Selain
itu, juga digunakan untuk uji berbagai penyakit yang diakibatkan oleh virus. Sel
vero bersifat aneuploidi. Sel ini berasal dari Cercopithecus dan turunan dari Hep-
2, WI-38, dan MRC-58 (human cell strains). Dalam tes onkogenisitas yang
 17

dilakukan pada soft agar yang dilakukan oleh FDA (Petriccini et al., 1987), sel
vero dapat membentuk koloni pada soft agar dan tumor di kultur organ (Rebecca,
2000).

D. Gen p53
Gen protein p53 dikaitkan dengan kematian sel secara apoptosis.
Apoptosis merupakan kematian sel karena mekanisme pengaturan intraseluler sel
yang akan mati mengaktifkan enzim yang akan mendegradasi DNA nucleus sel
dan protein sitoplasma. Gen p53 yaitu gen pada kanker pertama yang
teridentifikasi. Protein p53 merupakan protein tumor suppressor yang berperan
sebagai regulator siklus sel. Pada kondisi normal, p53 berinteraksi dengan
berbagai jenis protein yang terlibat dalam regulasi transkripsi, repair DNA, siklus
sel, apoptosis, dan degradasi protein yang dimediasi oleh proteosom. Proses
apoptosis dapat terjadi kegagalan pada jalur, yang akan menyebabkan terjadinya
kanker. Kegagalan ini lebih sering terjadi pada jalur intrinsik dibandingkan jalur
ekstrinsik, karena jalur ekstrinsik ini lebih sensitif dan paling sering disebabkan
oleh mutasi dari gen p53. Mutasi tersebut dapat berupa degradasi p53, hilangnya
kemampuan p53 menginduksi cell cycle arrest atau apoptosis, dan hilangnya
afinitas p53 untuk mengikat DNA yang rusak.

E. Gen Bcl-2 (B-cell lymphoma-2)

Bcl-2 family pada bagian pro-apoptosis yaitu, Bax, Bak, Bad, Bcl-X5, Bid,
dan pada bagian anti-apoptosis yaitu, Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-W, Bfl-1 dan Mcl-1.
Pada anti-apoptosis Bcl-2 bekerja dengan menekan apoptosis dari blockade
pelepasan sitokrom-c, pada bagian pro-apoptosis bekerja sebagai promoter.
Terdapat 2 jalur apoptosis yaitu, jalur ekstrinsik (jalur sitoplasma) dan
jalur intrinsic (jalur mitokondria). Pada jalur ekstrinsik biasanya dipacu melalui
Fas death receptor, bagian dari tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily.
Sedangkan pada jalur intrinsic timbul adanya stimulasi yang memacu pelepasan
 18

sitokrom-c dari mitokondria dan alan mengaktivasi signal kematian sel.

Timbulnya sinyal kematian sel, maka protein pro-apoptosis akan melakukan
modifikasi posttranslation dan defosforilasi yang mengakibatkan pemecahan
aktivasinya dan pada translokasi mitokondria akan memacu apoptosis. Pada kedua
jalur ini saling berhubungan, pada jalur intrinsic Bcl-2 akan memacu hambatan
dari jalur ekstrisik, pada TNF-α dapat meningkatkan ekspresi NF-Kb dan
menstimulasi anti-apoptosis dari protein Bcl-2 family (Tamm dkk, 2001).

F. Uji Sitotoksisitas
1. Tinjauan uji sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur
sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetik, zat tambahan
makanan, pestisida dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas
antineoplastik dari suatu senyawa (Freshney, 1986). Senyawa sitotoksik adalah
senyawa yang bersifat toksik pada sel tumor secara in vitro dan jika toksisitas ini
ditransfer menembus sel tumor in vivo senyawa tersebut mempunyai aktivitas
antitumor (Evans, 2002). Metode in vitro memberikan berbagai keuntungan,
seperti: dapat digunakan pada langkah awal pengembangan obat, hanya
membutuhkan sejumlah kecil bahan yang digunakan untuk kultur sel primer
manusia dari berbagai organ target (ginjal, liver, kulit) serta dapat memberikan
informasi secara langsung efek potensial pada sel target manusia (Doyle and
Griffiths, 2000). Uji sitotoksik dilakukan dengan uji in vitro menggunakan kultur
sel, kultur sel berguna untuk mendeteksi adanya aktivitas antineoplasmatik dari
suatu senyawa. Dengan uji sitotoksik dapat ditemukan kandungan senyawa yang
berpotensi sebagai anti kanker. Uji ini merupakan uji kualitatif dengan cara
menetapkan kematian sel. Hasil dari uji sitotoksik dapat menunjukkan informasi
tentang konsentrasi obat yang masih memungkinkan sel mampu bertahan hidup
(Doyle et al., 2000).
Uji sitotoksik digunakan untuk menentukan parameter IC50. Nilai IC50
menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel 50%
 19

dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Semakin besar
harga IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik. Akhir dari uji sitotoksik
dapat memberikan informasi % sel yang mampu bertahan hidup, sedangkan pada
organ target memberikan informasi langsung tentang perubahan yang terjadi pada
fungsi sel secara spesifik (Meiyanto et al, 2003). Rentang nilai IC50 suatu senyawa
bila < 10 µg/mL sangat aktif, 10-20 µg/mL aktif, > 20 µg/mL dinyatakan kurang
aktif, namun nilai IC50 50-100 µg/mL tetap memiliki kompensiv terhadap sel
kanker (Freshney, 2000). Metode yang digunakan untuk menguji sitotoksisitas
menggunakan beberapa metode, diantara nya adalah :
1.1 Perhitungan secara langsung (metode haemocytometer).
Haemocytometer terdiri dari perangkat gelas bersama coverslip tipis, yang terbagi
dalam sembilan area dengan empat area pojok sebagai area menghitung jumlah
sel. Haemocytometer memiliki ketebalan chamber 0,1 mm dengan kapasitas 10 μl
cairan berisi sel dalam area 0,9 mm3 (Caprette, 2000). Dalam metode
haemocytometer ada hal yang perlu diperhatikan diantaranya, sel harus
tersuspensi rata dalam cairan untuk mencegah tumpang tindih sel, jumlah sel yang
minimum yang dihitung adalah seratus agar dapat dihitung secara statistik
(Caprette, 2000), sel yang melekat perlu ditripsinasi untuk mensuspensikan sel
dalam larutan. Untuk membedakan sel hidup dan sel mati digunakan triptan blue.
Perbedaan sel hidup tidak terwarnai, bulat dan relatif kecil sedangkan sel mati,
membengkak dan berwarna biru (Doyle et al.,2000).
1.2 Metode MTT assay. MTT assay merupakan salah satu metode
analisa kolorimetri (pewarnaan) menggunakan pewarna MTT dengan mengukur
konsentrasi warna (nilai absorbansi) produk akhir yang terbentuk menggunakan
spektrofotometri. Kelebihan metode ini yakni relatif cepat, sensitif, akurat,
digunakan untuk mengukur sampel dalam junlah besar dan hasilnya bisa untuk
memprediksi sifat sitotoksik suatu bahan (Doyle & Griffiths 2000).
Reaksi MTT merupakan reaksi reduksi selular yang didasarkan pada
pemecahan garam tetrazolium MTT berwarna kuning menjadi kristal formazan
berwarna biru keunguan (Basmal et al, 2009). Metode perubahan warna tersebut
digunakan untuk mendeteksi adanya proliferasi sel. Sel yang mengalami
 20

proliferasi, mitokondria akan menyerap MTT sehingga sel-sel tersebut akan

berwarna ungu akibatnya berbentuk kristal tetrazolium (formazan) (Depamede et
al, 2009).
Sel yang viable dengan sistem metabolisme yang aktif mengubah MTT
menjadi kristal formazan dengan absorbansi sekitar 570 nm seperti yang terlihat
pada gambar 1. Pengubahan MTT ke kristal formazan pada sel bersifat time
dependent (Riss et al., 2013). Sel yang masih hidup memiliki enzim
dehidrogenase mitokondria akan mengubah MTT yang berwarna kuning dan larut
air menjadi bentuk formazan berwarna biru tua yang tidak larut air (Doyle and
Griffiths, 1998). Metode ini merupakan metode kolorimetrik, dimana pereaksi
MTT ini merupakan garam tetrazolium yang dapat dipecah menjadi kristal
formazan oleh sistem suksinat tetrazolium reduktase yang terdapat dalam jalur
respirasi sel pada mitokondria yang aktif pada sel yang masih hidup. Kristal
formazan ini memberi warna ungu yang dapat dibaca absorbansinya dengan
menggunakan ELISA reader (Junedy, 2005).
Uji sitotoksik digunakan untuk menentukan parameter nilai IC50. Nilai
IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan proliferasi
sel sebesar 50% dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel.
Nilai ini merupakan patokan untuk melakukan uji pengamatan kinetika sel
(Meiyanto dkk , 2003). Keuntungan MTT assay yaitu absorbansinya dapat diukur
secara periodik selama inkubasi, akan tetapi plate yang berisi kultur sel harus
segera dikembalikan ke inkubator 37° C agar kondisinya tidak berubah (Riss et
al., 2013).

Gambar 1. Reaksi yang terjadi pada MTT assay (Riss et al., )2013)
 21

G. Uji indeks Selektivitas

Indeks selektivitas menunjukkan selektivitas suatu larutan uji terhadap sel.
Selektivitas ditentukan dengan menggunakan parameter SI (Selectivity Index)
dengan rumus :
IC50 sel vero
SI=
IC50 sel kanker T47D
Ekstrak dikatakan mempunyai selektivitas yang tinggi apabila nilai SI ≥ 3,
dan dikatakan kurang selektif apabila nilai SI< 3 (Rahmawati et al., 2016).

H. Ekstraksi
1. Pengertian
Esktraksi atau penyarian adalah perpindahan zat aktif yang semula berada
di sel ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam cairan hayati.
Metode ekstraksi dilakukan berdasarkan persamaan faktor sifat dari suatu bahan
mentah atau simplisia yang disesuaikan dengan metode ekstraksi yang digunakan
untuk memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna. Pemilihan
sistem perlarut yang digunakan dalam ekstraksi harus berdasarkan
kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang maksimal dari zat aktif dan
seminimal mungkin zat yang tidak diinginkan (Ansel 1989).
2. Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan cara mengekstraksi
senyawa aktif yang ada di simplisia nabati atau simplisia hewani. Penarikan
senyawa aktif ini menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir
semua pelarut diuapkan dan massa atau pelarut yang tersisa diberlakukan
sedemikian hingga memenuhi kriteria yang ditetapkan (Simanjuntak 2008).
3. Maserasi
Maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling mudah. Kecuali
dinyatakan lain, pembuatan maserasi dilakukan dengan dimasukkan 10 bagian
simplisian dengan derajat halus yang cocok ke dalam sebuah bejana kemudian
dituangi dengan 75 bagian cairan penyari, tutup dibiarkan selama 5 hari terlindung
 22

dari cahaya, sambil sering di aduk, serkai, peras, cuci ampas dengan cairan
penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana
tertutup, biarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian
endapan di saring (Depkes 1979). Keuntungannya adalah maserasi pengerjaan dan
peralatan yang digunakan sederhana.
4. Fraksinasi
Fraksinasi merupakan proses pemisahan golongan utama kandungan satu
dari golongan yang lain berdasarkan perbedaan kepolaran suatu senyawa. Pada
proses fraksinasi digunakan dua pelarut yang tidak tercampur dan memiliki
tingkat kepolaran yang berbeda. Senyawa yang bersifat polar akan larut dalam
pelarut polar, begitu pula senyawa-senyawa non polar akan terlarut dalam pelarut
non polar (Harborne 1987).
Fraksinasi ini umumnya dilakukan dengan menggunakan metode corong
pisah atau kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan salah satu
metode pemurnian senyawa dengan menggunakan kolom (Trifany 2012). Corong
pisah merupakan peralatan laboratorium yang digunakan untuk memisahkan
komponenkomponen dalam campuran antara dua fase pelarut yang memiliki
massa jenis berbeda yang tidak tercampur (Haznawati 2012).

I. Imunositokimia
Imunositokimia merupakan suatu metode yang digunakan untuk
mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spresifik atau antigen dalam sel dengan
menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen.
Terdapat dua jenis metode imunositokimia yaitu metode langsung dan metode
tidak langsung. Pada metode langsung, antibodiyang mengikat flourosen atau zat
warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak
langsung, antigen anti p53 dan anti Bcl-2 dikaitkan pada antibodi monoklonal anti
p53 dan antibodi monoklonal anti Bcl2 secara langsung, kemudian ditambahkan
antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfotase, atau
glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer.
 23

Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah oleh enzim

sehingga terjadi pembentukan warna (pigemen) yang akan mewarnai sel.

J. Landasan Teori
Kanker merupakan penyebab angka kematian nomor satu di dunia. Pada
tahun 2012, diperkirakan ada 14 juta kasus kanker baru tiap tahunnya. Berbagai
macam kanker sering terdiagnosis pada manusia, salah satunya adalah kanker
payudara. Kanker payudara sendiri menempati urutan kedua kanker yang biasa
terdiagnosis (1,7 juta, 11,9%) setelah kanker paru (1,8 juta, 13% dari kasus total)
(WHO, 2014). Hingga tahun 2012, angka kematian karena kanker payudara
berkisar 41% di China, 17% di Indonesia, dan 12% di Jepang (Youlden et al.,
2014).
Mutasi gen P53 dan Bcl-2 adalah pemicu terjadi sel kanker. Peningkatan
ekspresi yang disebabkan oleh mutasi dari gen Bcl-2 yang dapat menekan fungsi
normal dari protein proapoptosis. Jika terjadi pada protein tersebut, maka dapat
menyebabkan penurunan regulasi, sehingga sel kehilangan kemampuan untuk
regulasi apoptosis yang dapat memicu terjadinya kanker (Lumongga, 2008).
Apabila terjadi mutasi pada p53 maka ketahanan hidup sel akan meningkat dan
terjadi disregulasi apoptosis. Penurunan apoptosis dan memanjangnya ketahanan
hidup sel akan mengakibatkan terjadinya akumulasi sel dengan hasil akhir kanker
(Totok, 2002).
Kemoterapi, pembedahan, dan radioterapi merupakan pengobatan yang
biasa dilakukan pada penyakit kanker. Akan tetapi, muncul berbagai efek samping
setelah dilakukan pengobatan tersebut, antara lain: mual, muntah dan rambut
rontok, myalgia, thromboembolisme, neuropati, kelelahan, berat badan naik, gagal
jantung, dan leukimia (Coates et al, 1983; Partridge et al., 2001).
Banyak hasil penelitian yang telah mengatakan bahwa beraneka macam
tumbuhan memiliki kandungan senyawa antikanker. Salah satunya adalah daun
rosemary (Rosmarinus officinale). Polifenol utama yang ditemukan dalam ekstrak
rosemary (RE) termasuk asam diterpenes carnosic (CA) dan asam rosmarinic
(RA) (Peng chu et al, 2007). Dalam beberapa penelitian, asam carnosic ditemukan
 24

menjadi senyawa yang paling efektif dalam kaitannya dengan aktivitas antikanker
(Einbond et al, 2012). Rosemary awalnya dianalisis sebagai agen antikanker
karena aktivitas antioksidannya. Kandungan dalam asam fenolik Rosemary adalah
diterpenes carnosic, carnosol, dan methyl carnosate, serta asam fenolik rosmarinic
dan asam caffeic (Celiktas Y, 2010).
Penelitian serupa yang telah dilakukan oleh Anggraeni (2015) ekstrak
daun rosemary menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 13,95 µL/mL dan
dapat menginduksi apoptosis 19,68%, nekrosis 77,33%, dan dapat menekan
ekspresi ERα 91-93% pada sel T47D.
Penelitian yang lain, dilakukan oleh Lela (2017) ekstrak metanol daun
rosemary menunjukkan efek sitotosik lemah dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL,
dan jalur kematian sel pada konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak
metanol daun rosemary dapat menginduksi apopotosis sebesar 27% pada uji
flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam. Hasil uji imunositokimia daun
rosemary dapat menekan kuat ekspresi protein Bcl-2 pada konsetrasi ½ IC50 pada
sel kanker serviks.

K. Hipotesis
Berdasarkan landasan teori di atas dapat dikemukakan suatu hipotesis
pertama, ekstrak dan fraksi rosemary memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker
payudara T47D dan memberikan nilai IC50 <100 µg/mL. Kedua, fraksi etil asetat
merupakan fraksi yang paling baik, karena mengandung total fenolik yang paling
banyak. Ketiga, nilai indeks selektivitas ekstrak dan fraksi rosemary (Rosmarinus
officinale) terhadap sel kanker payudara T47D lebih dari 3. Keempat, sektrak dan
fraksi rosemary dapat mempengaruhi ekspresi gen Bcl-2 dan p53.
 25

L. Kerangka Pikir

Daun Sel
Rosemary Normal
Mutasi gen

Asam rosmarinat, Siklus sel

asam ursolat,
asam kafeat.
p53 Overekspresi
termutasi Bcl-2
Antikanker

Kanker Payudara

Sel T47D MTT assay Imunositokimia

Gambar 2. Kerangka pikir penelitian

 BAB III
METODE PENELITIAN

A. Populasi dan Sampel

Populasi pertama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun
Rosemary (Rosmarinus officinale). Populasi kedua dari penelitian ini adalah sel
kanker payudara T47D.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Rosemary
(Rosmarinus officinale) yang diperoleh dari daerah Tawangmangu. Sel kanker
payudara T47D yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Universitas Gajah
Mada Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian
1. Identifikasi variabel utama
Variabel utama dalam penelitian ini adalah daun Rosemary (Rosmarinus
officinale) yang akan diuji aktivitas sitotoksik terhadap kultur sel T47D dan sel
Vero dan ekspresi gen pada gen p53 dan bcl-2.
2. Klasifikasi variabel utama
Variabel utama yang telah diidentifikasikan terlebih dahulu dapat
diklasifikasikan ke dalam berbagai macam variabel, yaitu variabel bebas, variabel
tergantung, variabel terkendali, dan variabel tidak terkendali.
Variabel bebas yang dimaksud dalam penelitian ini adalah variabel yang
sengaja diubah-ubah untuk dipelajari pengaruhnya terhaap variabel tergantung.
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak daun rosemary (Rosmarinus
officinale) yang diujikan pada sel T47D dan sel Vero dengan berbagai
konsentrasi. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah aktivitas
sitotoksikdan ekspresi gen p53 dan bcl-2. Variabel terkendali dalam penelitian ini
adalah kondisi penelitian seperti tekanan inkubator, suhu, kondisi laboratorium,
jumlah sel di tiap susunan dan lama inkubasi.
3. Definisi operasional variabel utama
Pertama, daun rosemary (Rosmarinus officinale) adalah daun segar dari
daerah Tawangmangu yang dipanen bulan Juni 2019.

26
 27

Kedua, ekstrak etanol daun rosemary adalah hasil maserasi pada daun
rosemary dengan pelarut etanol. Ekstrak kemudian dipekatkan dengan evaporator
dan diayak dengan ayakan no.40.
Ketiga, sel kanker payudara T47D yang didapat dari laboratorium
Parasitologi Fakultaas Kedokteran Universitas Gajah Mada Yogyakarta yang
ditumbuhkan dalam media penumbuh Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
1640 (Gibco) yang mengandung Fetal Bovine Serum (FBS) 10% v/v (Gibco).
Keempat, gen p53 dan Bcl-2 adalah gen yang dikoleksi dari laboratorium
Parasitologi Fakultaas Kedokteran Universitas Gajah Mada Yogyakarta.
Kelima, Uji sitotoksik adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan
kultur sel yang digunakan untuk mendeteksi ketoksikan suatu senyawa dan
metode yang digunakan untuk uji sitotoksik adalah metode MTT assay.
Keenam, uji imunositokimia adalah metode yang digunakan untuk
mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan
menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen.

C. Alat dan Bahan

1. Alat
Alat yang digunakan untuk proses ekstraksi dan fraksinasi adalah alat-alat
gelas steril, waterbath, rotary evaporator, oven, 96 well-plate, 6 well-plate,
sentrifuge tube, inkubator CO2, Laminar Air Flow Cabinet, mikropipet,
hemositometer, ELISA reader, kamera digital, mikroskop cahaya, mikroskop
Inverter, Flowcytometer.
2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah ekstrak dan fraksi daun rosemary, sel Vero,
Sel line T47D, gen p53 dan Bcl-l2, ethanol 96%, metanol absolut, metanol 60%,
natrium bikarbonat, media RPMI 1640 (Gibco), HEPES (Sigma), Fetal Bovine
Serum (FBS), penisilin-streptomisin 1% v/v (Gibco), Tripsin 0,5% MTT 5mg/ml,
medium M119, larutan PBS, DMSO (Dimetil Sulfoksida), Fungsion 0,5% MTT 5
mg/ml, dalam PBS, media pencuci sel, larutan PBS (Phosphate Buffered Saline)
pH 7,2, Natrium Dodesil Sulfat 10% dalam HCl 0,1 N sebagai stopper.
 28

D. Jalannya Penelitian
1. Determinasi Tanaman
Tahap pertama yang dilakukan dalam penelitian ini adalah melakukan
determinasi daun rosemary. Determinasi ini bertujuan untuk menetapkan
kebenaran sampel yang digunakan dalam penelitian ini, selain determinasi harus
diperhatikan pula ciri-ciri morfologi buah terhadap kepustakaan dan dibuktikan.
2. Pengambilan Sampel
Daun rosemary (Rosmarinus Officinale) di ambil dari daerah
Tawangmangu. Tanaman di panen pada bulan Oktober 2019.
3. Pembuatan Serbuk daun rosemary
Bagian daun yang digunakan adalah daun. Daun yang dipilih adalah daun
yang tua dan segar terletak di bagian tengah daun antara cabang daun ke lima dari
bagian atas daun dan daun ke lima dari bawah. Bentuk daun masih utuh dan
berwarna hijau pekat. Daun kemudian dipisahkan dari batang dan akar, serta
dibersihkan darai pengotor lainnya. Dicuci 3 kali menggunakan air mengalir.
Kemudian dikeringkan denga oven suhu 40-50°C. Daun yang telah kering
diblender hingga hancur dan halus dan diayak dengan ayakan no 40.
4. Identifikasi organoleptis serbuk daun rosemary
Identifikasi organoleptik dilakukan untuk mengetahui kebenaran simplisia
menggunakan panca indra. Daun Rosemary yang sudah dihaluskan menjadi
serbuk kemudian diuji organoleptis. Pemeriksaan meliputi bentuk, warna, bau dan
rasa.
5. Standarisasi ekstrak
5.1 Penetapan susut pengeringan. Penetapan susut pengeringan serbuk
dari daun rosemary dilakukan dengan cara serbuk ditimbang 2 gram, kemudian
diukur susut pengeringan serbuk dengan alat moisture balance O’haus MB23
pada suhu 105° waktu yang diperlukan dalam pengukuran adalah selama 30 menit
untuk setiap pengukuran sampel, kemudian ditunggu hingga muncul angka dalam
persen. Nilai standarisasi yang terdapat dalam Farmakope Herbal Indonesia Edisi
I (2008) dimana nilai susut pengeringan tidak lebih dari 12%. Penetapan susut
pengeringan dilakukan di Laboratorium Teknologi Universitas Setia Budi
Surakarta.
 29

5.2 Penetapan kadar air. Ditimbang seksama 1 g ekstrak dalam krus

porselen bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105C selama 30
menit dan telah ditara. Ratakan dengan menggoyangkan hingga merupakan
lapisan setebal (5 mm – 10 mm) dan dikeringkan pada suhu penetapan hingga
bobot tetap, buka tutupnya, biarkan krus dalam keadaan tertutup dan mendingin
dalam desikator hingga suhu kamar, kemudian dicatat bobot tetap yang diperoleh
untuk menghitung persentase susut pengeringannya.
5.3 Penentuan bobot jenis. Bobot jenis ekstrak ditentukan terhadap hasil
pengenceran ekstrak 10% dalam pelarut tertentu (etanol) dengan alat piknometer.
Bobot jenis ekstrak ditentukan terhadap hasil pengenceran ekstrak 10% dalam
pelarut etanol dengan alat piknometer. Digunakan piknometer kering, bersih dan
telah dikalibrasi dengan menetapkan bobot piknometer dan bobot air yang baru
didihkan pada suhu 250C, lalu dimasukkan kedalam piknometer yang telah diisi
hingga suhu 250C (Depkes RI, 2000).
6. Pembuatan ekstrak dan fraksi daun rosemary
Satu Kg daun rosemary yang telah dihaluskan dimasukkan ke dalam
bejana, kemudian ditambahkan 7,5 L ethanol, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari
terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk, setelah 5 hari ampas
diperas. Ampas ditambah cairan penyari secukupnya diaduk dan diserkai dan
diperoleh seluruh bagian sari. Bejana ditutup dan dibiarkan ditempat sejuk
terlindung dari pengaruh langsung cahaya selama 2 hari, kemudian endapan
dipisahkan. Filtrat kemudian diuapkan menggunakan evaporator (suhu tetap
dijaga pada 400-500C) sampai diperoleh ekstrak kental.
Ekstrak kental ethanol daun rosemary (Rosmarinus Officinale) diencerkan
terlebih dahulu menggunakan aquadestilata yang telah dipanaskan sebanyak 40
mL, dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan (120 mL), diaduk sampai
homegen, kemudian dimasukkan kedalam corong pisah, ditambahkan pelarut n-
heksan 40 mL (3 kali pengulangan) n-heksan yang dipakai sebanyak 120 mL,
kemudian dikocok homogen dan didiamkan sampai terlihat batas pisah antara
kedua pelarut tersebut, setelah terpisah fraksi n-heksan dan fraksi aquadestilata
dikeluarkan dari corong pisah. Sisa fraksi aquadestilata ditambah larutan etil
 30

asetat 40 mL (3 kali pengulangan) etil asetat yang dipakai sebanyak 120 mL,
kemudian dikocok homogen dan diamkan sampai terlihat batas pisah antara kedua
pelarut tersebut, setelah terpisah fraksi etil asetat dan fraksi aquadestilata
dikeluarkan dari corong. Hasil fraksinasi dari masing-masing pelarut kemudian
diuapkan dengan penguap vakum atau penguap tekanan rendah.

Serbuk kering daun rosemary

1. Ekstraksi dengan 7,5 L ethanol

2. Saring

Residu Filtrat

1. Tambah pelarut ethanol

2. saring

Residu Filtrat

Residu Ekstrak etanol

rosemary
Ditambah pelarut n-heksana

Fraksi air Fraksi n-heksana

Ditambah pelarut etil asetat

Fraksi etil asetat Ampas

Fraksi tidak larut Fraksi Air

Gambar 3. Skema pembuatan ekstrak dan fraksi

 31

7. Identifikasi Kandungan Ekstrak Rosemary

Identifikasi kandungan senyawa kimia terdiri dari senyawa flavonoid,
tanin dan fenolik. Identifikasi kandungan kimia bertujuan untuk menetapkan
keberadaan senyawa kimia dalam daun rosemary (Depkes 2000).
7.1. Identifikasi alkaloid. Sebanyak 0,1 gram sampel dilarutkan dalam 10
ml CHCl3 (kloroform) dan 4 tetes NH4OH kemudian disaring dan filtratnya
dimasukan kedalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak CHCl3 dalam tabung reaksi
kemudian dikocok dengan ditambahkan 10 tetes H2SO4 2 M, sampai terbentuk 2
lapisan. Lapisan asam yang berada diatas dipisahkan kedalam tabung reaksi yang
lain dan ditambahkan pereaksi mayer yang menghasilkan endapan warna putih
sedangkan penambahan peraksi dragendorff yang akan menimbulkan endapan
warna merah jingga.
7.2. Flavonoid. Sebanyak 0,1 gram ekstrak daun rosemary dimasukan
kedalam gelas piala kemudian ditambahkan 10 ml aquadestilata dan dipanaskan
selama 5 menit sampai mendidih. Setelah itu disaring dan filtratnya digunakan
sebagai larutan uji. Filtrat dimasukan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan pita
Mg, 1 ml HCL pekat dan 1 ml alkhohol kemudian dikocok dengan kuat. Uji
positif flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga
pada lapisa amilakohol.
7.3. Identifikasi fenol. Sejumlah 0,1 gram sampel diekstrak dengan 20 ml
metanol 70 %. Larutan dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan
2 tetes larutan FeCL3 5%. Reaksi positif ditunjukan dengan terbentuknya warna
hijau atau hijau kebiruan.
7.4. Identifikasi saponin. Sebanyak 0,1 gram sampel dimasukan kedalam
gelas piala kemudian ditambahkan 10 ml air panas dan didihkan selama 5 menit.
Setelah itu disaring dan filtratnya digunakan sebagai larutan uji. Filtrate
dimasukan kedalam tabung reaksi tertutup kemudian dikocok selama kurang lebih
10 detik dan dibiarkan selama 10 menit, ditambahkan 1 ml HCL 2M. Adanya
saponin ditunjukan dengan terbentuknya buih yang stabil.
7.5. Identifikasi tannin. Sebanyak 0,1 gram ekstrak ditambahkan dengan
10 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring. Sebagaian filtrat yang
 32

diperoleh ditambahkan dengan larutan FeCl3 1%. Hasil positif ditunjukan oleh
terbentuknya warna hijau kehitaman.
7.6. Identifikasi terpenoid. Sebanyak 0,1 gram sampel dilarutkan dengan
metanol kemudian diuapkan diatas waterbath. Filtrat digerus kemudian dilarutkan
dengan 2 ml kloroform dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan asetat
anhidrat sebanyak 10 tetes, selanjutnya larutan ditetesi dengan H2SO4 pekat 3
tetes melalui dinding tabung reaksi. Jika hasil yang diperoleh berupa cincin
kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpen,
sedangkan munculnya warna hijau menujukan adanya steroid.
8. Identifikasi Kandungan Ekstrak daun rosemary dengan KLT
Eksrak (5 g) di fraksinasi berturut–turut dengan pelarut heksan, etil
asetat, air, (10 ml) setiap perlakuan. Fraksinasi dilakukan dengan pengocokan
selama 15 menit.
8.1 Uji terpenoid. Fase gerak dibuat campuran heksan–etilasetat (1:1)
dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan sampai jenuh. Pada plat KLT GF254p
ditotolkan kira-kira 5 l sari heksan dan dimasukkan pada chamber, dielusi
sampai tanda, diambil dan dibiarkan sampai kering. Ekstrak mengandung
terpenoid bebas bila dilihat dibawah sinar UV 365 nm berfluoresensi hijau /
berwarna merah ungu atau biru dengan pereaksi asam sulfat pekat 10 % dalam
metanol.
8.2 Uji alkaloid. Dibuat fase gerak etilasetat – metanol – air
(100:13,5:10) dimasukkan dalam chamber, dibiarkan sampai jenuh. Pada plat
KLT GF254 p ditotolkan kira-kira 5 l masing – masing sari etil asetat, air,
masukkan dalam chamber, dielusi sampai tanda, diambil dan dibiarkan sampai
kering. Ekstrak mengandung alkaloid bebas bila dilihat dibawah sinar UV 365 nm
berfluoresensi hijau / berwarna jingga dengan pereaksi Dragendorf.
8.3 Uji flavonoid. Dibuat fase gerak kloroform – etilasetat ( 6 : 4 )
dimasukkan dalam chamber, dibiarkan sampai jenuh. Pada plat KLT GF254 p

ditotolkan kira-kira 5 l masing – masing sari etil asetat, air, lalu dimasukan
dalam chamber, dielusi sampai tanda. Ekstrak mengandung flavonoid bebas bila
 33

dilihat dibawah sinar UV 365 nm berfluoresensi hijau / berwarna biru atau kuning
dengan pereaksi citro borax.
9. Pembuatan Medium Kultur.
Medium kultur dibuat dengan melarutkan masing-masing 10,4 gram
bubuk RPMI dan M119 ke dalam 800 ml aquadestilata dan, kemudian ditambah
4-(2-hydroxyethyl) piperazineethanesulfonic acid (HEPES) dan NaHCO3.
Selanjutnya aquadestilata ditambah sampai volume 1 L. Campuran kemudian
dihomogenkan dengan cara diaduk kemudian pH diukur pada 7,2-7,4 dengan
penambahan 1M NaOH atau 1M HCl. Hasil tersebut disterilisasi kembali dengan
menyaring menggunakan saringan membran 0,2µm, selanjutnya ditambahkan
fungsion 0,5% FBS (Fetal Bovine Serum) dan streptomisin 2% (Gusmita 2010).
10. Panen sel
Pertama, sel ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri, kemudian media
kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. Kedalam cawan petri
ditambahkan PBS untuk mencuci kemudian dibuang dan ditambahkan 0,5 mL
tripsin secara merata dalam cawan petri, kemudian ditutup dan didiamkan selama
3 menit hingga sel terlepas. Selanjutnya ditambahkan media RPMI lengkap,
diambil sedikit untuk diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk
menghitung jumlah sel yang diperlukan selama pengujian. Rumus yang digunakan
adalah sebagai berikut :
jumlah sel kuadran 1+2+3+4 104
× ⁄mL
4
Jumlah sel yang diperlukan ditambahkan media RPMI hingga 10 mL dan
dimasukkan sebanyak 100µL ke dalam 96 well-plate untuk uji MTT, dan 1 mL ke
dalam 24 well-plate dengan cover slip untuk uji imunositokimia, kemudian
diinkubasi selama 24 jam hingga konfluen.
11. Pembuatan larutan uji.
Larutan stock ekstrak ethanol daun rosemary dengan kadar 10 mg/100 µl
dalam DMSO. Larutan stock tersebut dibuat seri konsentrasi dalam medium
kultur dengan variasi dosis 500 µg/ml ; 250 µg/ml ; 125 µg/ml ; 62,5 µg/ml ;
31,25 µg/ml ; 15,6 µg/ml ; 7,81 µg/ml. Masing-masing variasi konsentrasi
 34

selanjutnya dipipet 100 µl ke dalam tiap sumuran dengan 3 kali pengulangan

untuk tiap variasi dosis.
12. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT
Perlakuan dapat segera di berikan pada sel yang telah diinkubasi selama
24 jam di dalam well-plate dan didapati telah konfluen. Medium kultur yang di
gunakan adalah RPMI untuk sel T47D dan medium 119 untuk sel vero. Langkah
pertama yaitu media kultur dibuang terlebih dahulu, kemudian diberi 100 µL PBS,
lalu dibuang kembali. Tiap lubang diberi 100µL sampel yang telah diencerkan,
pada kolom kontrol sel cukup diberi sampel sel sedangkan kontrol media diberi
larutan media kulture, kemudian diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator
yang mengandung CO2. Larutan MTT dicampur dengan media kultur terlebih
dahulu kemudian media kultur dalam well-plate dapat dibuang. Tiap lubang diberi
100 µL larutan MTT dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah 4 jam diberi 100 µL
reaegn stopper SDS kemudian diinkubasi di suhu ruang selama 24 jam. Setelah
diinkubasi kemudian serapa dibaca dengan ELISA reader pada panjang
gelombang 595 nm.
13. Uji selektivas
Indeks selektivitas atau Selectivity Indeks (SI) menunjukkan selektivitas
sitotoksik dari ekstrak kasar terhadap sel kanker dibandingkan sel normal,
dihitung dari IC50 sampel kasar pada sel normal terhadap sel kanker. Nilai SI > 3
menunjukkan selektivitas tinggi (Machana et al, 2011). Uji ini dilakukan ketika
hasil uji sitotoksik sel kanker memenuhi syarat, dengan nilai IC50 yang didapatkan
kurang dari 1.000 µg/ml. Suatu zat dikatakan tidak toksik bila nilai IC50 > 1.000
µg/ml (Omoregie et al., 2012).
Nilai SI menunjukkan selektivitas sampel terhadap sel uji. Selektivitas
efek sitotoksik ekstrak ethanol terpurifikasi sel normal Vero dibandingkan sel
kanker payudara MCF 7 dihitung dengan Persamaan di bawah ini.
IC50 Sel normal
SI= ×100%
IC50 sel kanker
 35

14. Uji Ekspresi p53 dan Bcl-2 dengan metode imunositokimia

Pengujian imunositokimia dilakukan dengan menanam sel dalam 24
well-plate diberi cover slip (jumlah sel 500.00 sel/mL) sejumlah 1 mL. Setelah
diinkubasi selama 24 jam dan sel sudah konfluen, media kultur di buang.
Kemudian di beri larutan PBS 500 µL lalu dibuang. Sampel dimasukkan sebanyak
1000µL ke dalam sumuran kemudian diinkubasi ke dalam inkubator CO2. Media
yang ada di sumuran dibuang, kemudian diisikan PBS 500 µL ke dalam masing-
masing sumuran dan PBS dibuang. Cover slip diambil dan diletakkan ke dalam
sumuran 6-well plate bekas atau dish bekas yang bersih. Cover clip diberi PBS
lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian difiksasi menggunakan metanol 300
µL lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi aquadestilata lalu dibuang,
dilakukan dua kali. Cover slip diberi hidrogen peroksida 100 µL selama 10 menit
lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi larutan blocking 100 µL selama 10
menit lalu dibuang. Cover clip ditetesi antibodi monoklonal primer untuk antigen
yang ingin diamati kemudian ditambahkan 500 µL PBS dan diinkubasi 5 menit.
Reagen streptavidin-enzim peroksidase ditambahkan, kemudian diinkubasi selama
10 menit. Larutan substrat kromogen DAB ditambahan, dan diinkubasi selama 10
menit. Cover clip ditetesi larutan Maye Haematoxylin dan diinkubasi selama 3
menit sebagai proses counterstain dan dicuci dengan aquadestilata. Cover clip
kemudian diangkat dan dicelupkan ke dalam xylol, kemudian di celupkan ke
dalam alkhohol. Setelah kering, cover clip di tutup dengan slide kemudian
dilakukan pengamatan dengan mikroskop cahaya.

E. Analisa Data
1. Analisis nilai IC50
Nilai IC50 adalah konsentrasi yang menghambat pertumbuhan 50%
populasi sel untuk mengetahui potensi sitotoksitasnya (Doyle et al 2000). Data
hasil ELISA reader berupa absorbansi (Abs) tiap sumuran dikonversikan dalam
 36

persentase kehidupan sel. Absorbansi kontrol pelarut dianggap sama dengan

absorbansi kontrol sel maka presentase sel hidup dihitung dengan rumus :
Abs sel dengan perlakuan − Abs kontrol media
%viabilitas sel = × 100 %
Abs kontrol sel − Abs kontrol media
Setalh %viabilitas sel didapatkan, kemudian dilakukan perhitungan IC50
(inhibitor Concentration 50) dengan menggunakan persamaan regresi linear yang
menggambarkan antara persen (%) viabilitas sel T47D dan sel Vero dengan log
konsentrasi sample uji (Setyyawan, 2006). IC50 dapat dihitung dari persamaan
y=a+bx, dengan x adalah log konsentrasi senyawa dan y adalah persen viabilitas
sel. Harga IC50 ditentukan dengan cara viabilitas sel diplotkan pada kurva
sehingga diperoleh log kadar senyawa uji. IC50 diperoleh dari antilog nilai x.
Metode imunositokimia digunakan untuk melihat ekspresi p53 dan Bcl-2.
Ekspresi p53 dan Bcl-2 ditunjukkan dengan warna coklat pada inti sel dan
sitoplasma dengan bantuan mikroskop inverted. Hasil pengamatan
imunositokimia menggunakan antibodi monoklonal primer dikatakan positif
adanya protein p53 dan Bcl-2 apabila pada inti sel dihasilkan warna coklat/gelap,
sedangkan bila pada inti sel setelah fiksasi dengan hematoksilin dihasilkan warna
ungu, maka menunjukkan hasil negatif adanya protein p53 dan Bcl-2.
Data yang diperoleh dalam penelitian untuk tingkat ekspresi p53 dan Bcl-
2 antara dosis pemberian ekstrak ethanol daun rosemary, dilakukan uji normalitas
data menggunakan uji Sapiro wilk jika data yang diperoleh normal P>0,05
dilakukan uji homogenitas dan jika data yang diperoleh tidak normal P?0,05
dilanjutkan uji nonparametik. Dilakukan uji homogenitas untuk melihat apakah
data yang diperoleh memiliki varian yang sama atau tidak, jika hasil yang
diperoleh memiliki varian yang sama atau homogeny P>0,05 maka dilanjutkan uji
parametrik menggunakan uji Anova satu jalan. Jika uji Anova satu jalan
menunjukkan P>0,05 maka ada perbedaan dan dapata dilanjutkan uji Post Hoc
Test.
 37

Pembuatan media

Panen sel

Pembuatan Larutan Uji

Uji MTT assay

Kelompok
Kontrol Kontrol Kontrol Kontrol
uji seri
Media sel positif negatif
konsentrasi

Uji Imunositokimia

Analisa Data

Gambar 4. Skema penelitian uji MTT assay dan imunositokimia

 38

F. Jadwal Penelitian
Tabel 2. Jadwal pelaksanaan kegiatan
Bulan Ke-
No Nama Kegiatan
1 2 3 4 5 6
1 Determinasi tanaman V
2 Pengambilan sampel V
3 Pembuatan serbuk rosemary V
4 Identifikasi organoleptis serbuk daun
V
rosemary
5 Pembuatan ekstrak dan fraksi rosemary V
6 Standarisasi ekstrak V
7 Identifikasi kandungan ekstrak rosemary V
8 Identifikasi kandungan ekstrak daun rosemary V
9 Pembuatan medium kultur V
10 Panen sel V
11 Pembuatan larutan uji V
12 Pengujian viabilitas sel dengan metode MTT
V
assay
13 Uji selektivitas V
14 Uji ekspresi p53 dan Bcl-2 dengan metode
V
imunositokimia
15 Analisa data V V V
16 Penyusunan hasil penelitian V V V V V V
 39

DAFTAR PUSTAKA

Abcam, 2007, T47D (Human ductal breast epithelial tumor cell line) Whole Cell
Lysate (ab14899) datasheet. http://www.
abcam.com/index.html?datasheet=14899, diakses Februari 2007

Al-Sereti M R, Abu-Amer K M, Sen P. 1999. Pharmacology of rosemary

(Rosmarinus officinalis) and its therapeutic potentials. Indian Journal of
Experimental Biology. Vol 37, 124-130.

Anggraeni, C. D. 2015. Aktivitas sitotoksik ekstrak metanolik daun rosemary

(rosmarinus officinale) terhadap sel kanker payudara T47D melalui
regulasi ekspresi reseptor estrogen-α (ER-α). [skripsi]. Yogyakarta:
Universitas Sanata Dharma.

BPOM, 2008, Informatorium Obat Nasional Indonesia, Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia, Jakarta

Burdall, E.S., Hanby M.A., Landsdown, R.J.M., dan Speirs, V., 2003, Bereast
Cancer Cell Line, Breast Cancer Res., 5(2): 89-95.

Chan Y W et al. 2000. Bcl-2 and p53 protein expression, apoptosis, and p53
mutation in human ephithelial ovarian cancers. American journal of
pathology. Vol 156 no 2.

Cuvelier,M.E.; Berset,C.; Richard,H. AntioxidantConstituents in Sage (Salvia

officinalis). J.Agric. FoodChem. 1994, 42, 665–669. [CrossRef]

Einbond LS, Wu HA, Kashiwazaki R, He K, Roller M, et al.: Carnosic acid

inhibits the growth of ER-negative human breast cancer cells and
synergizes with curcumin. Fitoterapia 83, 1160–1168, 2012.
doi:10.1016/j.fitote.2012.07.006

Heinz et al, 2005. Color Atlas of Pharmacology. Edisi ke 3. Jerman:

Thieme Verlag.

Heti D. Uji sitotoksik ekstra etanol 70% herba Sisik naga (Drymoglossum
piloselloides Presl) terhadap sel T4TD [skripsi]. Surakararta : Fakultas
Farmasi Universitas Setia Muhamadiyah Surakarta: 1-18

Jemal A et al, 2008. Cancer Statistics. CA Cancer J Clin. Vol 58 no 2.

Joyeux M, Rolland A, Fleurentin J. Mortier F & Dortinan P, Plan/il Med, 56

(1990 ) 171 .
 40

Loliger J. In Rancidity in Joods (Elsevier Appl ied Sc. London), 1989.105.

Mathers C et al. 2013. Cancer Incidence and Mortality Worldwide.
GLOBOCAN 2012 v1.0

Matsunaga K, Lu X-C, Yasuda H et ai, Nat Med, 5 (1997) 63 .

Peng CH, Su JD, Chyau CC, Sung TY, Ho SS, et al.: Supercritical fluid extracts
of rosemary leaves exhibit potent anti-inflammation and antitumor effects.
Biosci Biotechnol Biochem 71, 2223–2232, 2007.

Sasco A.J. 2003. Breast cancer and the environment. Endocrine Disrupters. Horm
Res 60 (suppl 3) : 50.

Schuler P, In Food antioxidans (Elsevier Applied Sc, London), 1989. 99.

Schuler P, In Food antioxidans (Elsevier Applied Sc, London), 1989. 99.

Singletary K W & Nelshoppen J M. Cancer Lett, 60 ( 1991) 169.

Yesil-Celiktas O, Sevimli C, Bedir E, and Vardar-Sukan F: Inhibitory effects of

rosemary extracts, carnosic acid and rosmarinic acid on the growth of
various human cancer cell lines. Plant Foods Hum Nutr 65, 158–163,
2010. doi:10.1007/s11130-010-0166-4