Validación Hierro en Alimentos

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN Y NUTRICION
DIRECCIÓN EJECUTIVA DE CIENCIA Y TECNOLOGIA

DE ALIMENTOS - DECYTA
“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”
“Año de la Universalización de la Salud”
INFORME TÉCNICO
VALIDACIÓN DE MÉTODO
DETERMINACIÓN DE HIERRO EN ALIMENTOS
PREPARADOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE
ABSORCIÓN ATÓMICA
ELABORADO POR:
FERNANDO ABRAHAM BERROSPI CASANO
ÁREA DE EQUIPOS DE ALTA TECNOLOGÍA
LABORATORIO DE QUÍMICA
DECYTA
CENAN
FEBRERO DEL 2020
1

“Año de la Universalización de la salud”
I. PLAN DE TRABAJO
2

1. OBJETIVO.
Establecer el plan de actividades para el estudio de validación del método espectrofotométrico de

absorción atómica, para la determinación cuantitativa de hierro en alimentos preparados.
2. MÉTODO DE ENSAYO.
Se describe en el anexo A
Referencia: Asean Manual of Food Analysis (2011). Determination of Iron, Cupper and Zinc.
3. EQUIPAMIENTO.
3.1 Equipos a emplear:
3.1.1 Espectrofotómetro de absorción atómica

3.1.2 Balanza analítica
3.1.3 Campana extractora de gases
3.1.4 Purificador de agua
3.1.5 Horno Mufla
3.1.6 Plancha de calentamiento
3.1.7 Refrigeradora
3.2 Reactivos:
3.2.1 Estándar de hierro de 1000 mg/L.

3.2.2 Ácido clorhídrico al 37% p.a
3.2.3 Ácido nítrico al 65% p.a
3.2.4 Agua ultrapura
3.3 Materiales:
3.3.1 Kit de masas patrón (calibrado)

3.3.2 Lámpara de cátodo hueco de hierro
3.3.3 Embudo de filtración, de vidrio, de vástago corto
3.3.4 Matraces de un solo trazo, de vidrio, de 1000 mL, 100 ml y 50 mL de capacidad (calibrados o verificados)
3.3.5 Micropipeta de volumen variable (calibradas)
3.3.6 Vasos de precipitado, de vidrio, de capacidad variable
3.3.7 Probeta de vidrio de 100 mL de capacidad
3.3.8 Puntas (tips) para micropipetas
3.3.9 Papel de filtro whatman Nº42 o equivalente
3.3.10Embudos de vidrio
3.3.11 Espátula
3.3.12Bagueta
3.3.13Propipeta
3.3.14Piseta
3.3.15Pipeta lineal graduada, clase A, de vidrio, de 10mL
3

3.3.16Pipetas volumétricas, clase A, de vidrio, de 5 y 10mL

3.3.17Matraces Erlenmeyer de vidrio de 125ml
3.3.18Cápsula de porcelana con pico de aproximadamente 80mm de diámetro
3.3.19Elementos de protección personal: Mandil, guantes de nitrilo, guantes para protección del calor, lentes, etc.
3.3.20Bolsas de material plástico.
3.3.21Lunas de reloj de aproximadamente 10cm de diámetro
3.3.22Pinzas de metal de aproximadamente 30 y 50cm de largo.
4. PERSONAL PARTICIPANTE
Nº Nombres Responsabilidades
Selección del método de ensayo, materiales de
4.1 Quim. Fernando Berrospi C. ensayo, elaboración del plan de trabajo, evaluación
estadística de resultados, elaboración del informe final
4.2 Téc. Isabela Trujillo Ensayos de reproducibilidad (precisión)
4.3 Téc. Giobana Bernal B. Preparación de muestras
Revisión del plan de trabajo, revisión de resultados,
4.4 Quim. Silvia Robles C. entrega del informe final para su aprobación al área de
sistema de gestión de la calidad
5. MATRICES DE ENSAYO:
5.1 Arverja partida con seco de pollo y arroz (MUESTRA 1)

5.2 Carbonada de zapallo con hígado de pollo y arroz (MUESTRA 2)
5.3 Locro de zapallo con sangrecita y arroz (MUESTRA 3)
6. PARÁMETROS A DESARROLLAR:
6.1 Precisión (repetibilidad y reproducibilidad)

6.2 Veracidad (Adición de estándar)
6.3 Linealidad (curva de calibración a bajas y altas concentraciones)
6.4 Límite de detección – LDD
6.5 Límite de cuantificación – LDC
6.6 Sensibilidad
6.7 Robustez
7. DISEÑO EXPERIMENTAL:
7.1 Ensayo de precisión
ANALISTA DÍA-1 DÍA-2 DÍA-3
ANALISTA 1 MUESTRA-3 MUESTRA-1 MUESTRA-2
ANALISTA 2 MUESTRA-1 MUESTRA-2 MUESTRA-3
4

7.2 Ensayo de veracidad
Adición de estándar de 3 mg/100g, 5 mg/100 g y 8 mg/100g de hierro.
Nivel de Nivel de Nivel de

concentración 1 concentración 2 concentración 3
Matriz Carbonada de zapallo con hígado de pollo y arroz (Muestra 2)
Cantidad añadida (mg/100g) 3 5 8
Número mínimo de repeticiones
06 06 06
en muestras independientes
7.3 Ensayo de linealidad.
Curva de calibración (0.10 mg/L a 2.5 mg/L)
Niveles de Número de repeticiones por

concentración nivel
C0: 0.10 mg/L 03
C1: 0.50 mg/L 03
C2: 1.00 mg/L 03
C3: 1.50 mg/L 03
C4: 2.00 mg/L 03
C5: 2.50 mg/L 03
7.4 Ensayo de robustez.
Nº Factor Original Propuesto

1 Peso de muestra 2g 3g
2 Tiempo de calcinación 6h 5h
3 Temperatura de la mufla 550oC 600oC
Aplicar el diseño factorial de Youden Steiner para identificar el número de ensayos con los factores
originales del método y los propuestos en la prueba de robustez:
Factor Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo

1 2 3 4 5 6 7 8
1 2g 2g 2g 2g 3g 3g 3g 3g
2 6h 6h 5h 5h 6h 6h 5h 5h
3 550oC 600oC 550oC 600oC 550oC 600oC 550oC 600oC
Los análisis para este estudio serán realizados a la muestra: “Carbonada de zapallo con hígado de pollo y
arroz” (muestra 2).
7.5 Límite de detección (LDD) y límite de cuantificación (LDC).
5

Preparación de 10 blancos, que serán considerados como el blanco del sistema, que pasarán por todo el
procedimiento del método y se leerán en el espectrofotómetro.
La fórmula de cálculo para el límite de detección (LDD), es la siguiente:
Donde:
Xbl: Promedio de blancos
k: 3 (factor numérico elegido para el nivel de confianza del 99%)
Sbl: Desviación estándar de las 10 mediciones del blanco
La fórmula de cálculo para el límite de cuantificación (LDC), es la siguiente:
Donde:
Xbl: Promedio de blancos
k: 10 (factor numérico elegido para el nivel de confianza del 99%)
Sbl: Desviación estándar de las 10 mediciones del blanco
7.6 Sensibilidad
Es la pendiente de la recta de calibración, está relacionada con la linealidad y obedece a la ecuación

siguiente:
y  mx   0
Donde:
Es el valor de la señal de absorbancia

Es la pendiente de la curva de calibración (sensibilidad)
Es la concentración del estándar de sodio (ug/mL)
Es la intersección de la recta de calibrado con el eje de las abscisas.
8. CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:
6

8.1 Precisión.
Pruebas de consistencia Pruebas de Cochran y

Criterio de evaluación
h y k de Mandel Grubbs
Mandel h: 1,15 (al 1%) Cochran: 0,8534 (al 5%)
Mandel k: 1,46 (al 1%) Cochran: 0,9172 (al 1%)
Criterio de aceptación
Mandel h: 1,15 (al 5%) Grubbs: p>0.05 (Software
Mandel k: 1,34 (al 5%) Minitab 18)
ISO 5725-2: Accuracy (trueness and precision) of
measurement methods and results — Part 2: Basic
method for the determination of repeatability and
Referencia reproducibility of a standard measurement method.
AOAC Official Method of Analysis (2016). Appendix
F. Guidelines for Standard Method Performance
Requirements.
8.2 Veracidad.
Criterio de evaluación Recuperación promedio

Criterio de aceptación Recuperación: 80% a 110 % (a concentraciones menores a 100ppm)
AOAC Official Methods of Analysis (2016). Appendix F Guidelines for
Referencia: Standard Method Performance Requirements. Table A5. Expected recovery
as a function of analyte
8.3 Linealidad
Criterio de evaluación - Hallar la ecuación de la regresión, el coeficiente de correlación y los

intervalos de confianza para la pendiente y el intercepto
- Verificar con test de normalidad, la aproximación a la distribución normal
(test de Anderson y homogeneidad de varianza de los residuales*
-Verificar si el Modelo de Regresión es aceptable y si el modelo es lineal,
mediante prueba de hipótesis.
-Evaluar el coeficiente de la regresión (r) mediante el estadístico t de
student.
Criterio de aceptación
Coeficiente de correlación debe ser mayor a 0,995
Referencia AEFI. Validación de métodos analíticos.2001.
8.4 Límite de cuantificación (LDC).
Criterio de
evaluación/criterio de Propio del método de Ensayo
aceptación
Referencia: AOAC Official Methods of Analysis (2016). Appendix F Guidelines for
Standard Method Performance Requirements. Table A3. Recommendations
for Evaluation
8.5 Límite de detección (LDD)
7

Criterio de
evaluación/criterio de Propio del método de Ensayo
aceptación
Referencia: AOAC Official Methods of Analysis (2016). Appendix F Guidelines for
Standard Method Performance Requirements. Table A3. Recommendations
for Evaluation
8.6 Sensibilidad
Sensibilidad Propio del método de Ensayo
8.7 Robustez
Criterio de evaluación Diferencia entre el promedio de los ensayos de cada factor

Criterio de aceptación La diferencia entre el promedio de los ensayos de cada factor, según diseño
Youden < 2,24 sr
Referencia Quattrochi O. Introducción a la HPLC. Aplicación y Práctica. Capítulo 12.
Validación de Métodos.
Factor Método Propuesta Efecto

Un mayor peso de
Peso de muestra 2g 3g muestra es
representativo
Un menor tiempo de
Tiempo de calcinación 6h 5h
análisis ahorra energía
Una mayor temperatura
permite mejor
Temp. De la mufla 550OC 600OC
calcinación de la
muestra
9. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Actividades a realizar Fecha
Selección y adquisición de muestras 20 de enero del 2020
Ensayo de veracidad 30 de enero del 2020
Ensayo de precisión 28, 29 y 30 de enero del 2020
Ensayo de linealidad 27 de enero del 2020
Ensayo de robustez 31 de enero del 2020
Ensayo de Límite de Detección y Límite de Cuantificación 25 de enero del 2020
8

INFORME DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO:

II.
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HIERRO EN
ALIMENTOS PREPARADOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA
DE ABSORCIÓN ATÓMICA
1. Objetivo.
Determinar las características de performance del método de determinación de hierro por espectrofotometría
de absorción atómica.
9

2. Definiciones
2.1 hierro: El hierro es un mineral necesario para el crecimiento y el desarrollo del cuerpo. Es el oligoelemento más
abundante del organismo, es un componente de la hemoglobina responsable del trasporte del oxígeno de los
pulmones a las distintas partes del cuerpo. El hierro también es esencial en la elaboración de hormonas y los tejidos
conectivos.
La principal consecuencia derivada de la falta de hierro es la anemia. Ésta se produce cuando el cuerpo agota el
hierro contenido en algunos de sus órganos como los músculos o el hígado. Los glóbulos rojos comienzan a reducir
su tamaño provocando que la sangre transporte menos oxígeno desde los pulmones. Esto puede provocar
cansancio, trastornos intestinales, falta de memoria, o mayor facilidad para contraer infecciones.
3. Analitos a determinar: hierro (mg/100 g)
4. Matrices o muestras de ensayo:
4.1 Alimentos preparados (Arverja partida con seco de pollo y arroz, Carbonada de zapallo con hígado de
pollo y arroz, locro de zapallo con sangrecita y arroz)
4.2 Preparación de las muestras de ensayo:
4.2.1 Se molió aproximadamente 250g de comida preparada en un equipo procesador de alimentos para
lograr la homogeneización completa de la muestra. Luego, se eligió una porción de muestra representativa y
fue repartida en bolsas, cada porción fue rotulada y colocada en frascos para finalmente ser almacenadas
bajo congelación (a -20oC) de tal manera que no se produzcan cambios en su composición.
5. Método de ensayo:
MET-CENAN-DECYTA-…Determinación de hierro en Alimentos preparados. Método espectrofotométrico de

absorción atómica. (Anexo A)
6. Equipamiento.
6.1 Equipos empleados:
10

Código
Nº Equipo Marca Modelo Serie Evidencia Fecha
interno
Espectrofotométro de Thermo Informe de Verificación
1 Q/SPAA 02 2019-11-07
absorción atómica Scientific Ice 3000 AAO1121903 Operacional
Certificado de calibración:
2 Balanza analítica Mettler AE 260-S L28676 Q/BAL 03 2018-12-11
MC-1548-2018 (*)
Campana extractora de Mantenimiento:
3 Shicar ----- ----- Q/CAMH 02 2019-06-12
gases NºOTM RS-0016-P02
Verificación operacional:
TC-0001562 VOP: 2019-11-14
5 Purificador de agua Elga LA 621 TNK00003645 Q/PURA 03
Mantenimiento: MANT: 2019-10-10
NºOTM RS-009-P06
Calibración:
Calibración:
TC-0995-2018
Thermo 2018-12-03
6 Mufla F30420C-33 ----- Q/MUF 004 Mantenimiento:
Scientific Mantenimiento:
NºOTM RS-0018-P-07
2019-10-25
Plancha de Thermo C1768140730 Mantenimiento: OTM Nº RS-
7 SP131320-33Q Q/PLAC 12 2019-10-24
Calentamiento Scientific 969 0014-P07
Mantenimiento:
OTM Nº MP-132
Barnstead/ MANT: 2018-11-05
8 Refrigeradora KANS58A40J/03 0300203292 Q/REF 04 Certificados de calibración:
Thermolyne CAL: 2019-01-22/23
TC-0072-2019/
TC-0071-2019
(*) Comprobación intermedia: 12-12-2019
6.2 Reactivos:
6.2.1 Estándar de hierro de 1000mg/L. Marca: Merck. Lote: HC86803426. Feche de vencimiento: 2021-08-31
6.2.2 Ácido Nítrico al 65% p.a. Marca: Merck. Lote: k503934956. Fecha de vencimiento: 2021-06-30
6.2.3 Ácido Clorhídrico al 37% p.a. Marca: Merck. Lote: k49937317. Fecha de vencimiento: 2023-02-28
6.2.4 Agua ultrapura
6.3 Materiales:
6.3.1 Kit de masas patrón clase E2. Código interno: Q/PP E2. Marca: Sartorius. Serie: 27529419
6.3.2 Equipo de filtración al vacío.
6.3.3 Lámpara de cátodo hueco de hierro
6.3.4 Matraces de un solo trazo, de vidrio, de 1000 mL (verificado).
6.3.5 Matraces de un solo trazo, de vidrio de 100 mL de capacidad
6.3.6 Matraces de un solo trazo, de vidrio, de 50 mL de capacidad
6.3.7 Micropipeta de volumen variable de 100 uL a 1000 uL. Código interno: Q/MIC-HP-18. Marca: Thermo
Scientific: Serie: JH83167. Certificado de calibración: MV-1889-2019. Fecha de calibración: 2019-10-23.
6.3.8 Micropipeta de volumen variable de 1 mL a 5 mL. Código interno: Q/MIC-AA-09. Marca: Thermo Scientific.
Serie: ZX42807. Certificado de calibración: MV-1004-2019. Fecha de calibración: 2019-06-06.
6.3.9 Micropipeta de volumen variable de 10 uL a 100 uL. Código interno: Q/MIC-AA-03. Marca: Eppendorf.
Serie: 068215. Certificado de calibración: MV-1006-2019. Fecha de calibración: 2019-06-06.
6.3.10Vasos de precipitado, de vidrio, de capacidad variable
6.3.11 Probeta de vidrio de 100 mL de capacidad
6.3.12Puntas (tips) para micropipetas
6.3.13Papel de filtro whatman Nº42 o equivalente
6.3.14Embudos de vidrio
6.3.15Espátula
6.3.16Bagueta
6.3.17Bombilla
6.3.18Pizeta
11

6.3.19 Cápsula de porcelana con pico de aproximadamente 80mm de diámetro

6.3.20Matraces Erlenmeyer de vidrio de 125ml
6.3.21Lunas de reloj de aproximadamente 10cm de diámetro
6.3.22Pinzas de metal de aproximadamente 30 y 50cm de largo
6.3.23Elementos de protección personal: Mandil, guantes de nitrilo, guantes para protección del calor, lentes, etc.
Bolsas de material plástico
7. RESULTADOS:
7.1 PRECISIÓN
12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

Con ayuda del gráfico

mostrado, se puede
hallar el límite de
Repetibilidad del
método dentro del
rango de trabajo al
99.5% de confianza
7.2 VERACIDAD
29

7.3 LINEALIDAD
30

31

32

33

7.4 LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
34

7.5 SENSIBILIDAD
Fue estimada como la pendiente de la curva de linealidad, es la variación en la absorbancia debido a la

variación de la concentración:
SENSIBILIDAD=0.1161 unidades
7.6 ROBUSTEZ
35

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DIRECCIÓN EJECUTIVA DE CIENCIA Y TECNOLOGIA

FEBRERO DEL 2020

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

Establecer el plan de actividades para el estudio de validación del método espectrofotométrico de

3.1 Equipos a emplear:

3.1.1 Espectrofotómetro de absorción atómica

3.2.1 Estándar de hierro de 1000 mg/L.

3.3.1 Kit de masas patrón (calibrado)

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

3.3.16Pipetas volumétricas, clase A, de vidrio, de 5 y 10mL

5.1 Arverja partida con seco de pollo y arroz (MUESTRA 1)

6.1 Precisión (repetibilidad y reproducibilidad)

7.1 Ensayo de precisión

ANALISTA DÍA-1 DÍA-2 DÍA-3

ANALISTA 1 MUESTRA-3 MUESTRA-1 MUESTRA-2

ANALISTA 2 MUESTRA-1 MUESTRA-2 MUESTRA-3

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

7.2 Ensayo de veracidad

Adición de estándar de 3 mg/100g, 5 mg/100 g y 8 mg/100g de hierro.

Nivel de Nivel de Nivel de

7.3 Ensayo de linealidad.

Curva de calibración (0.10 mg/L a 2.5 mg/L)

Niveles de Número de repeticiones por

7.4 Ensayo de robustez.

Nº Factor Original Propuesto

Factor Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo Ensayo

7.5 Límite de detección (LDD) y límite de cuantificación (LDC).

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

La fórmula de cálculo para el límite de cuantificación (LDC), es la siguiente:

Es la pendiente de la recta de calibración, está relacionada con la linealidad y obedece a la ecuación

Es el valor de la señal de absorbancia

8. CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

Pruebas de consistencia Pruebas de Cochran y

Criterio de evaluación Recuperación promedio

Criterio de evaluación - Hallar la ecuación de la regresión, el coeficiente de correlación y los

8.4 Límite de cuantificación (LDC).

8.5 Límite de detección (LDD)

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

Sensibilidad Propio del método de Ensayo

Criterio de evaluación Diferencia entre el promedio de los ensayos de cada factor

Factor Método Propuesta Efecto

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

INFORME DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO:

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

3. Analitos a determinar: hierro (mg/100 g)

4. Matrices o muestras de ensayo:

4.2 Preparación de las muestras de ensayo:

MET-CENAN-DECYTA-…Determinación de hierro en Alimentos preparados. Método espectrofotométrico de

6.1 Equipos empleados:

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

6.3.19 Cápsula de porcelana con pico de aproximadamente 80mm de diámetro

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

“Decenio de la Igualdad de Oportunidades para Mujeres y Hombres”

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