GEL AGAROSE | BIOTEKNOLOGI

TUJUAN

1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.

2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.

DASAR TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul
khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode
yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di
laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF).
Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui,
molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di
bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan
massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada
medium berisi tenaga listrik. Molekul- molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub
negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang
bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul
yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negative (katoda) (Klug and Cummings,
1994). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan
dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai
metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat
setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999). Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran
laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan
suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing- masing terdiri atas molekul DNA dengan
panjang yang sama (Campbell dkk, 2002). Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis
DNA, yaitu:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan

menganalisis hasil ekstensi primer.

2. Gel alkalin agarosa , berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang
digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar (Davis dkk. 1994). Biasanya, gel agarosa digunakan
untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan
untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat
ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relative tergantung
pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang
digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA
bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul
yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki
gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel
agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang
lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi,
di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat
memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010). Namun,
fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena
tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa,
sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel.
Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi
fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk
alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak
lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:

1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.

2. Tray : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.

3. Chamber : digunakan sebagai wadah gel agarose.

4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis (Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik
dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari
DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk
memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).

ALAT DAN BAHAN

ALAT

1. Satu set alat elektroforesis

2. Mikropipet dan tip

3. Gel Doc

4. Power Supply

5. Parafilm

BAHAN
1. DNA Marker

2. Produk DNA

3. Ethidium Bromide (EtBr)

4. dd H2 O

5. Gel Agarose

6. Loading Buffer (Loading dye)

7. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)

8. Akuades

CARA KERJA

Pembuatan Gel Agarose

0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE .

Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan.

Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu ±50°C.

Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.

Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga mengeras.

Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk digunakan.

Elektroforesis Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.

1µl loading dye dicampur dengan 3µl produk DNA pada parafilm yang telah tersedia dengan bantuan
mikropipet.

Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose. Sedangkan untuk 3µl DNA marker 1kb
dituangkan pada sumur/ well yang berada pada paling tepi atas dan bawah.

Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply. Power Supply ( 400mA, 90V)
dinyalakan selama 30 menit.

Dokumentasi
Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama ± 15 menit. Dilanjutkan dengan
direndam dalam akuades selama ± 15 menit. Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian
diambil gambarnya.

HASIL DAN PEMBAHASAN

HASIL

PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu untuk
melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa ( DNA dan Protein), yaitu metode
elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara mengukur
fragmen DNA pada praktikum ini. Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul
selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium
yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005). Prinsip
kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya
gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif),
maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif ( Elektroforesis ) melalui
membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005). Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang
telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997).

Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%. Praktikan tidak melakukan
pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara umum, proses pembuatan
gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang
kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah
disiapkan dengan comb- nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4
gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan
migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel
mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer.
Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan
pemanasan (Gardner dkk, 1991). Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer
yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama
proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).

Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 4µl dan juga
larutan marker 1kb sebanyak 3µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk
marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan
dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading
buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus
PO 4 ) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai
acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang
elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.
Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan
basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan
fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996). Praktikum
dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap
running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus sebesar 400 mA
selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di
berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat
dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan
dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc
(Davis dkk, 1994). Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose
hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk
meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan
pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap
tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc.

Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis.
Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian
dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi
menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk, 1994). Dalam proses elektoforesis
terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena
hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2. Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-
molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil,
konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3. Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang
berbentuk bulat.

4. Densitas muatan

Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan
bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6. Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7. Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA
(Wolfe, 1993).

Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang