Anda di halaman 1dari 13

LAPORAN PRAKTIKUM DASAR – DASAR BIOKIMIA

PERCOBAAN 3
ANALISIS PROTEIN

Disusun oleh:
Nama : Novena Tesalonika Rasuh
NIM : 171444008
Shift/Kelompok : A1/01

Dosen Pengampu:
Risnita Vicky Listyarini, M.Sc

Asisten Dosen:
1. Maria Eva Kristiana
2. Margaretha Arihta Lestari

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA


JURUSAN PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SANATA DHARMA, YOGYAKARTA
SEMESTER GANJIL 2019/2020
PERCOBAAN 3
ANALISIS PROTEIN

A. Judul Praktikum
Analisis Protein
B. Hari dan Tanggal Praktikum
Jumat, 11 Oktober 2019
C. Tujuan Praktikum
Melakukan analisis protein secara kuantitatif.
D. Landasan Teori
Protein merupakan salah substansi penting yang berperan dalam pertumbuhan dan
perkembangan tubuh manusia yang didukung oleh karbohidrat dan lemak untuk
memberikan nutrisi baik bagi tubuh. Tidak hanya itu, protein juga membantu aktivitas
enzim dalam metabolisme tubuh dan transportasi nutrisi. Oleh karena itu, penting bagi
tubuh memasukkan protein ke dalam menu makan sehari-hari agar enzim menjalankan
fungsinya secara optimal (Wu et al., 2014).
Analisis protein dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu kualitatif dan kuantitatif.
Analisis kualitatif pada protein dapat dilakukan dengan reaksi Xantoprotein, reaksi
Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Untuk analisis
kuantitatif dapat dilakukan dengan Metode Kjeldahl, Metode Lowry, Metode Biuret,
Metode Spektrofotometer UV, Metode Turbudimetri, Metode Pengecatan, dan Metode
Titrasi Formol (Sudarmadji dkk., 2007).
Menurut Kirazov et al. (1993), metode Bradford dan metode Lowry merupakan
metode analisis protein secara kuantitatif yang paling sering digunakan. Metode
Bradford bekerja dengan membentuk kompleks karena reaksi Coomassie Brilliant Blue
(CBB) dengan protein. Untuk Metode Lowry, analisis protein dilakukan dengan
mereduksi Cu2+ oleh protein dan mereduksi reagen Folin Ciocalteau oleh kompleks
tembaga-protein (Mena et al., 2018).
Banyak metode yang telah dikembangkan agar secara akurat dapat mengukur
protein dalam sampel tertentu. Pada konsentrasi tertentu, analisis protein dapat
dilakukan menggunakan metode Bradford dan metode Lowry. Kedua metode ini
membutuhkan biaya yang cukup tinggi untuk dilakukan, tetapi menghasilkan hasil
analisis dengan tingkat akurasinya yang tinggi (Becker et al., 2011).

1
E. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Spektrofotometer UV-VIS
b. Plat Sumur 6 x 24
c. Aluminium Foil
2. Bahan
a. Larutan PBS (10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl)
b. Akuades
c. Green Fluorescent Protein (GFP)
d. Larutan BSA
e. Larutan A (Lar. Na2CO3 2%; Lar. NaOH 0,4%; Lar. Kalium-Natrium Tartrat
0,16%; Lar. SDS 1%)
f. Larutan B (Lar. CuSO4.5H2O 4%)
g. Larutan C (Lar. A : Lar. B = 99:1)
h. Reagen Folin Ciocalteau

F. Prosedur Kerja
1. Pengujian Koefisien Ekstingsi untuk Kuantifikasi EGFP
Larutan PBS sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam kuvet blanko lalu
dimasukkan ke dalam spektrofotometer. Kuvet sampel diisi dengan campuran
larutan PBS sebanyak 1.960 μL dan EMGFP sebanyak 40 μL. Setelah itu,
absorbansi diukur pada 488 nm (λ 495) menggunakan spektrofotometer. Terakhir,
konsentrasi protein dihitung menggunakan koefisien ekstingsi EMGFP dengan
keterangan sebagai berikut.
Koefisien Ekstingsi (ε) = 61.000 cm-1 M-1
Berat molekul EGFP = 30,6 kDa = 30.600 g/mol
b = Panjang kuvet
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖
Konsentrasi EGFP (M) = × 𝐹𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
𝜀×𝑏
𝐴488
= 61.000 𝑐𝑚−1 𝑀−1 × 1 𝑐𝑚 × 2.000 𝜇𝐿/40𝜇𝐿

- Pembuatan Phosphate Buffered Saline (PBS) :


Laruran 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, dan 137 mM NaCl
Buffer ini berada pada kondisi yang mirip dengan in vivo (pH, osmolaritas)

2
- Pipet dicelupkan ke dalam larutan dan larutan dicampur dengan menyedot dan
menyemprotkan mikropipetnya.
- Faktor Pengenceran
Sampel protein diencerkan selama pengukuran dan dikalikan dengan
perhitungan konsentrasi akhir untuk mengkompensasi konstanta.
Tingkat pengenceran = Volume sampel protein disuntikkan volume total
sampel
Volume sampel protein yang ditambahkan dalam percobaan sebanyak 40 μL dan
volume total sebanyak 2000 μL (1.960 μL + 40 μL). Oleh karena itu, laju
pengenceran adalah 40 μL/2000 μL = 1/50 dan faktor pengenceran adalah 50.
2. Pembuatan Kurva Standar BSA
Larutan BSA dibuat menjadi 5 konsentrasi yang berbeda-beda, yaitu 0 mg/mL;
0,02 mg/mL; 0,04 mg/mL; 0,08 mg/mL; dan 0,1 mg/mL. Larutan BSA dengan
variasi konsentrasi ini ditambahkan dengan larutan C (Larutan A + Larutan B) dan
didiamkan selama 15 menit untuk bereaksi (tabung reaksi ditutup dengan aluminium
foil pada suhu ruangan). Setelah itu, ditambahkan dengan reagen Folin Ciocalteau
sebanyak 75 μL dan didiamkan selama 5 menit atau sampai warna kuning
menghilang (tabung reaksi ditutup dengan aluminium foil dalam suhu ruangan).
Lalu, absorbansi masing-masing konsentrasi diukur pada panjang gelombang
maksimum (λmax) 750 nm menggunakan spektrofotometer. Data-data yang
didapatkan disusun menjadi ke dalam bentuk grafik kurva standar konsentrasi versus
konsentrasi BSA.
3. Uji Lowry untuk Kuantifikasi GFP
Larutan reaksi (sampel) ditempatkan dalam plat sumur 6 x 24. Larutan C
(Larutan A + Larutan B) sebanyak 2 mL dimasukkan ke setiap plat sumur 24 dan
dicampur dengan pipet. Sumur ditutup dengan aluminium foil pada suhu kamar dan
dibiarkan bereaksi selama 15 menit. Setelah itu, reagen Folin Ciocalteau sebanyak
75 μL ditambahkan ke larutan reaksi dan diaduk menggunakan pipet. Aluminium
foil ditutup kembali pada suhu kamar dan dibiarkan bereaksi selama 5 menit atau
sampai warna kuningnya menghilang. Lalu, campuran tersebut dimasukkan ke
dalam kuvet 1 cm. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang maksimum
(λmax) 750 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Terakhir, konsentrasi
EMGFP ditentukan berdasarkan kurva standar BSA yang telah dibuat.

1
G. Data Pengamatan
Tabel 1. Pengujian Koefisien Ekstingsi untuk Kualifikasi EMGFP
Sampel Absorbansi Konsentrasi (M) Konsentrasi (mg/mL)
EMGFP 0,059 4,836 x 10-5 1,471

Tabel 2. Pembuatan Kurva Standar BSA


Konsentrasi BSA (mg/mL) Absorbansi
0 0,05
0,02 0,194
0,04 0,279
0,08 0,429
0,1 0,501

Kurva Standar Larutan BSA


0.6
0.5
0.501
Absorbansi

0.4 0.429
0.3
0.279
0.2 0.194
0.1
0.05
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Konsentrasi (mg/mL)

y = 4,31989x + 0,0829843
r2 = 0,98158

Tabel 3. Uji Lowry untuk Kuantifikasi EMGFP


Sampel Absorbansi Konsentrasi (mg/mL)
EMGFP 0,369 0,066

2
H. Pembahasan
1. Pengujian Koefisien Ekstingsi untuk Kuantifikasi EMGFP
Percobaan ini bertujuan untuk menganalisis protein secara kuantitatif.
Dalam hal ini, protein yang dianalisis secara kuantitatif adalah Emerald Green
Fluorescent Protein (EMGFP). EMGFP merupakan protein mutasi dari
Enhanced Green Fluorecent Protein (EGFP) yang berasal dari ubur-ubur
Aequorea victoria. EGFP memancarakan sinyal berpendar pada berbagai
panjang gelombang. EMGFP termasuk salah satu mutasi protein EGFP yang
memancarkan warna hijau pada panjang gelombang 487 nm. EMGFP digunakan
dalam percobaan ini sebagai sampel protein yang akan dianalisis konsentrasinya
menggunakan koefisien ekstingsi. Penggunaan EMGFP sebagai sampel karena
sifatnya yang superior folding dibandingkan penggunaan EGFP (Stepanenko et
al., 2010).
Percobaan dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan untuk
menentukan konsentrasi EMGFP. Dalam hal ini, larutan PBS dan sampel
EMGFP sebagai bahan-bahannya dipersiapkan oleh praktikan. Larutan PBS
dibuat dari Na2HPO4, KH2PO4, dan NaCl yang berguna sebagai larutan buffer
dalam percobaan ini. Larutan PBS bisa digunakan sebagai buffer karena sifatnya
yang isotonik dan tidak beracun bagi sel. Untuk instrumen yang digunakan dalam
percobaan ini ialah spektrofotometer UV-Vis sebagai salah satu metode
kuantitatif untuk menentukan konsentrasi sampel EMGFP.
Sampel EMGFP ini dicampur dengan larutan PBS untuk melarutkan
EMGFP. Pelarutan sampel dalam larutan PBS dibantu menggunakan mikropipet
agar campuran terlarut secara merata. Setelah itu, larutan PBS sebagai pelarut
dimasukkan ke dalam kuvet blanko dan sampel yang telah dilarutkan dalam
larutan PBS dimasukkan dalam kuvet sampel. Absorbansi sampel lalu diukur
dengan instrumen spektrofotometer UV Vis. Berdasarkan hasil pengamatan,
absorbansi sampel sebesar 0,059. Absorbansi ini yang digunakan untuk
menentukan konsentrasi sampel melalui koefisien ekstingsi.
Penentuan konsentrasi EMGFP dengan koefisien ekstingsi didasari oleh
hukum Lambert-Beer, yaitu sebagai berikut (Triyati, 1985).
A=ℇxbxc

3
Ket.
A : Absorbansi
ℇ : Absortivitas molar atau Koefisien Ekstingsi (cm-1 M-1)
b : Lebar kuvet (cm)
c : Konsentrasi (M)
Berdasarkan persamaan tersebut, konsentrasi EMGFP dapat ditentukan
dengan data-data yang telah diketahui. Absorbansi EMGFP yang didapatkan
sebesar 0,059 dan memiliki koefisien ekstingsi sebesar 61.000 cm-1 M-1. Untuk
lebar kuvetnya sendiri sebesar 1 cm. Hasil konsentrasi ini dikalikan dengan
Faktor Pengenceran (FP) yang bernilai 50. Maka dari itu, konsentrasi EMGFP
yang didapatkan menggunakan koefisien ekstingsi ialah sebesar 1,471 mg/mL.
2. Pembuatan Kurva Standar BSA
Percobaan dilanjutkan dengan membuat kurva standar Bovine Serum
Albumin (BSA) agar dapat memperoleh persamaan garisnya. Dalam percobaan
ini, larutan BSA merupakan larutan standar yang umumnya digunakan untuk
protein. Pembuatan kurva standar BSA dimulai dengan membuat larutan BSA ke
dalam beberapa konsentrasi, yaitu 0 mg/mL; 0,02 mg/mL; 0,04 mg/mL; 0,08
mg/mL; dan 0,1 mg/mL. Pembuatan kurva standar perlu dibuat dari minimal lima
konsentrasi larutan standar agas hasil yang didapatkan semakin akurat.

Gambar 1. Larutan Standar BSA


Larutan standar BSA dengan konsentrasinya masing-masing direaksikan
dengan larutan C (Larutan A dan Larutan B). Larutan A merupakan campuran
Na2CO3, NaOH, dan Kalium Natrium Tartrat, sedangkan Larutan B ialah larutan
CuSO4. Larutan BSA yang telah direaksikan dengan larutan C menunjukkan
warna biru pada larutan karena ion Cu2+ yang berasal dari larutan C. Namun,

4
lama kelamaan warna larutan campuran ini menjadi bening kembali. Reaksi ini
ditunggu selama 15 menit. Larutan lalu ditambahkan dengan reagen Folin
Ciocalteau yang berwarna kuning dan ditunggu bereaksi selama 5 menit.
Larutan standar BSA dimasukkan dalam spektrofotometer UV-Vis. Di sini
kuvet blanko diisi dengan akuades. Pembuatan kurva standar BSA dibuat dari
konsentrasi yang paling rendah, yaitu 0 mg/mL dan diakhiri dengan larutan BSA
konsentrasi 0,1 mg/mL. Setelah dianalisis dengan instrumen, absorbansi masing-
masing larutan BSA dapat diketahui. Dari sini, persamaan garis dari kurva
standar BSA dapat dibuat.

Gambar 2. Analisis Protein dengan Spektrofotometer UV Vis


Berdasarkan hasil pengamatan, persamaan garis kurva standar BSA yang
dibuat ialah y = 4,31989x + 0,0829843 dengan nilai R2 sebesar 0,98158 yang
menunjukkan hasil yang bagus (karena R2 yang mendekati angka 1). Penentuan
kurva standar BSA ini sangat penting karena dari persamaan yang didapatkan,
konsentrasi sampel EMGFP dapat ditentukan. Berikut adalah kurva dari larutan
BSA.

Kurva Standar Larutan BSA


0.6
Absorbansi

0.4 0.501
0.429
0.2 0.194 0.279

0 0.05
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Konsentrasi (mg/mL)

Gambar 3. Kurva Larutan Standar BSA

5
3. Uji Lowry untuk Kuantifikasi EMGFP
Penentuan konsentrasi EMGFP selanjutnya menggunakan metode Lowry.
Prinsip metode Lowry ini sendiri ialah mereaksikan protein kompleks Cu2+ yang
berasal dari reaksi biuret direaksikan dengan reagen folin. Reagen folin ini dibuat
dari molibdenum dan tungsten yang mengandung fosfat yang digunakan dalam
proses redoks yang terjadi dalam uji Lowry. Reagen folin ini memiliki
sensitivitas 100 kali lebih baik dari biuret. Pada metode Lowry ini sendiri,
penentuan konsentrasi protein dilakukan pada panjang gelombang 750 nm
(Sudarmadji, 2007).
Percobaan ini dimulai dengan menyiapkan larutan sampel EMGFP. Sampel
EMGFP ini direaksikan dengan larutan C (Larutan A + Larutan B), sehingga
warna larutan menjadi biru. Reaksi dilakukan selama 15 menit, lalu ditambahkan
reagen Folin Ciocalteau yang berwarna kuning. Reaksi ini ditunggu selama 5
menit atau warna kuning reagen ini terlarut sempurna, lalu dimasukkan dalam
instrumen spektrofotometer UV Vis.

Gambar 4. Larutan Sampel


Penentuan konsentrasi sampel EMGFP ini menggunakan air sebagai
blankonya. Sampel EMGFP ini dimasukkan dalam kuvet sampel. Instrumen lalu
mengukur absorbansi dari sampel tersebut. Berdasarkan hasil percobaan,
absorbansi yang didapatkan sebesar 0,369 yang dimasukkan dalam persamaan

6
garis larutan standar BSA yang telah diperoleh sebelumnya. Hasil menunjukkan
konsentrasi EMGFP melalui metode Lowry ini ialah sebesar 0,066 mg/mL.
Perbandingan penentuan konsentrasi EMGFP dengan pengujian koefisien
ekstingsi dan pengujian Lowry menunjukkan perbedaan hasil yang cukup
signifikan. Konsentrasi EMGFP dengan pengujian koefisien ekstingsi ialah
sebesar 1,471 mg/mL, sedangkan melalui metode Lowry konsentrasi EMGFP
sebesar 0,066 mg/mL. Perbedaan hasil ini dapat terjadi karena sensitivitas Lowry
lebih tinggi dibandingkan koefisien ekstingsi. Konsentrasi EMGFP berdasarkan
koefisien ekstingsi ini dapat dipengaruhi oleh komponen-komponen lain yang
membuat hasil yang tidak akurat.
I. Diskusi
1. Sebutkan dan jelaskan metode analisis protein secara kualitatif!
Metode analisis protein yang dilakukan secara kualitatif maupun kuantitatif.
Untuk metode analisis protein secara kualitatif itu sendiri dapat dilakukan dengan
beberapa cara. Beberapa di antaranya adalah Reaksi Xantoprotein, Reaksi
Hopkins-Cole, Reaksi Millon, Reaksi Nitroprusida, dan Reaksi Sakaguchi
(Poedjiadi & Supriyanti, 2005).
a. Reaksi Xantoprotein ialah mereaksikan larutan HNO3 pekat dengan protein
yang menghasilkan endapan putih dan dapat menjadi kuning saat dipanaskan.
b. Reaksi Hopkins-Cole ialah protein direaksikan dengan pereaksi Hopkins-
Cole yang mengandung asam glioksilat dan ditambahkan H2SO4 perlahan
untuk membentuk lapisan pada bagian bawah larutan protein. Lama
kelamaan akan terbentuk cincin ungu di antara kedua lapisan.
c. Reaksi Millon ialah mereaksikan pereaksi Millon (larutan merkuro dan
merkuri nitrat dalam HNO3) ke dalam larutan protein menghasilkan endapan
putih yang dapat berubah menjadi merah saat dipanaskan.
d. Reaksi Nitroprusida ialah mereaksikan protein dengan pereaksi nitroprusida
menghasilkan warna merah.
e. Reaksi Sakaguchi mereaksikan protein (arginin) dengan pereaksi Sakaguchi
(naftol dan natriumhipobromit) yang menghasilkan warna merah.

7
2. Jelaskan keuntungan dan kelemahan dari analisis protein secara kuantitatif
menggunakan metode Biuret, Metode Lowry, dan Metode Bradford!
Pada metode Biuret, ikatan peptide bereaksi dengan Cu2+ menghasilkan
kompleks berwarna ungu. Keuntungan metode ini ialah dapat digunakan dengan
semua jenis surfaktan (deterjen), kurva respon linear yang mendekati 1 (R2 >
0,95), variasi protein-proteinnya lebih sedikit dibandingkan uji Bradford.
Kerugiannya ialah tidak dapat digunakan pada senyawa-senyawa yang bisa
mereduksi Cu2+, tidak bisa menggunakan agen pereduksi biasanya (DTT), dan
tidak sensitif. Metode Lowry memiliki sensitivitas yang sangat tinggi dan akurat,
tetapi tidak dapat digunakan pada deterjen dan agen pereduksi, serta
membutuhkan waktu analisis yang lebih lama. Metode Bradford dapat
menggunakan agen pereduksi dan bekerja dengan sangat cepat, tetapi tidak bisa
menggunakan deterjen (Mena et al., 2018).
J. Simpulan
Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh dua analisis protein EMGFP secara
kuantitatif, yaitu penentuan konsentrasi berdasarkan koefisien ekstingsi dan metode
Lowry. Pada konsentrasi yang berdasarkan koefisien ekstingsi diperoleh konsentrasi
EMGFP sebesar 1,471 mg/mL. Metode lowry menunjukkan hasil konsentrasi
EMGFP yang berbeda. Metode Lowry ini menggunakan persamaan garis yang
didapatkan dari kurva standar larutan BSA yaitu y = 4,31989x + 0,0829843, sehingga
konsentrasi EMGFP yang diperoleh ialah sebesar 0,066 mg/mL. Konsentrasi
EMGFP menunjukkan hasil yang lebih akurat menggunakan metode Lowry. Hal ini
dikarenakan sensitivitas metode Lowry dalam menentukan konsentrasi protein
sangat tinggi dibandingkan metode lain.

8
DAFTAR PUSTAKA

Becker, J., Caldwell, G., & Zachgo, E. (2011). Biotechnology. San Diego: Academic Press.
Kirazov, L. P., Venkov, L. G., & Kirazov, E. P. (1993). Comparison of The Lowry and The
Bradford Protein Assays as Applied for Protein Estimation of Mebrane-Containing
Fractions. Anal. Biochemistry, 208(1), 44-48.
Mena, E., Kjolby, R., Saxton, R., Werner, A., Lew, B., Boyle, J. Harland, R., & Rape, M
(2018). Dimerization Quality Control Ensures Neuronal Development and Survival.
Science, 362, 1-16.
Poedjiadi & Supriyanti. (2005). Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.
Stepanenko, O. V., Verkushar, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., & Turoverov, K.
K. (2010). Fluorescent Proteins as Biomarkers and Biosensors: Throwing Color
Lights on Molecular and Cellular Processes. Curr Protein Peptida Science, 9(4),
338-369.
Sudarmadji, S., Suhardi, & Haryono, B. (2007). Analisa Bahan Makanan dan Pertanian.
Yogyakarta: Liberty Yogyakarta.
Triyati, E. (1985). Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak serta Aplikasinya dalam
Oseanologi. Oseana, 10(1), 39-47.
Wu, G. Y., Bazer, E.W., Dai, Z. L., Li, D. F., Wang, J. J., & Wu, Z. I. (2014). Amino Acid
Nutrition in Animals: Protein Synthesis and Beyond. Annu. Rev. Enim. Bioscience,
2, 387-417.

9
LAMPIRAN

A. Konsentrasi EMGFP (M)


FP = 2000 μL/ 40 μL = 50
A = ε . b. c
𝐴
c = 𝜀 × 𝑏 × 𝐹𝑃
0,059
= × 50
61.000 𝑐𝑚−1 𝑀−1 × 1 𝑐𝑚

c = 4,836 x 10-5 M
c = 4,836 mol/L x 30.600 g/mol
= 1,471 g/L
= 1,471 mg/mL

B. Kurva Standar BSA


y = 4,31989x + 0,0829843
r2 = 0,98158

C. Konsentrasi Sampel EMGFP


y = 4,31989x + 0,0829843
0,369 = 4,31989 x + 0,0829843
x = 0,066 M

10