Fundamentos de Engenharia Genética

A Engenharia Genética permite manipular directamente os genes de

determinados organismos com objectivos práticos.

Tecnologia de DNA recombinante

• Permite combinar na mesma molécula de DNA genes

provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de
espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA
recombinante (DNAr).
• Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as
enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.
 Enzimas de restrição – reconhecem determinadas
sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As
zonas de restrição correspondem a sequências de DNA
curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas
cadeias na direcção 5'-3'.

 As enzimas de restrição são bastante específicas e

ocorrem naturalmente em bactérias. Protegem as
bactérias dos ataques dos vírus, uma vez que
reconhecem e cortam sequências específicas do DNA
viral, inactivando-o. O DNA bacteriano está protegido
da actividade das enzimas de restrição.
 A actividade das enzimas de restrição dá origem a
fragmentos de DNA em dupla hélice – fragmentos de
restrição - com extremidades em cadeia simples –
extremidades coesivas.
 Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas
extremidades coesivas de diferentes fragmentos de
restrição obtidos com a mesma enzima.

 As extremidades coesivas emparelham através de ligaçõe

sde hidrogénio entre bases complementares e podem unir-
se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a
formação de ligações fosfodiéster.
 Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o
DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma
célula ou um organismo receptor.

 Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os

bacteriófagos.
 Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de
DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias,
leveduras e células vegetais.
 Os plasmídeos ligam-se a determinados compostos,
tornando-os mais densos, permitindo a sua separação
por centrifugação.
 • Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:

1. Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o

gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e
um vector adequado.
2. A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma
enzima de restrição, que corta as duas moléculas em
regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
3. Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de
DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os
fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades
coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece
a ligação.
4. O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma
célula ou organismo receptor.
5. O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou
organismo receptor, que passa a possuir um DNA
recombinante.
6. Um meio selectivo ou testes químicos permitem
identificar as células que exprimem o gene desejado. No
processo descrito formam-se fragmentos de restrição que
não têm o gene desejado e nem todas as células
receptoras incorporam o DNA dador.

DNA Complementar - DNAc

• Os procariontes são organismos muito utilizados em

Engenharia Genética como receptores de DNA estranho porque
são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos
bioquímicos bem conhecidos. No entanto, não processam o
RNAm e, quando recebem genes com intrões, estes não são
retirados e a proteína produzida não é funcional.
• DNA complementar (DNAc) – molécula de DNA sem intrões
que é directamente transcrita numa molécula de RNAm
funcional. O processo de obtenção de DNAc é o seguinte:

1. Isola-se uma molécula RNAm funcional das células.

2. Adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos
livres. A transcriptase reversa catalisa a síntese de
uma cadeia simples de DNA a partir de um molde
de RNAm.
3. Junta-se uma enzima que degrada o RNAm que
serviu de molde e DNA polimerase que catalisa a
formação da cadeia complementar do DNA.

• O DNAc pode ser inserido através de um vector contendo o

promotor e sequências reguladoras.
 • Todos os DNAc que se sintetizam a partir do RNA podem ser
clonados em bactérias, originando uma biblioteca de DNAc,
em que toda a informação (genes que se encontravam a ser
transcritos – expressos – num dado momento), fica armazenada
em bactérias por longos períodos de tempo, desde que sejam
fornecidas todas as condições indispensáveis para a sua
manutenção.

Reacção de Polimerização em Cadeia – PCR

• Técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora

das células.
• Material necessário:
 sequências de DNA que se pretende amplificar;
 um par de iniciadores (primers);
 os quatro tipos de nucleótidos;
 uma polimerase DNA (Taq);
 solução-tampão que impeça variações de pH e que
contenha Mg² , ião essencial para a actividade da
polimerase.
• Uma reacção de PCR corresponde a um conjunto de ciclos,
envolvendo cada um destes ciclos:
 Desnaturação da dupla hélice – é conseguida com
a incubação do DNA a uma temperatura de 95°C,
formando duas cadeias simples a partir de uma
dupla cadeia;
 Emparelhamento dos iniciadores – diminuição
da temperatura aproximadamente para os 55°C,
para ocorrer a ligação dos primers;
 Polimerização (síntese) de DNA – ocorre a 70°C,
temperatura óptima de actividade da Taq
polimerase. Esta liga-se na região dos iniciadores, e
promove a polimerização, com elongação da cadeia
de DNA, servindo a outra como molde.
 Este ciclo é repetido dezenas de vezes, para obter
milhões de cópias de DNA, em poucas horas e sem
intervenção manual. No final, leva à produção de
2^n moléculas de DNA de interesse, em que n
representa o número de ciclos.
 A Taq polimerase é uma polimerase extraída da
Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontes
termais com água extremamente quente, resistindo
às variações de temperatura e contribuindo
significativamente para o sucesso da técnica de
PCR (o aquecimento para desnaturar as cadeias de
DNA provocava a inactivação definitiva da
polimerase, obrigando a adicionar mais enzima por
ciclo de aquecimento).
 • Um dos aspectos mais negativos desta técnica é a grande
sensibilidade à contaminação com DNA estranho, podendo
ocorrer emparelhamento entre os iniciadores e este DNA
estranho, amplificando sequências não pretendidas.

DNA Fingerprint

• No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que

são reconhecidas e cortadas por determinadas enzimas de
restrição. Estas enzimas dividem o DNA em fragmentos cujas
dimensões e composição em nucleótidos variam de pessoa para
pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.
• Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo
diferente quando submetidos a electroforese (técnica em que
determinadas moléculas são sujeitas à acção de um campo
eléctrico num meio poroso) e o resultado é um padrão de
bandas que difere de indivíduo para indivíduo.

Aplicações das Técnicas de Engenharia

Genética
• DNA recombinante(DNAr):
 Investigação fundamental: torna possível isolar genes
de organismos complexos e estudar as suas funções a nível
molecular.
 Obtenção de OGM: os OGM são organismos em cujo
genoma foram introduzidos genes que conferem
características vantajosas. Os OGM
 Os animais transgénicos, normalmente, são
produzidos através de microinjecção de DNA de um
determinado gene em células de um ovo fertilizado,
ou através de células colocadas no útero de uma
fêmea, decorrendo assim o seu desenvolvimento.
 Os OGM são utilizados para:
 produção de alimentos em maior
quantidade e qualidade;
 produção de grandes quantidades de
substâncias com aplicação médica ou
farmacêutica, como a insulina, hormona do
crescimento ou factores de coagulação
sanguínea;
 produção de substâncias com aplicação
industrial;
 biorremediação – modificação de organismos
no sentido de degradarem poluentes.
• DNA complementar (DNAc):
 Obtenção de cópias de genes que codificam
produtos com interesse – torna possível a produção de
proteínas humanas por procariontes que podem ser
cultivados facilmente em biorreactores.

• PCR:
 Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco
tempo, a partir de uma quantidade muito pequena. Esse
DNA pode ser posteriormente utilizado em técnicas de
recombinação de DNA ou em fingerprint.

• DNA fingerprint:
 Investigação criminal, forense e histórica – a técnica
permite partir de material biológico deixado num local
(cabelo, sangue, esperma...) e compará-lo com o dos
suspeitos; permite a identificação de cadáveres.
 Determinação de paternidade – a comparação das
impressões digitais genéticas dos progenitores e do
descendente permite excluir a paternidade ou confirmá-la
com um elevado grau de certeza.

• Há alguns obstáculos na expressão de genes eucariontes em

bactérias.
 Deve associar-se o gene às sequências promotoras e
reguladoras mais apropriadas e que possam ser
reconhecidas pela RNA polimerase da bactéria (as zonas
de regulação da expressão génica em procariontes
são diferentes dos eucariontes).
 A resolução deste problema pode ser obtida pela
combinação de uma determinada sequência
nucleotídica com um promotor da própria bactéria,
permitindo a expressão da sequência eucarionte
inserida.
 Quando se transferem genes para uma bactéria, é
aconselhável que o DNA transferido já esteja
processado, uma vez que as bactérias hospedeiras não
possuem enzimas para o processamento e remoção dos
intrões, introduzindo uma cópia de DNAc do gene.

• A utilização e introdução no mercado dos OGM é um assunto

controverso e que levanta problemas éticos. Apesar das
vantagens associadas a estes organismos, o impacto que
podem vir a ter sobre o ambiente e a saúde humana é
desconhecido e imprevisível.