Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada kasus ini adalah kapas alkohol, swab cotton steril,
tabung eppendorf 1.5 ml, gelas objek, mikroskop, ose inoculating loop, ose inoculating
needle, bunsen, pemantik, inkubator, agar plate, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet
tetes, glass rod
Bahan yang digunakan adalah cairan BHI (Brain Heart Infusion), media BA
(Blood Agar), media MCA (MacConkey Agar), media TSA (Trypticase Soy Agar),
media SSA (Salmonella-Shigella Agar), media agar TSIA (Triple Sugar Iron Agar),
media agar urea, media agar sitrat (Simmon’s citrate), media uji indol, media uji
MRVP (Methyl Red-Voges Proskauer), tabung fermentasi karbohidrat (glukosa,
laktosa, sukrosa, maltosa, dan manitol), pewarna kristal violet, lugol, larutan pemucat
(aseton alkohol), KOH 3%, H2O2 3%, reagen oksidasi, alpha napthol, methyl-red
indicator, KOH 40%, akuades, dan reagen erlich.

Prosedur

Gambar 2 Bagan alur identifikasi bakteri

Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada sapi yang memiliki luka terbuka pada
bagian kaki belakang. Sampel diambil dengan mengambil swab abses dari dalam luka
terbuka. Di sekitar daerah luka dibersihkan dulu dengan alkohol 70% untuk mencegah
kontaminasi. Swab cotton steril dibuka dari aluminium foil. Setelah swab terambil,
swab dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang berisi Brain Heart Infusion (BHI)
dan dihomogenkan. Tabung eppendorf langsung dibawa ke laboratorium diagnostik
dan dipindahkan ke lemari pendingin.

Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang berguna untuk
membedakan bakteri gram positif dan gram negatif. Sampel yang berada didalam
media BHI, media Blood Agar (BA), MacConkey Agar (BA), media SSA (Salmonella-
Shigella Agar), dan media Trypticase Soy Agar (TSA) diambil isolatnya kemudian
diwarnai dengan pewarnaan gram. Tahapan membuat pewarnaan gram dimulai dengan
membuat preparat ulas kemudian difiksasi di atas api. Preparat diberi larutan pewarna
kristal violet selama 1 menit, kemudian dibilas dengan akuades atau air mengalir.
Lugol diteteskan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan larutan pemucat (aseton
alkohol) selama 5 detik. Preparat dibilas dengan akuades/air mengalir dan diberi
larutan pewarna safranin selama 15 detik. Setelah itu, preparat dibilas dengan
akuades/air mengalir dan dikeringkan di atas kertas saring. Preparat diperiksa dibawah
mikroskop dengan pembesaran lensa objektif 100x dan ditetesi minyak imersi pada
permukaan preparat. Bakteri gram positif akan berwarna ungu sedangkan bakteri gram
negatif akan berwarna merah.

Gambar 3 Pewarnaan gram (Cowan 2004)

Pembiakan Bakteri pada Media Blood Agar (BA), Media Salmonella-Shigella

Agar (SSA), dan MacConkey Agar (MCA)
Spesimen dibiakkan pada media BA, SSA, dan MCA. Media BA, SSA, dan
MCA dibagi menjadi tiga bagian sehingga membentuk huruf T. Ose inoculating loop
dipijarkan kemudian ditunggu sampai dingin dan spesimen pada media BHI diambil
menggunakan ose inoculating loop. Setelah itu dilakukan inokulasi bakteri ke daerah I
sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung (goresan zig zag) sepadat mungkin.
Posisi mata ose harus datar menempel pada agar, kemudian ose dipijarkan kembali dan
dibiarkan dingin. Penggoresan diulangi dari daerah I menuju daerah II sebanyak 3-4
kali dan diteruskan ke daerah II dengan goresan lebih renggang. Ose dipijarkan dan
dan dibiarkan dingin kembali. penggoresan diulang dari daerah II ke daerah III
sebanyak 3-4 kali dan diteruskan goresan ke daerah III dengan goresan lebih renggang
dari goresan di daerah II. Ose dipijarkan dan dan dibiarkan dingin kembali.
penggoresan diulang dari daerah III ke daerah IV sebanyak 3-4 kali dan diteruskan
goresan ke daerah IV dengan goresan lebih renggang dari goresan di daerah III. Ose
dipijarkan kemudian agar dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi cawan petri
dibalik selama 24-48 jam.

Gambar 4 Goresan kuadran pada media agar

Subkultur Bakteri ke Media Trypticase Soy Agar (TSA)

Koloni yang tumbuh terpisah dan berbeda pada media BA dan MCA dibiakkan
pada media TSA untuk dijadikan isolat murni. Ose dipijarkan lalu dibiarkan hingga
dingin, kemudian koloni yang terpisah pada BA diambil dari media dan digoreskan
pada media TSA dan diberi label. Koloni yang terpisah pada MCA diambil dari media
dan digoreskan pada media TSA dan diberi label. Setelah itu, media TSA diinkubasi
pada suhu 37oC selama 24-48 jam.

Uji KOH 3%
Uji ini dilakukan dengan cara mengambil bakteri dari media TSA
menggunakan ose, kemudian bakteri diletakkan pada gelas objek dan diteteskan KOH
3%. Apabila hasilnya membentuk lendir maka bakteri termasuk gram negatif, dan
apabila tidak terbentuk lendir maka bakteri termasuk gram positif.

Uji Katalase
Hidrogen peroksida (H2O2 3%) diteteskan pada permukaan gelas objek bersih,
kemudian bakteri dari media TSA diambil menggunakan ose dan dicampurkan dengan
H2O2 3% pada gelas objek. Hasil positif ditandai dengan adanya gelembung dan hasil
negatif ditandai dengan tidak adanya gelembung.

Uji Oksidase
Uji oksidase digunakan untuk mendeteksi enzim sitokrom oksidase. Pada uji
ini digunakan kertas saring yang ditetesi cairan oksidase kemudian isolat diambil dan
diletakkan di atas kertas saring. Hasil positif ditunjukkan dengan terlihatnya warna biru
keunguan yang berarti bakteri tersebut memiliki enzim sitokrom oksidase. Jika hasil
negatif ditunjukkan dengan tidak terlihatnya perubahan warna dari kertas saring.

Uji Fermentasi Karbohidrat

Karbohidrat yang digunakan adalah glukosa, laktosa, sukrosa, mannitol, dan
maltosa. Media berbentuk cairan berwarna merah dan terdapat tabung durham.
Prosedur dimulai dengan cara memanaskan ose, kemudian isolat bakteri dari media
TSA dimasukkan kedalam tabung. Media diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48
jam. Hasil dibaca dengan melihat terjadinya perubahan warna dan adanya gas pada
tabung durham. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna media menjadi warna
kuning.

Uji pada media Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Penanaman bakteri pada media TSIA dimulai dengan memanaskan ose
inoculating needle. Bakteri diinokulasi dengan cara menusukkan ke bagian butt dan
digoreskan ke bagian slant. Media diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam.
Pengamatan dilakukan meliputi perubahan warna pada slant dan butt, terbentuknya gas
atau tidak, dan endapan hitam H2S.

Uji Indol dan Motilitas

Tabung media uji indol disiapkan. Media yang digunakan berbentuk semi
padat. Pada uji indol biasanya dilakukan bersamaan dengan uji motilitas. Prosedur
dimulai dengan memanaskan ose inoculating needle, kemudian bakteri diambil dari
media TSA dan ditusukan 3/4 pada media indol. Media diinkubasi pada suhu 37ºC
selama 24 jam. Keesokan harinya diamati pertumbuhan bakterinya. Apabila
pertumbuhannya sampai permukaan, maka bakteri motil. Setelah itu media ditetesi
dengan reagen erlich. Jika terdapat cincin berwarna merah pada permukaan maka hasil
uji indol positif.

Uji Sitrat
Tabung media uji sitrat berupa media padat yaitu Simmon Citrate Agar yang
berwarna hijau. Prosedur dimulai dengan memanaskan ose inoculating loop kemudian
bakteri diambil dari media TSA dan digoreskan pada permukaan agar. Media
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya
perubahan warna media menjadi biru.

Uji Hidrolisis Urea

Media yang digunakan untuk uji hidrolisis urea adalah semi padat yang
mengandung urea dan merah fenol (indikator). Prosedur dalam uji hidrolisis urea
dimulai dengan memaskan ose inoculating loop, setelah itu bakteri diinokulasikan
dengan cara digoreskan pada permukaan media. Kemudian media diinkubasi pada suhu
37ºC selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna dari kuning
menjadi merah muda.
Uji Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP)
Media uji MR-VP merupakan tabung kaldu. Prosedur dimulai dengan
memanaskan ose inoculating loop, kemudian isolat bakteri dimasukan ke dalam
tabung. Setelah dua hari, media dibagi ke dalam dua tabung dan dilakukan uji VP. Uji
VP dilakukan dengan diberikan Alpha-nepthol sebanyak 15 tetes dan KOH 40%
sebanyak 15 tetes. Kemudian dikocok sampai terlihat gelembung dan ditunggu selama
30 menit. Hasil positif ditandai dengan adanya warna merah muda pada permukaan.
Uji MR dilakukan pada hari ke lima, tabung ditambahkan 5 tetes methyl red indicator.
Hasil positif ditandai dengan adanya warna merah dalam beberapa menit

Diffusion Test/Uji Sensitifitas Antibiotik (MHA)

Uji ini digunakan untuk menentukan sensitifitas bakteri terhadap antibiotik.

Isolat bakteri dibuat dalam bentuk suspensi dengan menggunakan aquades dan
dibandingkan kepekatannya dengan MacFarland standard 1. Sebanyak 500µl suspensi
diambil dan dimasukkan dalam media Mueller-Hinton Agar (MHA) dan diratakan
menggunakan glass rod. Agar didiamkan selama 5-10 menit. Disc yang berisi
antibiotik ditempatkan di 5 titik berbeda di permukaan agar untuk melihat kemampuan
antibiotik menghambat pertumbuhan dari bakteri yang diuji.
Sensitivitas atau resistensi suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh
diameter zona hambat yang terbentuk. Hambatan akan terlihat sebagai daerah yang
tidak memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri di sekitar cakram. Apabila jarak
antara cakram dengan bakteri 14 mm atau lebih, maka dapat dinyatakan bahwa bakteri
peka terhadap suspensi sehingga bisa dikatakan bahwa suspensi dapat menghambat
pertumbuhan bakteri (sensivitas), tetapi apabila jarak antara cakram dengan koloni
bakteri 11 mm atau kurang maka dapat dikatakan bahwa bakteri resisten terhadap
suspensi atau dengan kata lain suspensi tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri

DAFTAR PUSTAKA

Cowan ST, Barrow GI, Feltham RKA. 2004. Cowan and Steel’s Manual for the
Identification of Medical Bacteria. Cambridge (UK): Cambridge University Pr.
Ekawati ER, Husnul SN, Herawati D. Identifikasi kuman pada pus dari luka infeksi
kulit. Jurnal SainsHealth. 2(1):31-35.
Mardhiah A, Rizalsyah T. 2019. Abses Pada SAPI. BPTU-HPT Indrapuri [Internet].
[Diunduh 28 Januari 2020]; Tersedia pada http://bptu-
hptindrapuri.com/site/index.php/media-top/artikel-top/386-abses
Singh S, Khare M, Patidar RK, Bagde S, Sahare KN, Dwevedi D, Singh V. 2013.
Antibacterial Activities Against Pyogenic Pathogens. Int. Jour. Of
Pharmaceutical Sciences and Research. 4(8):2974-2979.