Anda di halaman 1dari 10

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi

Plasmid Biner dengan Metode Tri Parental Mating


Construction and transformation of binary plasmid Cry 1Ab gene carrier using tri-
parental mating

Liberty1, M. Herman2, dan G.A. Watimena3

Key words : Cloning binary vector, Cry1Ab gene, transformation, tri parental mating.
Kata kunci : vektor cloning binary, gen Cry 1Ab, transformasi, persilangan tiga tetua.

Pengembangan Bioteknologi dan


Abstract Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor
pada bulan Agustus 2003 hingga
In order to develop seed borer resistant Oktober 2004.
soybean cultivar, the research to
construct and transform binary plasmid Kloning DNA pada vektor plasmid
Cry1Ab gene carrier into Agrobacterium meliputi kegiatan restriksi DNA,
tumefaciens were done in Laboratorium defosforilasi, ligasi, transformasi, dan
Biologi Molekuler dan Rekayasa isolasi plasmid. Transformasi plasmid
Genetika and in Laboratorium Fasilitas biner ke dalam A. tumefaciens dilakukan
Uji Terbatas Balai Besar dan dengan metode triparental mating.
Pengembangan Bioteknologi dan Hasil penelitian menunjukkan bahwa
Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor transformasi E. coli dengan gen cry1Ab
Indonesia from August 2003 to October telah berhasil dilakukan dan diketahui
2004. The DNA cloning works were ukuran fragmen gen cry1Ab yang
including DNA restriction, diperoleh adalah 14.762 bp. Konstruksi
dephosphorilation, ligation, gen cry1Ab berhasil diintroduksikan
transformation, and plasmid isolation. kedalam A. tumefaciens dengan metode
Tri-parental mating method was used to triparental mating.
transform binary plasmid into A.
tumefaciens. 14.762 bp Cry1Ab gene
fragment were transformed in to E. coli. Pendahuluan
Through tri-parental mating method, this
gene construction was successfully Tanaman kedelai merupakan salah satu
introduced into A. tumefaciens. tanaman pangan penting di Indonesia
setelah padi dan jagung, yang hingga
saat ini masih perlu diimpor. Kebutuhan
Sari kedelai Indonesia terus meningkat
Penelitian untuk mengkonstruksi plasmid sebesar 2.24 juta ton setiap tahunnya,
biner pembawa gen cry1Ab dan padahal kapasitas produksi kedelai
mentransformasi plasmid biner tersebut nasional hanya mencapai 1.19 juta ton
ke dalam Agrobacterium tumefaciens dari luas areal tanam 967.002 ha (Badan
dalam upaya merakit tanaman kedelai Pusat Statistik, 2002).
tahan penggerek polong dilakukan di
Laboratorium Biologi Molekuler dan Kendala dalam peningkatan produksi
Rekayasa Genetika dan di Laboratorium tanaman kedelai adalah tingginya
Fasilitas Uji Terbatas Balai Besar dan serangan penyakit dan hama tanaman,
terutama hama penggerek polong
kedelai yang disebabkan oleh Etiella
1) Universitas Islam Negeri Sunan Gunung
Djati Bandung
zinkenella dari ordo Lepidoptera. Hama
2) Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya ini merupakan hama penting tanaman
Genetik Pertanian
3) Institut Pertanian Bogor

130 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008


kedelai yang hingga saat ini masih sulit plasmid untuk dapat ditransfer ke dalam
untuk diatasi, karena sifat suatu tanaman. Plasmid yang digunakan
penyerangannya yang sulit dideteksi untuk transformasi tanaman tidak hanya
secara cepat dari luar (Soekarno dan menggunakan gen dari karakter yang
Harnoto, 1985). diinginkan, tetapi juga gen marka untuk
seleksinya..
Penggunaan varietas kedelai tahan hama
penggerek polong merupakan cara yang Konstruksi plasmid dan metode transfer
paling efektif, efisien, dan aman. yang tepat merupakan salah satu faktor
Namun, perakitan tanaman secara penetu keberhasilan perakitan tanaman
konvensional masih menemukan transgenik. Dalam penelitian ini
kendala, yaitu belum ditemukannya dilakukan konstruksi plasmid biner
sumber gen ketahanan di dalam plasma untuk mengatasi sulitnya menemukan
nutfah kedelai yang ada saat ini. sisi pemotongan yang unik dengan
enzim restriksi pada plasmid Ti yang
Perakitan tanaman tahan dengan teknik
sangat besar (Loedin et al. 1998).
rekayasa genetik dapat dilakukan untuk
Transformasi plasmid biner ke dalam A.
mengatasi masalah di atas. Teknologi
tumefaciens dilakukan dengan metode
rekayasa genetik memberikan peluang
triparental mating.
bagi pemulia tanaman untuk
memperoleh kelompok gen yang baru
dan lebih luas (Herman, 2002). Gen Bahan dan Metode
yang ditransfer ke dalam genom
tanaman bisa berasal dari species lain Penelitian dilakukan pada bulan
seperti, bakteri, virus, atau tanaman dari Agustus 2003 hingga Oktober 2004 di
jenis lain (Bennet, 1993). Laboratorium Biologi Molekuler dan
Rekayasa Genetik Balai Besar
Perakitan tanaman transgenik Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
melibatkan beberapa tahap dalam teknik Pertanian (BB-Biogen) Bogor.
biologi molekuler dan seluler (Herman,
1996). Teknik rekayasa genetik yang Bahan yang digunakan dalam percobaan
sering dipakai dan memberikan hasil ini adalah dua macam plasmid, yaitu
yang memuaskan adalah melalui pSBB (pembawa gen cry1Ab yang
perakitan tanaman transgenik dengan dikendalikan oleh promotor 35S CaMV
teknik transformasi. Menurut Sudarsono dan terminator nos) dan pCambia 1301
(1994) teknik transformasi sangat (pembawa gen penyeleksi bakteri kanR,
dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu penyeleksi tanaman hph, gen gus, dan
(1) tersedianya gen yang diinginkan, (2) multiple cloning site pada T-DNA),
tersedianya cara untuk mentransfer dan serta Agrobacterium tumefaciens strain
mengintegrasikan gen tersebut ke dalam LBA 4404 (koleksi Balai Penelitian
sel tanaman, dan (3) tersedianya cara Perkebunan (Balitbun) Bogor.
untuk meregenerasikan tanaman Kloning DNA pada vektor plasmid
transgenik untuk mengekspresikan gen meliputi kegiatan restriksi DNA,
yang telah diintroduksikan tersebut. defosforilasi, ligasi, transformasi, dan
Gen cry1Ab merupakan gen yang isolasi plasmid (Sambrook et. al 1989).
mengkode Bt toksin dan terbukti efektif Restriksi plasmid pSBB dan pCambia
mengatasi hama dari golongan 1301 dilakukan dengan menggunakan
lepidoptera, sehingga dapat digunakan enzim HindIII. Defosforilasi dilakukan
untuk mengendalikan hama penggerek dengan metode calf intenstinal akaline
polong kedelai. Gen cry1Ab tersebut phaspatase (CIP) terhadap vektor
harus dikonstruksi dalam suatu vektor pCambia yg sudah dipotong dan diligasi

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 131
dengan fragmen cry1Ab mengikuti HindIII diperoleh satu fragmen
metode GibcoBRL. berukuran 11.837 kb dan pada plasmid
pSBB diperoleh dua fragmen berukuran
Transformasi plasmid ke dalam E. coli
2.925 kb (fragmen gen cry1Ab) dan
DH5α dilakukan dengan metode kejutan
2.74 kb (Gambar 1). Pemotongan
panas dan isolasi DNA plasmid dari
plasmid pSBB dengan enzim HindIII
kultur cair bakteri dilakukan dengan
bertujuan untuk memisahkan fragment
metode lisis alkalis mengikuti metode
gen cry1Ab dari vektor awalnya
Sambrook et al. (1989). Transformasi
(pSBB). Ukuran fragmen-fragmen yang
gen cry1Ab ke dalam A. tumefaciens
diperoleh tersebut sesuai dengan ukuran
LBA 4404 dilakukan dengan metode
fragmen insersi pada peta plasmid yang
triparental mating mengikuti metoda
dikeluarkan oleh Cambia Co. Australia.
yang dikemukakan oleh Ditta et al.
(1980). Konfirmasi hasil integrasi gen Fragmen gen cry1Ab dan pCambia
cry1Ab ke dalam A. tumefaciens 1301 selanjutnya dielusi dari gel
dilakukan dengan teknik PCR dengan agarose untuk digunakan pada proses
menggunakan primer spesifik untuk gen ligasi. Defosforilasi merupakan tahap
cry1Ab. Primer yang digunakan adalah : yang paling penting dan dilakukan
5’-CGA CAT CTC CTT GTC CTT sebelum ligasi. Defosforilasi dapat
GAC AC-3’ dan 5’-ACA CCC TGA mengurangi terbentuknya hasil ligasi
CCT AGT TGA GCA AC-3’. sendiri. Proses defosforilasi pada
umumnya dilakukan dengan
Hasil dan Pembahasan menggunakan enzim akaline fosfatase
seperti calf intestinal phasphatase
Konstruksi plasmid biner diawali (CIP). CIP sendiri merupakan
dengan pemotongan dua plasmid glikoprotein yang berfungsi untuk
(pCambia 1301 dan pSBB) memindahkan ikatan 5’-phasphatase
menggunakan enzim restriksi HindIII. dari DNA linear (Sambrook et al.
Berdasarkan peta plasmid, pSBB 1989). Proses defosforilasi ini dilakukan
memiliki gen cry1Ab yang lengkap pada pCambia 1301 dan berfungsi untuk
dengan promotor dan terminatornya mencegah tersambungnya kembali
berada di antara dua sisi enzim restriksi fragmen tersebut. Penyambungan
HindIII tersebut. kembali fragmen dapat menghambat
Hasil pemotongan pada plasmid penyisipan gen cry1Ab pada plasmid
pCambia 1301 dengan enzim restriksi biner.

Gambar 1. Pola restriksi pCambia 1301 dan pSBB


M = Marka, 1 =pCambia 1301, 2 = pCambia 1301+HindIII, 3 = pSBB dan HindIII, 4 =
pSBB diencerkan 10 x, 5 = pSBB, dan λ = 50 ng/µl, a = pCambia ukuran 11.837 kb, b
= gen cry1Ab ukuran 2.935 kb, c = PGEM-4z ukuran 2.74 kb.

132 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008


Hasil penyambungan gen cry1Ab padat+kanR selama 16 jam pada suhu
dengan fragmen pcambia 1301 (plasmid 37oC. Koloni-koloni yang terbentuk dari
biner modifikasi) menggunakan enzim masing-masing perlakuan (Gambar 2)
T4 DNA ligase diintroduksi dengan mengindikasikan keberhasilan
proses transformasi kedalam bakteri E. konstruksi plasmid rekombinan yang
coli (sel kompeten DH5α) dan telah membawa gen cry1Ab di bawah
ditumbuhkan pada media LB kontrol promotor 35S CaMV.

Gambar 2. Koloni bakteri hasil transformasi ke dalam E. Coli


1 = Plasmid rekombinan ulangan 1, 2 = Plasmid rekombinan ulangan 2,
3 = Plasmid rekombinan ulangan 3

Dari koloni-koloni yang terbentuk dapat dengan fragmen gen cry1Ab


diketahui bahwa konstruksi plasmid menghasilkan plasmid rekombinan
rekombinan dilakukan dengan pCambia-cry1Ab berukuran 14.762 bp
menyisipkan gen cry1Ab di bawah (Gambar 3) yang merupakan gabungan
kontrol promotor 35S CaMV ke dalam dari vektor pCambia 11.837 bp dan
plasmid vektor pCambia 1301. Proses fragmen cry1Ab 2.935 bp.
ligasi antara DNA vektor pCambia 1301

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 133
Gambar 3. Peta plasmid rekombinan pCambia-cry1Ab

DNA rekombinan yang diperoleh koloni replika menggunakan enzim


kemudian ditransformasikan kedalam HindIII.
sel kompeten E. coli melalui metode
Berdasarkan hasil restriksi terhadap
kejutan panas. Transformasi ke dalam
DNA rekombinan yang berasal dari
sel E. coli bertujuan untuk
koloni 1.3 dan 3.2 terdapat dua fragmen
memperbanyak plasmid rekombinan.
berukuran 11.,837 bp dan 2.925 bp
Verifikasi terhadap E. coli yang
(gambar 4) dimana fragmen pertama
mengandung plasmid biner (pCambia
merupakan ukuran dari plasmid vektor
dengan fragmen gen cry1Ab) dilakukan
pCambia 1301 dan fragmen kedua
dengan cara uji pola restriksi
merupakan ukuran dari promotor 35S
menggunakan enzim restriksi terhadap
CaMV (800 bp), gen cry1Ab (1.845)
delapan sampel DNA plasmid dari
dan terminator nos (280 bp). Dugaan
koloni replika. Pada tahap awal
awal dari kedua plasmid ini adalah
dilakukan deteksi pola plasmid
pCambia 1301 yang telah tersisipi
rekombinan melalui pemotongan
fragmen gen cry1Ab.
delapan sampel DNA plasmid dari

134 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008


Gambar 4. hasil restriksi plasmid rekombinan dengan HindIII
M = Marka, 1 =pCambia 1301, 2 = pCambia 1301+HindIII, 3 = cry1Ab, A = Koloni 1.1,
B = Koloni 1.2, C = Koloni 1.3, D = Koloni 2.1, E = Koloni 2.2, F = Koloni 2.3, G =
Koloni 3.1, H = Koloni 3.2, λ1 = 100 ng/µl, λ2 = 200 ng/µl, λ3 = 300 ng/µl, a = fragmen
berukuran 2.925 kb, b = fragmen berukuran 2.925 kb

Tahap kedua dilakukan kembali deteksi koloni yang berasal replika 3.5 yang
pola plasmid rekombinan melalui diperkirakan rekombinan. Selanjutnya
pemotongan empat sampel DNA DNA plasmid dari koloni 3.2 dan 3.5
plasmid dari koloni replika dipotong dengan enzim BamHI+EcoRI.
menggunakan enzim hindIII. Hasil pemotongan dengan enzim
Berdasarkan hasil restriksi tersebut dapat dilihat pada Gambar 5.
menggunakan enzim tersebut hanya

Gambar 5. Hasil restriksi plasmid rekombinan dengan enzim BamHI+EcoRI


M = Marka, 1 = 3.5+BamHI+EcoRI, 2 = 3.5+EcoRI, 3 = 3.5+HindIII, 4 =
3.2+BamHI+EcoRI, 5 = 3.2+EcoRI, 6 = 3.2+HindIII

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 135
Berdasarkan pola restriksi dengan menggunakan enzim-enzim
menggunakan enzim EcoRI+BamHI restriksi.
plasmid rekombinan 3.2 mempunyai
Plasmid rekombinan yang telah dicek
empat fragmen berukuran 1845 bp, 280
pola restriksinya ditransformasikan ke
bp, 37 bp, dan 12.600 bp. Hal yang
dalam A. tumefaciens LBA 4404
sama juga dilakukan pada plasmid
melalui metode triparental mating.
rekombinan 3.5 dan diperoleh empat
Proses ini menggunakan tiga tetua, yaitu
fragmen berukuran 1845 bp, 830 bp,
A. tumefaciens LBA 4404, E. coli HB
280 bp, dan 11.807 bp. Dari hasil
101, dan E. coli DH5α yang
pemotongan menggunakan enzim
mengandung plasmid rekombinan yang
restriksi diperoleh dua versi penyisipan
ditumbuhkan dalam media seleksi
gen cry1Ab dalam vektor pCambia
LB+50 mg/ l kanamisin+25 mg/ l
1301, yang disebabkan karena kedua
rimpafisin untuk menyeleksi bakteri-
ujung DNA baik vektor maupun gen
bakteri donor.
sisipan mempunyai sekuen pengenal
yang sama (HindIII). Perbedaan pada Proses triparental mating telah berhasil
posisi ini disebabkan karena arah mengintroduksikan plasmid pCambia-
ekspresi gen cry1Ab. Pada gen cry1Ab1 cry1Ab ke dalam A. tumefaciens LBA
posisinya searah dengan jarum jam, 4404 (Gambar 6). Plasmid pCambia-
sedangkan pada gen cry1Ab2 posisinya cry1Ab yang terdapat pada E. coli
berlawanan dengan arah jarum jam. Hal DH5α hasil transformasi (sebagai
ini menunjukkan bahwa plasmid donor) dipindahkan ke dalam A.
pCambia-cry1Ab1 dan pCambia- tumefaciens LBA 4404 (sebagai
cry1Ab2 memiliki pola restriksi seperti resipien) melalui konjugasi dengan
yang diharapkan. Plasmid yang bantuan E. coli HB 101 (pRK 2013)
mempunyai pola restriksi seperti yang yang resisten terhadap antibiotik
diharapkan dapat digunakan untuk kanamisin, rentan terhadap antibiotik
transformasi ke dalam A. tumefaciens rimpafisin dan resipien A. tumefaciens
(Gambar 5). LBA 4404 resisten terhadap rimpafisin
dan rentan terhadap kanamisin. Bakteri
Transformasi bakteri E. coli DH5α
yang mampu tumbuh pada media seleksi
dengan gen cry1Ab yang terdapat dalam
ini hanya A. tumefaciens LBA 4404
plasmid pCambia 1301 telah berhasil
yang telah mengandung plasmid
dilakukan. Keberhasilan transformasi ini
pCambia-cry1Ab hasil triparental
dapat dilihat dari transforman E. coli
mating (resisten terhadap kanamisin dan
DH5α yang tumbuh pada media seleksi
rimpafisin).
yang mengandung 50 mg/ l kanamisin.
Kemampuan tumbuh pada media seleksi Hasil transformasi tersebut ditandai
dikarenakan adanya gen nptII dengan munculnya koloni pada media
(neomycine phosphotransferase) seleksi. Koloni yang tumbuh pada
penyandi ketahanan terhadap antibiotik media seleksi selanjutnya di uji PCR
kanamisin pada plasmid pCambia 1301. untuk membuktikan bahwa fragmen gen
Keberhasilan transformasi ke dalam E. cry1Ab telah masuk ke dalam A.
coli DH5α ini dilakukan pengujian tumefaciens.

136 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008


Gambar 6. Transformasi triparental mating ke dalam A.tTumefaciens
a. E. coli rekombinan, b. Plasmid helper PRK2013, c. A. tumefaciens LBA 4404, d.
Perkawinan dengan triparental mating, e. Triparental dalam media seleksi

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 137
Analisis PCR merupakan metode Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa
deteksi secara cepat untuk mengetahui koloni dari triparental mating 3.2 dan
keberadaan transgen di dalam jaringan 3.5 positif membawa gen cry1Ab
tanaman putatif trangenik. Reaksi (Gambar 7). Hal ini menunjukkan
amplifikasi dilakukan berdasarkan bahwa A. tumefaciens telah membawa
metode Wang et al. (1993) yang gen cry1Ab dan dapat
dimodifikasi dengan menggunakan mesi ditransformasikan ke dalam genom
PCR MJ Research PCT-100. tanaman.
Keberadaan gen cry1Ab diindikasikan
dengan produk PCR berukuran 100 bp.

Gambar 7. Hasil PCR triparental mating


M = Marka, 1 = triparental 3.2, 2 = triparental 3.%, 3 = plasmid 3.2, 4 = plasmid 3.5,
dan 5 = kontrol

Bennet, J. 1993. Genese for crop


Kesimpulan improvement. Genetic
Engineering. 16 : 93-113.
Berdasarkan uji pola restriksi,
transformasi E. coli dengan gen cry1Ab Ditta, G.S., D. Stanfield, Corbin, D.R.
telah berhasil dilakukan dan diketahui Helinski. 1980. Broad host range
ukuran fragmen gen cry1Ab yang DNA cloning system for gram
diperoleh adalah 14.762 bp. Konstruksi negative bacteria : construction of
gen cry1Ab berhasil diintroduksikan a gene bank of Rhizobium meliloti.
kedalam A. tumefaciens dengan metode Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 77 :
triparental mating. 7344-7351.
Herman. 1996. Rekayasa genetik untuk
Daftar Pustaka perbaikan tanaman. Buletin
AgroBio. 1(1) : 24-34.
Badan Pusat Statistik. 2002. Statistika
Indonesia.Statistical Year Book of Sambrook, JEF Fritsch, and T.
Indonesia. Jakarta. Indonesia. maniatis. 1989. Molecular Cloning
A laboratory Manual (2nd ed.).

138 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008


Cold Spring Harbor Laboratory Sudarsono. 1994. Penggunaan protein
press. New York. USA. pembungkus (coat protein) dari
pathogen virus dan rekayasa
Soekarno, D. dan Harnoto. 1985.
genetik untuk memperoleh
Pengendalian Hama Kedelai.
tanaman unggul tahan virus. JIPI.
Dalam S. Somaatmadja,
4(2) : 34-39
Mismunadji, Sumarno, Mahyudi
Syam, S.O. Manurung, dan Wang K., 1995. Seeds. Slater. Iowa.
Yaswadi. Kedelai. Puslitbangtan. USA.
Badan Litbang Pertanian. Halaman
: 310-330.

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 139