MAKALAH PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE ANALISIS

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI DARI SPEKTOFOTOMETRI

KEMOMETRI DAN METODE KROMATOGRAFI CAIR UNTUK
PENENTUAN SILMULTAN DARI DUA CAMPURAN KOMPONEN
YANG MENGANDUNG OBAT BRONKODILATOR

Disusun Oleh :

Tanisa maghfira syarza 10060313104

Firdaus muis 10060314038

Yosep saeful 10060314040

Ananda putri hanifah 10060315109

Siti qurota ayunin 10060315111

Arinda roosma 10060315112

Nadia athiyyah rahma 10060315116

Lisvia aryanti ritana 10060315117

Rizska della shafira 10060315118

Siti zainab 10060315120

Nadila amalia agustiantri 10060315121

Regita 10060315123

Sany aulia sabathini 10060315125

Susi rosita pratiwi 10060315128

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2018
 BAB I

PENDAHULUAN

Guaiphenesin merupakan ekspektoran yang digunakan untuk pengobatan

dari batuk produktif yang dicampur dengan salbutamol sulfat sebagai
bronkodilator yang digunakan dalam pengaturan reversible obstruksi saluran
udara dan asma selain dari metilparaben dan propil paraben pengawet pada
campuran 1. acephylline piperazine sebagai bronkodilator yang berhubungan
dengan bromheksin hidroklorida sebagai mukolitik digunakan untuk pengobatan
gangguan pernafasan yang berhubungan dengan batuk produktif. Selain itu,
metilparaben dan propilparaben digunakan sebagai pengawet pada campuran 2.
Kedua campuran tersebut digunakan sebagai obat batuk. Nilai absorbansi spektro
UV pada kedua campuran cukup tumpang tindih (overlap), dimana penggunaan
dari spektofotometri konfensional dan itu merupakan turunan langsung dan
teknik rasio derivate gagal untuk mengatasinya. Dari berbagai studi terhadap
senyawa dalam campuran multi komponen, tidak ada metode analisis yang
dilaporkan dapat memberikan determinasi simpultan.

Lima senyawa dalam campuran obat batuk mengandung guaiphenesin

dengan asetaminofen, p-amino fenil, kafein, klorofeniramin maleat yang dideteksi
dengan cara partial least squares dan principal component regression PCR. HPLC
digunakan pada campuran yang mengandung GU dengan terbutalin dan ambroxol,
dextromethorphan, pseudoephedrine hidroklorida dan asetaminofen,
fenilpropanolamin, hidroklorida dan difenilpiralin hidroklorida terbutalin dan
bromheksin, dextromethorphan dan natrium benzoate, folkodin dan efedrin
hidroklorida parasetamil, kafein, fenilpropanolamin hidroklorida dan
klorfeniramin maleat dan parasetamol, kafein, DF metilefedrin hidroklorida dan
klorfeniramin maleat. HPLC digunakan untuk pengujian SL dengan troventol
ipratropium bromide, fenoterol dan terbutalin. Campuran ternary dari AC dengan
fenobarbiton dan papaverin hidroklorida di uji dengan menggunakan turunan
kedua dari ratio spectrum-zero-crossing dan metode HPLC. BX di uji dengan
menggunakan serapan spektofotometri dan PLS multivariate calibration. HPLC
digunakan untuk menguji campuran multikomponen BX dengan ambroxol
hidroklorida dan clenbuterol, sulfametoksipiridazin, sulfametoksazol,
sulfadimetoksin dan trimetoprin, prometazin hidroklorida, noscapin hidroklorida ,
efedrin hidroksida metilparaben dan propilparaben, klorprenalin dan dekloksizin
Percobaan ini menitikberatkan pada metode PLS-1 dan metode HPLC
untuk menguji GU, SL, MP dan PP yang merupakan campuran 1 dan AC, BX,
MP, dan PP yang merupakan campuran 2 dengan serapan yang tumpang tindih
(overlapping) pada spekro UV. Dalam berbagai percobaan penentuan senyawa uji
dalam campurannya dilakukan dengan cara konvensional, derivate dan metode
derivate ratio spektoofotometri tidak terlihat akibat adanya spektum tumpang
tindih yang kuat pada seluruh rentang panjang gelombang. Jadi HPLC dan PSL-1
atau metode kalibrasi PCR dapat digunakan untuk mengatasi masalah tersebut.
Metode yang diusulkan dapat mengurangi durasi dari analisis. Cara pengujiannya
mudah, sensitive, dan cocok untuk penentuan secara rutin dari senyawa campuran
yang telah dipelajari.
 BAB II

ISI

Ekperimental

2.1 Instrumentasi

Sebuah sinar ganda Shimadzu yang berasal dari spektrofotometer UV-

Visible, model UV-1601 PC dilengkapi dengan sel kuarsa 1 cm dan terhubung ke
komputer yang kompatibel dengan IBM. Printer inkjet HP 600 digunakan.
Perangkat lunak yang dibundel adalah perangkat lunak spektroskopi pribadi
UVPC versi 3.7. Bandwidth spektral adalah 2 nm dan kecepatan pemindaian
panjang gelombang adalah 2800 nm min − 1. Analisis PLS dan PCR dilakukan
menggunakan perangkat lunak PLS-Toolbox versi 2.1 PC untuk digunakan
dengan MATLAB5.

Instrumen HPLC (Shimadzu, Kyoto, Jepang) dilengkapi dengan pompa

seri LC-10 ADVP model, pengontrol sistem AVP SCL-10, DGU-12 A Degasser,
injektor Rheodyne 7725i dengan loop 20 µ l dan SPD-10AVP UV - Detektor,
pemisahan, dan kuantisasi ini dibuat pada kolom RP18 Shim-pack berukuran
250mm x 4.6mm (id) (ukuran 4.6 µmparticle). Detektor diatur pada λ 243 dan 245
nmuntuk campuran 1 dan 2, masing-masing. Akuisisi data dilakukan pada
perangkat lunak kelas VP

2.2 Bahan dan reagen

Pharmaceutical grade of GU (Sterllar Chemical Lab., India), SL (Hermes

Chemicals Co., India), AC (NEHTA Enterprise, India), BX (Ven Petrochem &
Pharma, India), MP (Clariant, Inggris) dan PP (Clariant) digunakan dan
disertifikasi mengandung 99.7,99.9, 99.7, 99.8, 99.9 dan 99.8%, masing-masing.
Asetonitril dan metanol yang digunakan adalah HPLC grade (BDH, Poole, UK).
Kalium dihidrogen fosfat, natrium hidroksida, asam klorida dan fosfat yang
digunakan adalah golongan analitik.

Kombinasi farmasi GU dengan SL, MP dan PP {Bronchovent syrup}

(Batch No. 427091), diproduksi oleh perusahaan MISR untuk industri farmasi
(Mataria, Kairo, Mesir). Setiap 5ml diberi label mengandung 50 mg GU, 2mg SL,
3mg MP dan 1,5 mg PP.

Kombinasi farmasi AC dengan BX, MP dan PP {Mucophylline syrup}

(Batch No. 401093), diproduksi oleh perusahaan MISR untuk industri farmasi
(Mataria, Kairo, Mesir). Setiap 5ml diberi label mengandung 100 mg AC, 4mg
BX, 4,5 mg MP dan 0,5 mg PP.
2.3 Prosedur
 Kondisi HPLC

Fase gerak untuk campuran 1 disiapkan dengan mencampurkan asetonitril

dan 0,05 M kalium dihidrogen fosfat (pH diatur sampai 4,3 menggunakan kalium
hidroksida) dalam rasio 60:40 (v / v). Fase gerak untuk campuran 2 disiapkan
dengan mencampur asetonitril dan 0,05 M kalium dihidrogen fosfat (pH telah
disesuaikan sampai 3 menggunakan asam fosfat) dalam rasio 50:50 (v / v), laju
alir 1,5 ml min − 1. Semua penentuan dilakukan pada suhu kamar.

 Solusi standar dan kalibrasi

Larutan stok untuk campuran 1. Larutan standar stok dari GU disiapkan

dengan melarutkan 50 mg GU dalam 100 ml metanol. Larutan standar stok SL,
MP, PP disiapkan dengan melarutkan secara terpisah 50 mg setiap senyawa dalam
100 ml metanol. Pengenceran lebih lanjut 10 ml masing-masing SL, MP solusi
dan 3 ml larutan PP untuk 100 ml dengan metanol dilakukan.

Larutan stok untuk campuran 2. Larutan standar stok AC disiapkan dengan

melarutkan 100 mg AC dalam 100 ml metanol 70%. Larutan stok BX, MPand PP
dibuat dengan melarutkan secara terpisah 50 mg setiap senyawa dalam 100 ml
metanol 70%. Pengenceran lebih lanjut 10 ml masing-masing BX, solusi MP dan
1 ml larutan PP hingga 100 ml dengan 70% metanol dilakukan.

Kalibrasi multivariat. Satu set pelatihan dari 25 campuran disiapkan

laboratorium dengan konsentrasi yang berbeda dari masing-masing senyawa
disiapkan oleh pengenceran larutan standar stok dengan 0,1M natrium hidroksida
untuk campuran 1 dalam kisaran konsentrasi 20-60? Gml? 1 untuk GU, 1-3µg −1
untuk SL, 1–5 µg ml − 1 untuk MP dan 0,6-1,8 µg ml− 1 untuk PP; dan
pengenceran larutan standar stok dengan asam hidroklorat 0,1M untuk campuran
2 dalam rentang konsentrasi 20–80? gml − 1 untuk AC, 1-5 µg ml− 1 untuk BX, 1–
5 µg ml − 1 untuk MP dan 0.2–1.8 µg ml − 1 untuk PP.

Spektrum absorpsi UV dicatat selama rentang panjang gelombang 232-300

nm dengan interval 0,8 nm untuk campuran 1 dan 235-275 nm dengan interval 0,4
nm untuk campuran 2. Perhitungan dibuat menggunakan perangkat lunak PLS-
Toolbox versi 2.1.

Model PLS-1 dan PCR diaplikasikan pada spektrum serapan UV

menggunakan empat variabel laten (atau komponen utama) untuk penentuan
komponen yang dipelajari dari campuran 1. Untuk campuran 2 PLS-1 diterapkan
menggunakan empat variabel laten untuk penentuan AC, BX dan lima variabel
laten untuk penentuan MP dan PP. Dalam PCR lima komponen utama digunakan
untuk penentuan AC, BX, MP dan PP.

Kalibrasi HPLC

Selanjutnya untuk pengenceran larutan stok setiap senyawa dibuat dengan

menggunakan mobile yang ditentukan fase gerak tertentu untuk mencapai rentang
konsentrasi 20-60 µg ml-1 untuk GU, 1-3 µg ml-1 untuk SL, 20-80 µg ml-1
untuk AC, 1-5 µg ml-1 untuk BX, 1-5 µg ml-1 untuk MP, dan 0,2-1,8 µg ml-1
untuk PP. Tiga rangkap suntikan sebanyak 20 µl dibuat untuk setiap konsentrasi
dan dikromatografi dibawah kondisi yang telah ditentukan. Nilai nilai daerah
puncak diplot terhadap konsentrasi sehingga diperoleh hubungan liniear.

 Persiapan sampel farmasi

Untuk campuran 1, Sebuah volume sirup setara dengan 50 mg dari GU, 2

mg dari SL, 3 mg dari MP dan 1,5 mg PP yang kemudian diencerkan dengan
metanol 100 ml. Selanjutnya pengenceran dilakukan dengan natrium hidroksida
0,1 M (untuk PLS-1 dan metode PCR) untuk mencapai rentang kalibrasi dari
setiap senyawa.

Untuk campuran 2, Volume sirup yang setara dengan 100 mg AC, 4 mg

dari BX, 4,5 MG dari MP dan 0,5 mg PP diencerkan dengan 70% metanol.
Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan asam klorida 0,1 M (untuk metode
PLS-1 dan PCR) atau fase gerak (metode HPLC) untuk mencapai kisaran
kalibrasi masing-masing senyawa.

Prosedur umum untuk PCR, PLS-1 dan HPLC merupakan metode yang
dijelaskan dibawah kalibrasi dan masing-masing senyawa dihitung.
2.4 Metode Validasi

 Linearitas

Linearitas dengan menggunakan metode HPLC dilakukan untuk

penentuan GU, SL, MP dan PP dalam campuran 1 sedangkan AC, BX, MP, dan
PP dalam campuran 2 yang dievaluasi dengan menganalisis serangkaian
konsentrasi yang berbeda dari masing-masing senyawa.

Studi ini menggunakan 7 konsentrasi yaitu 20 dan 60 µg/ ml untuk GU, 1

dan 3 µg/ ml untuk SL, 1 dan 5 µg/ ml untuk MP, 0,2 dan 1,8 µg/ ml untuk PP
dalam campuran 1, dan antara 20-80 µg/ ml untuk AC, 1 dan 5 µg/ ml untuk BX,
1 dan 5 µg/ ml untuk MP, 0,2 dan 1,8 µg/ ml untuk PP dalam campuran 2. Setiap
konsentrasi diulang tiga kali yang akan memberikan informasi tentang variasi
pada daerah puncak antara sampel konsentrasi yang sama. Tingginya nilai
kolerasi koefisien dan nilai intersep yang secara statistik (P < 0,05) berbeda dari
nol yang divalidasi linearitas dari grafik kalibrasi. (tabel 3)

 Presisi

Untuk evaluasi hasil yang presisi, kemampuan keberulangan dan presisi

intermediate ditunjukkan pada tiga level konsentrasi pada tiap senyawa. Data pada
setiap level konsentrasi dievaluasi dengan ANOVA satu arah. Pengujian
ditunjukkan selama 8 hari dengan 2 model replikasi. Perbandingan statistik pada
hasil yang didapatkan ditunjukkan menggunakan nilai P dari F-test. Tiga analisis
dengan beragam variasi dari tiap level konsentrasi dibuat. Karena nilai P pada F-
test selalu lebih besar dari 0,05, tidak terdapat perbedaan signifikan secara
statistik antara hasil yang diperoleh dari satu level pada satu hari ke hari lainnya
pada tingkat kepercayaan 95%.

 Rentang kalibrasi
 Rentang kalibrasi dilakukan untuk memberikan akurasi/keakuratan,
ketepatan dan hasil yang linear. Rentang kalibrasi yang digunakan pada metode
HPLC terdapat pada Tabel 3.

 Batas deteksi dan kuantitas

Menurut ICH, pendekatan dapat dilihat dari S.D terhadap respon dan
kemiringan dalam menentukan batas deteksi dan kuantitas. Nilai secara teoritis
dapat dilihat pada tabel 3.

 Selektivitas

Selektivitas dapat diketahui dengan menyiapkan 6 campuran senyawa

yang diuji pada beberapa konsentrasi dengan rentang linier untuk HPLC.
Sedangkan metode validasi PLS-1 dan PCR dicapai dengan evaluasi dari prediksi
2 model dari keenam campuran yang disiapkan. Campuran yang disiapkan di
laboratorium dianalisis berdasarkaan pada prosedur sebelumnya. Hasilnya
terdapat pada (tabel 4 dan 5), mengindikasi tingginya selektifitas dari metode
yang diusulkan untuk menentukan studi komponen dalam campuran.

 Keakuratan

Studi ini dilakukan dengan penambahan sejumlah komponen produk

farmasi yang telah diketahui konsentrasinya (standar). Hasil campuran dianalisis
dan dibandingkan dengan standar. Pada tabel 4 dan 5 terlihat hasil akurasi yang
baik dengan menggunakan metode penambahan standar ini.

 Ketahanan

Variasi pH fase gerak dari 0,05 M kalium dihidrogen fosfat dengan ± 0,2
dan kekuatan organik dari fase gerak dengan ± 2% tidak memiliki efek terhadap
resolusi kromatografi dalam metode HPLC. Variasi kekuatan natrium hidroksida
dan asam hidroklorat oleh ± 0,02 M tidak memiliki pengaruh yang signifikan
terhadap metode PLS-1 dan PCR.
  Analisis stabilitas

Stabilitas larutan analitik dari senyawa yang diteliti dengan fase gerak, 0,1
M natrium hidroksida dan 0,1 M asam hidroklorat tidak menunjukkan perubahan
Rf kromatografi atau absorbansi untuk 1 jam ketika disimpan pada suhu kamar,
dan selama 5 jam saat disimpan didinginkan pada 5 ◦C.

2.5 Metode analisis sediaan sirup

PLS-1, PCR dan HPLC diterapkan untuk penentuan secara simultan pada
GU, SL, MP dan PP; AC, BX, MP dan PP dalam sediaan sirup. Belum ada
metode yang ditemukan untuk penentuan simultan dari komponen dalam
campuran tersebut.

Maka hasil dari PCR, PLS-1 dibandingkan dengan HPLC. Perbandingan

statistik antara hasil yang dilakukan berkaitan dengan akurasi dan presisi
menggunakan Student t-test dan F-ratio pada tingkat kepercayaan 95% (Tabel 4
dan 5). Tidak ada perbedaan yang signifikan.
 BAB III

HASIL DAN DISKUSI

3.1. Fitur spektral

Gambar 1 dan 2 menunjukkan spektrum serapan UV GU dengan SL, MP

dengan PP; AC dengan BX, MP dengan PP, masing-masing pada konsetrasi yang
tertera. Seperti yang bisa dilihat, absorpsi spektrum UV dari GU, SL, MP dan PP
tumpang tindih; dan absorpsi spektrum UV pada AC tumpang tindih dengan BX,
MP dan PP. Penentuan spektrum dengan menggunakan metode spektrofotometri
konvensional tumpang tindih di sepanjang rentang panjang gelombang. Metode
kalibrasi HPLC dan PLS-1 atau PCR dapat digunakan untuk mengatasi masalah
ini.

Gambar 1. Spektrum serapan UV Gambar 2. Spektrum serapan UV acephiline

guaiphensin 50 µg/ml, salbutamol sulfate 2 piperazine 40 µg/ml, bromheksin hidroklorida
μg/ml, methylparaben 3 μg/ml dan 1,6 μg/ml, methylparaben 1,8 μg/ml dan
propylparaben 1,5 μg/ml dalam 0,1 M propylparaben 0,2 μg/ml dalam 0,1 M asam
natrium hidroksida. hidroklorida.
3.2. Kalibrasi multivarian
Untuk meningkatkan analisis digunakan dua pendekatan kemotropik yaitu
PLS-1 dan PCR

 Matriks kalibrasi dan pemilihan zona spektral untuk analisis PLS-I dan
PCR

Kualitas analisis multikomponen bergantung pada rentang panjang gelombang

dan mode spektral yang digunakan. Prosedur PLS dirancang untuk menjadi
prosedur komputasi spektrum penuh, sehingga pemilihan panjang gelombang
tampaknya tidak perlu, sehingga semua panjang gelombang yang tersedia sering
digunakan. Namun, pengukuran dari panjang gelombang spektral yang tidak
informatif dalam model menurunkan kinerja. Spektrum asli dan direkonstruksi
dari matriks kalibrasi dibandingkan untuk memilih rentang panjang gelombang.
Rentang ini diperoleh oleh semua daerah di mana perbedaan antara masing-
masing komponen campuran dan yang lainnya adalah maksimum. Selain itu,
daerah di mana masing-masing komponen campuran direkonstruksi terbaik juga
dipertimbangkan. Kisaran panjang gelombang 232-300 nm dengan interval 0,8
nm dipilih untuk campuran 1 dan rentang panjang gelombang 235-275 nm dengan
interval 0,4 nm dipilih untuk campuran 2. Panjang gelombang kurang dari 232
atau 235 nm untuk campuran 1 dan 2, masing-masing, tidak digunakan karena
terjadi perbedaan antara campuran sirup farmasi yang dibuat dengan sampel, dan
panjang gelombang lebih dari 300 atau 275 nm untuk campuran 1 dan 2, masing-
masing, tidak digunakan karena GU dan SL dalam campuran 1 dan BX, PP dalam
campuran 2 tidak terjadi penyerapan pada konsentrasi yang digunakan di wilayah
ini. Jadi, nilai absorbansi yang diperoleh pada panjang gelombang ini akan
menimbulkan kebisingan dalam matriks kalibrasi, sehingga menurunkan presisi

Desain multilevel multifactor digunakan untuk konstruksi set kalibrasi.

Satu set kalibrasi dari 25 sampel disiapkan untuk kalibrasi. Sebuah desain
kalibrasi lima-tingkat, empat-faktor digunakan dalam konsentrasi yang berkisar
antara 20 dan 60 µg/ml untuk GU, 1 dan 3 µg/ml untuk SL, 1 dan 5 µg/ml untuk
MP, dan 0,6 dan 1,8 µg/ml untuk PP dalam campuran 1; dan antara 20 dan 80
µg/ml untuk AC, 1 dan 5 µg/ml untuk BX, 1 dan 5 µg/ml untuk MP, dan 0,2 dan
1,8 µg/ml untuk PP dalam campuran 2. Rincian konsentrasi diberikan pada Tabel
1 dan 2.

 Pemilihan jumlah faktor optimal

Pilihan yang tepat untuk jumlah komponen utama atau faktor diperlukan
untuk kalibrasi PCR dan PLS-1. Jumlah faktor harus sebanyak mungkin untuk
data eksperimen. Berbagai kriteria telah dikembangkan untuk memilih jumlah
optimal. Metode validasi silang menggunakan satu sampel pada satu waktu.
Konsentrasi yang diprediksi dibandingkan dengan konsentrasi senyawa yang
sudah diketahui dalam setiap sampel kalibrasi.
Rumus :

𝑃𝑅𝐸𝑆𝑆
RMSECV = √ , dimana n adalah jumlah sampel dalam percobaan.
𝑛

Rumus RMSECV digunakan sebagai diagnostik untuk memeriksa

kesalahan dalam konsentrasi yang diprediksi yang dapat menunjukkan presisi dan
akurasi dari senyawa yang diprediksi. Rumus tersebut dihitung ulang atas
penambahan setiap faktor baru untuk model PLS-I dan PCR.

Evaluasi kemampuan prediksi dari model dilakukan dengan memplot konsentrasi

aktual yang diketahui terhadap konsentrasi yang diprediksi. Nilai koefisien
korelasi yang baik antara konsentrasi sebenarnya dan yang diprediksi adalah
untuk mengoptimalkan PLS-1 dan PCR. Tabel 3 menunjukkan kemampuan
prediksi yang baik pada model. RMSECV diperoleh dengan mengoptimalkan
matriks kalibrasi dari spektrum serapan untuk PLS-1 dan metode PCR
ditunjukkan pada Tabel 6 menunjukkan akurasi yang baik dan presisi.
Jumlah faktor optimum dipilih dengan mengikuti kriteria dari Haaland
dan Thomas. Model yang dipilih yaitu dengan jumlah factor terkecil sedemikian
rupa sehingga RMSECV untuk model tersebut tidak lebih besar dari RMSECV
dari model dengan penambahan factor. N dengan jumlah factor 4 merupakan n
yang optimum untuk campuran 1 dengan menggunakan PLS-1 dan PCR.
Sedangkan untuk campuran 2PLS-1 diaplikasikan menggunakan 4 variabel
tersembunyi. Untuk penentuan AC, BX. menggunakan 5 variabel tersembunyi
untuk penentuan MP dan PP, sementara PCR diterapkan untuk penentuan AC,
BX, MP, dan PP, dengan menggunakan 5 komponen.

PLS-1 memiliki keuntungan terbesar ketika menganalisis dengan

konsentrasi dan absorbansi yang bervariasi. Hal ini jelas terlihat dalam campuran
2, dimana konsentrasi PP dan absorbansi relative rendah terhadap komponen lain
dari campuran 2, sehingga diprediksi PLS-1 lebih baik dari pada PCR untuk
prediksi PP dalam campuran 2 .

3.3 Metode HPLC

Metode HPLC yang dikembangkan telah diterapkan secara bersamaan

untuk penentuan GU, SL, MP, dan PP (Campuran 1) AC, BX, MP, dan PP
(Campuran 2). Dilakukan optimisasi pada komposisi fase gerak dan penggunaan
pH. Pemisahan terbaik diperoleh dengan fase gerak asetonitril 0,05 M dan Kalium
dihidrogen fosfat dengan perbandingan (60:40 v/v) untuk campuran 1, dan (50:50
v/v) untuk campuran 2. Dengan meningkatkan konsentrasi Asetonitril lebih dari
75% menyebabkan pemisahan yang tidak memadai, dari 4 puncak di setiap
campuran. Pada konsentrasi asetonitril yang rendah (<35%) pemisahan dapat
terjadi, tetapi dengan tailing yang berlebihan dan waktu retensi yang meningkat
untuk puncak PP pada campuran 1, puncak PP dan BX pada campuran 2. Variasi
pH dari 0,05 Pottasium dihidrogen fosfat dari fase gerak untuk campuran 1
menghasilkan factor kapasitas maksimum (K1) dengan nilai pH 6,5. Dilakukan
pengamatan pada 4 senyawa pada pH 3-5. Namun pada pH 4,3 masih diamati
resolusi optimum dengan waktu retensi yang rasional. Variasi pH 0,05 kalium
dihidrogen fosfat dari fase gerak campuran 2 menghasilkan nilai faktor kapasitas
maksimum pada pH 6.0, pada pH 2,5-4 terjadi peningkatan resolusi untuk empat
puncak yang diamati. Namun, pada pH 3 resolusi optimal dengan retensi yang
rasional saat diamati.
 Kuantifikasi berdasarkan area puncak dicapai dengan deteksi UV pada 234
nm dan 245nm masing-masing untuk campuran 1 dan 2. Penggunaan metode
HPLC dilakukan khusus seperti pada gambar 3 dan 4 dimana pemisahan lengkap
dari empat senyawa dari masing-masing campuran yang diamati.

Gambar 3. Kromatogram HPLC dari 20 µl injeksi
sampel sirup mengandung yang 50 µg ml −1 dari
guaiphensin (GU), 2 µgml − 1 salbutamol (SL), 3
µg ml − 1 methylparaben (MP) dan 1,5 µgml − 1 dari
propylparaben (PP).
Gambar 4. Kromatogram HPLC dari 20 µl injeksi
sampel sirup mengandung yang 40 µg ml −1 dari
acephylline piperazine (AC), 1,6 µgml − 1
bromhexine hidroklorida (BX), 1,8 µg ml − 1
methylparaben (MP) dan 0,2 µgml − 1 dari
propylparaben (PP).

Rata-rata standar deviasi waktu retensi ditemukan menjadi 1,7±0,02;

2,3±0,04; 3±0,04; 4,1 ±0,03 untuk SL, GU, MP, dan PP masing-masing dalam
campuran 1 dan 16 ± 0,02; 3,2±0,03; 5,8±0,04; 6,5±0,02 menit untuk AC, MP,
PP, dan BX, masing-masing dalam campuran 2 untuk 10 kali pengulangan.

Untuk menentukan linearitas respon detektor HPLC, standar kalibrasi

untuk setiap senyawa disiapkan seperti yang dijelaskan dalam text. Korelasi linear
diperoleh antara konsentrasi area puncak masing-masing senyawa. Karakteristik
parameter untuk persamaan regresi dari metode HPLC diberikan pada table 3.
 BAB IV

KESIMPULAN

Untuk tujuan analitis selalu ditetapkan metode yang mampu menganalisis

sejumlah besar sampel dalam jangka waktu singkat dengan akurat dan presisi
yang dapat diterima. Spektroskopi merupakan spektrum yang dapat menghasilkan
sejumlah besar data analisis yang singkat. Namun, ketika digabungkan dengan
alat kemometrik, kualitas informasi spektral bisa benar-benar meningkat,
menjadikan alat gabungan ini menjadi alat analitis yang tepat dan cocok. Studi
komparatif tentang penggunaan HPLC dan kalibrasi multivarian (PLS-1 dan PCR)
sebagai metode untuk resolusi GU, SL, MP dan PP (campuran 1); AC, BX, MP
dan PP (campuran 2) dapat dicapai, dan menunjukkan bahwa metode kalibrasi
multivariat yang di dukungan perangkat lunak dapat menghasilkan resolusi tinggi
dari alat ini. Meskipun metode HPLC lebih spesifik daripada metode kalibrasi
multivariat, tapi metode HPLC membutuhkan peralatan dan material yang mahal.
Metode kalibrasi multivariasi lebih murah dan tidak memerlukan instrumentasi
canggih untuk proses pemisahan. Metode HPLC, PLS-1 dan PCR ini dapat
menetukan GU, SL, MP dan PP; AC, BX, MP dan PP dalam sirup komersial.
 DAFTAR PUSTAKA

L.Q. Zhang, X.H. Wu, X. Tang, X.L. Zhu, W.T. Su, Fenxi Kexue Xuebao
18 (2002) 318–320.

L.Q. Zhang, X.H. Wu, X. Tang, X.L. Zhu, W.T. Su, Guangpuxue Yu
Guangpu Fenxi 22 (2002) 427–429.

K.P.R. Shenoy, K.S. Krishnamurthy, I.Vasundhara, Indian Drugs 38

(2001)

428–432.

V.V. Vaidya, M. Khanolkar, J.N. Gadre, Indian Drugs 38 (2001) 16–20.

M. Vasudevan, S. Ravisankar, A. Sathiyanarayanan, R.S. Chandan, J.

Pharm. Biomed. Anal. 24 (2000) 25–31.

M. Vasudevan, S. Ravisankar, M. George, J. Ravi, Indian Drugs 37 (2000)

489–492.

T. Chen, J.R. Pacifico, R.E. Daly, J. Chromatogr. Sci. 26 (1988) 636–639.

H.P. Cao, D.R. Wang, X.J. Song, Yaowu Fenxi Zazhi 19 (1999) 397–399.

G. Indrayanto, A. Sunarto, Y. Adriani, J. Pharm. Biomed. Anal. 13 (1995)

1555–1559.

Y. Wang, Sepu 17 (1999) 268–270.

V.G. Nayak, V.B. Malkar, C.D. Gaitonde, A.J. Vaidya, M.G. Gangrade,
Drug Dev. Ind. Pharm. 20 (1994) 1485–1491.

G.A. Jacobson, G.M. Peterson, J. Pharm. Biomed. Anal. 12 (1994) 825–

832.

A. El-Gindy, S. Emara, G.M. Hadad, IL Farmaco 58 (2003) 377.

M.E. Ribone, A.P. Pagani, A.C. Olivieri, J. Pharm. Biomed. Anal. 23

(2000) 591–595.

H.C. Goicoechea, A.C. Olivieri, Talanta 49 (1999) 793–800.

G. Bazylak, L.J. Nagels, J. Pharm. Biomed. Anal. 32 (2003) 887–903.

 J.J. Berzas Nevado, G. Castaneda Penalvo, F.J. Guzman Bernardo, Anal.
Chim. Acta 442 (2001) 241–248.

K.O. Chu, K.C. Tin, Anal. Lett. 31 (1998) 1879–1890.

J.P. Rauha, H. Salomies, M. Aalto, J. Pharm. Biomed. Anal. 15 (1996)

287–293.

R. Cai, Y. Zhou, M. Ye, C. Xia, Zhongguo Yiyao Gongye Zazhi 24 (1993)

309–311.

Q. Tu, Yaowu Fenxi Zazhi 13 (1993) 122–123.

B.M. Wise, N.B. Gallagher, PLS-Toolbox Version 2.1, Eigenvector

Research, Inc., 830 Wapato Lake Road, Manson, WA 98831, 2000.

M. Blanco, J. Coello, F. Gonzalez, H. Iturriaga, S. Maspoch, J. Pharm. Sci.

82 (1993) 834–837.

R.G. Brereton, Analyst 122 (1997) 1521–1529.

H. Martens, T. Naes, Multivariate Calibration, Wiley, Chichester, 1989.

A. Espinosa-Mansilla, F. Salinas, I. De Orbe Paya, Anal. Chim. Acta 313

(1995) 103–112.

D.M. Haaland, E.V. Thomas, Anal. Chem. 60 (1988) 1193–1202.

The European Agency for the Evaluation of Medical Products. ICH Topic
Q2B Note for Guidance on Validation of Analytical Procedures: Methodology
GPMP/ICH/281/95, 1996.
DAFTAR TABEL