LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP
ISOLASI ACTINOMYCETES DARI TANAH PENGHASIL ANTIBIOTIK

OLEH :

Kelompok 2

Golongan : Jumat Siang

Asisten :

Satria Putra Penarosa, S.Si., Apt.

MAKASSAR

2014
 BAB I

PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Actinomycetes termasuk dalam divisi Schyzophyta. Tumbuh sebagai

filament sel yang bercabang panjang atau pendek. Organisme ini

membelah dengan pembelahan biner, dan mungkin menghasilkan spora

eksternal atau tidak. Begitu jauh, mayoritas organisme ini adalah saprofit

tanah dan air (organisme yang hidup dari benda organik yang membusuk

dan sangat penting karena perannya dalam daur alam, seperti

pembusukan bahan organik dan penambatan nitrogen). Bangsa

Actinomycetes terdiri dari tiga suku yaitu suku Mycobacteriaceae, suku

Actinomycetaceae, dan suku Streptomycetaceae.

Actinomycetes merupakan mikroorganisme tanah yang umum

dijumpai pada berbagai jenis tanah. Populasinya berada pada urutan

kedua setelah bakteri, bahkan kadang-kadang hampir sama

Actinomycetes hidup sebagai saprofit dan aktif mendekomposisi bahan

organik, sehingga dapat meningkatkan kesuburan tanah. Actinomycetes

merupakan salah satu mikroorganisme yang mampu mendegradasi

selulosa di samping bakteri, kapang, dan khamir. Jenis Actinomycetes

tergantung pada tipe tanah, karakteristrik fisik, kadar bahan organik, dan

pH lingkungan.
 Actinomycetes kelihatan dari luar seperti jamur dan dalam banyak

buku dibicarakan bersama dengan fungi eukariot. Akan tetapi, organisme

ini adalah bakteri benar sesuai dengan semua kriteria untuk sel prokariot.

Dinding selnya mengandung asam muramat, tidak mempunyai

mitrokondrion, mengandung ribosom 70S (sel eukariot mempunyai

ribosom 80S dalam sitoplasmanya), tidak mempunyai pembungkus

nukleus, garis tengah selnya berkisar dari 0,5 sampai 2,0 µm, dan dapat

dimatikan atau dihambat oleh banyak antibiotika bakteri. Dari banyak

macam marga yang diklasifikasi dalam bangsa Actinomycetales, hanya

sedikit yang dapat menimbulkan penyakit pada manusia. (1: 149-151)

I.2. Maksud dan Tujuan Percobaan

I.2.1 Maksud Percobaan

Mengetahui dan memahami cara mengisolasi mikroorganisme

penghasil antibiotik dari sampel Tanah Peternakan Sapi.

I.2.2 Tujuan Percobaan

a. Mengetahui dan memahami cara pengambilan dan pengolahan

sampel secara mikrobiologi.

b. Mengetahui dan memahami bagaimana isolasi dan pemurnian

mikroba penghasil anti mikroba secara mikrobiologis.

c. Mengetahui dan memahami bagaimana cara peremajaan dan

pembenihan mikroba secara mikrobiologi.

d. Mengetahui dan memahami cara pengujian aktivitas mikrobiologis

I.3. Prinsip Percobaan

a. Pengambilan sampel dari Tanah sekitar Peternakan sapi dan

mengolahnya dengan cara pengenceran dengan menggunakan air

steril hingga pengenceran 10-5

b. Pengisolasian sampel dan pemurnian mikroorganisme bakteri

actinomycetes, isolasi dilakukan dengan pengenceran 10-1 , 10-2, dan

10-3 menggunakan medium SNA (Starch Nutrient Agar) dengan

metode penggoresan dan diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37oC.

c. Pengujian antagonis menggunakan biakan Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Bacillus subtillis, Salmonella thypos dan

Pseudomonas aeruginosa yang akan menghasilkan zona bening di

daerah sekitar isolat, dengan menempelkan isolat pada suspensi

medium dan bakteri, kemudian diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37oC.

d. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan kultur murni atau starter.

Banyaknya mikroba (starter/inokulum) yang ditambahkan berkisar

antara 3–10 % dari volume medium. Medium fermentasi yang

digunakan adalah SNB (Starch Nutrient Borth) dan diinkubasi selama

7 x 24 jam pada suhu 37oC dan dilakukan shaker 1x sehari selama 1

jam.

e. Ekstraksi actinomycetes dilakukan dengan menggunakan Etil asetat

sebagai pelarut untuk mengambil komponen kimia antimikroba dari

actinomycetes, dengan mencampurkan medium hasil fermentasi dan

pelarut etil asetat kedalam corong pisah dan dilakukan penggojokan

 selama 1 jam yang akan menghasilkan filtrat dan supernatan. Filtrat

kemudian diambil dan diuapkan.

f. Pengujian daya hambat actinomycetes menggunakan biakan

Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella thyposa

dengan melarutkan ekstrak isolat menggunakan pelarut DMSO

(Dimethyl Sulfoxide) lalu dicelupkan paper disk kedalam larutan

tersebut, kemudian paper disk ditempelkan pada suspensi medium

dan biakan bakteri dan diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37oC.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Teori Umum

Timbulnya berbagai penyakit infeksi baru yang membutuhkan

antibiotik di satusisi dan adanya sifat resistensi kuman terhadap antibiotik

yang telah ada di sisilain, mendorong terus dilakukannya penelitian untuk

menghasilkan antibiotik jenis baru yang lebih ampuh untuk membunuh

kuman penyakit. Saat ini banyak penelitian yang difokuskan pada

Actinomycetes yang diindikasikan sebagai bakteri yang mampu

menghasilkan antibiotik terbanyak. Sekitar 70% dari antibiotik yang telah

ditemukan dihasilkan oleh Actinomycetes terutama Streptomyces (2).

Hampir 95% dari 2000 antibiotik yang ada dihasilkan oleh

Streptomyces. Streptomyces dikenal mampu menghasilkan banyak

antibiotik seperti streptomycin yang dihasilkan oleh Streptomycesgriseus,

aureomisin yang dihasilkan oleh S.aureofaciens, oleandomycin yang

dihasilkan oleh S. antibioticus, spiramycin yang dihasilkan oleh S.

ambofaciens, dan eritromisin yang dihasilkan oleh S. erythreus, yang

masing-masing mempunyai khasiat yang berlainan. Selain Streptomyces,

masih ada anggota actinomicetes yang juga mampu menghasilkan

antibiotik dan antitumor, Micromonospora, Saccharopolyspora,

Actinomodura, dan Dactylosporangium (3 : 11-19).

Actinomycetes termasuk bakteri yang berbentuk batang, gram

positif, bersifat anaerobik atau fakultatif. Struktur Actinomycetes berupa

filamen lembut yang sering disebut hifa atau miselia, sebagaimana yang

terdapat pada fungi, memiliki konidia pada hifa yang menegak.

Actinomycetes merupakan bakteri yang bereproduksi dengan pembelahan

sel, rentan terhadap pinicilin tetapi tahan terhadap zat antifungi (4, 11).

Actinomycetes selalu ditemukan pada substrat alam, seperti tanah

dan kompos,air kolam, bahan makanan, dan di atmosfer. Laut dalam,

bukan merupakan habitat yang baik bagi Actinomycetes. Actinomycetes

hidup dan memperbanyak diri dalam tanah dan kompos pada kedalaman

yang bervariasi, pada daerah yang dingin dan tropik. Tanah yang basa

dan netral lebih disukai dari pada tanah yang asam seperti humus hutan

dan rawa-rawa. Streptomyces merupakan genus yang paling banyak

ditemukan di tanah dan kompos. Pada tanah yang kering dan panas

(hangat), banyak ditemukan Actinomycetes, seperti : Streptomyces,

kelompok mikroorganisme ini menyebabkan bau musty, yaitu bau seperti

tanah yang baru dibajak (12).

Keberadaan Actinomycetes dalam tanah telah banyak dikaji

peneliti. Sebanyak 22 genus Actinomycetales telah berhasil diisolasi dari

sampel tanah yang berasal dari 12 tempat di Yunnan dan 91%

diindikasikan sebagai Streptomyces. Penelitian ini juga menyimpulkan

bahwa pada tanah yang lebih kering, lebih tandus dan lebih dingin, lebih

banyak ditemukan Streptomyces. Di Sabah juga telah ditemukan

sebanyak 78 strain Actinomycetes yang diisolasi dari tanah yang berasal

dari 22 lokasi, diketahui pula bahwa strain terbanyak adalah Streptomyces

dan menemukan 50 strain Actinomycetes yang berbeda pada sampel

ladang pertanian yang diambil dari daerah Manisa di Turki. Ternyata 34%

dari keseluruhan isolat berpotensi sebagai antibiotik, dan 7 isolat

menghasilkan antibiotik baru. Ada juga yang berhasil menemukan 40

strain Actinomycetes yang diisolasi dari Antarctica. Setelah diujikan pada

7 spesies bakteri didapatkan hasil 60% strain berpotensi sebagai

antibiotik, dan 10 strain mempunyai daya hambat dengan spektrum yang

luas. Selain itu juga berhasil ditemukan 106 isolat Actinomycetes pada

sampel tanah yang diambil dari Lobuche dan Lukla, dua wilayah di Nepal.

Dari 106 isolat hanya 36 isolat yang berpotensi sebagai antibiotik, dua

isolat hanya menghambat bakteri gram negatif, delapan isolat

menghambat bakteri gram positif dan 26 isolat menghambat keduanya

(3,5,9).

Keberadaan Actinomycetes dalam tanah telah banyak dikaji

peneliti. Actinomycetes ternyata tidak hanya di temukan dalam tanah.

Telah berhasil menemukan 186 isolat Actinomycetes dari 78 sampel

sedimen ekosistemair hitam yang terletak di Kalimantan Tengah, dari 186

isolat diketahui 58 isolat dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus

aureus, 38 isolat mampu menghambat E coli dan 17 isolat mampu

menghambat keduanya. Dhanasekaran juga telah berhasil menemukan

230 isolat Actinomycetes dari sampel yang diambil dari tempat yang

sama. Tanah merupakan salah satu habitat bagi mikroorganisme, dalam

satu gram tanah terdapat jutaan bakteri, fungi, protozoa dan

mikroorganisme lain. Sawah sebagai salah satu bentuk tanah pertanian

juga merupakan habitat bagi Actinomycetes (4,10).

Populasi mikroorganisme dalam tanah dipengaruhi oleh beberapa

faktor, yaitu : (4)

1. Jumlah dan jenis zat hara dalam tanah

2. Kelembaban

3. Tingkat aerasi

4. Suhu

5. pH

6. Perlakuan pada tanah, sepertipemupukan atau terjadinya banjir.

Antibiotik yang dihasilkan oleh anggota genus Streptomyces dapat

dikelompokkan dalam lima kelompok, yaitu : (6)

1. Tetrasiklin

Tetrasiklin dan derifatnya meliputi antibiotik tetrasiklin,

klortetrasiklin, dan dimetil tetrasiklin yang dihasilkan oleh Steptomyces

aureofaciens, serta oksitetrasiklin(S. rimosus) (Perlman, 1970;Pelczar &

Chan, 1988). Antibiotik ini bekerja pada semua mikroorganisme yang

peka terhadap penisilin, berbagai bakteri gram positif dan negatif,

mikoplasmaspirokhaeta, leptospira, rickettsia, dan khlamidia (6)

2. Kloramfenikol

Kloramfenikol adalah antibiotik kloramfenikol yang dihasilkan

oleh Steptomycesvenezuelae. Antibiotik ini mempunyai spektrum kerja

seperti tetrasiklin namun sekarang sudah jarang dipakai. Indikasi

 kloramfenikol untuk mengobati tifus, paratifus dan menginitis.

Kloramfenikol aktif terhadap bakteri gram positif, gram negatif dan

rickettsia (6).

3. Makrolida (kelompok eritromisin)

Makrolida meliputi eritromisin yang dihasilkan oleh S. erythreus,

oleandomisin (S. antibioticus) (Perlman, 1970) dan spiramisin (S.

ambofaciens). Spektrum kerjanya meliputi bakteri gram positif (6)

4. Linkomisin

Linkomisin dan derifatnya meliputi linkomisin yang dihasilkan

oleh S. Lincolnensisdan klindamisin (turunan linkomisisn). Spektrum

kerja linkomisin aktif pada bakteri gram positif terutama infeksi yang

disebabkan anggota genus Staphylococcus. Intensitas kerja klindamisin

dua sampai sepuluh kali lebih besar dari pada linkomisin (6).

5. Antibiotika aminoglikosida

Aminoglikosida meliputi streptomisin yang dihasilkan oleh S.

griceus, dihidrostreptomisin (turunan streptomisin), kanamisin

(S.Kanamyceticus.), dan neomisin (S. Fradiae), tobramisin(S.

tenebrarius), spektinomisin (S.Spectabilis), Streptomisin,

dihidrostreptomisin, kanamisin dan neomisin aktif terhadap bakteri gram

positif, gram negatif dan bakteri penyebab tuberkulosis tobramisin

terutama aktif pada Pseudomonas aeruginosa, spektinomisin aktif pada

bakteri gram negatif dan untuk pengobatan Neisseriagonorrhoeae.

Pengujian kemampuan suatu isolat sebagai penghasil antibiotik dapat

dilakukan dengan suatu perlakuan pada bakteri uji untuk menentukan

adanya daerah hambatan, yaitu daerah jernih yang tidak ditumbuhi

mikroorganisme lain. Jika pada perlakuan tersebut terdapat daerah

hambatan maka isolat tersebut berpotensi sebagai penghasil antibiotik,

sebaliknya jika tidak terbentuk daerah hambatan maka isolat tersebut

tidak berpotensi menghasilkan antibiotik. Bakteri yang sering digunakan

pada penelitian adalah Escherichia coli yang mewakili kelompok bakteri

gram negatif dan Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis sebagai

wakil kelompok bakteri gram positif. Dalam penelitian ini digunakan

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. (6)

Actinomycetes mempunyai beberapa manfaat yaitu

mendekomposisi bahan organik, menghasilkan antibiotik yang dapat

menghambat bahkan mematikan mikroba lainnya (khususnya yang

patogen), mengikat struktur tanah liat sehingga dapat memperbaiki sifat

fisik tanah, dan dapat menghilangkan bau dengan zat-zat metabolik

yang dikeluarkannya. Selain itu, actinomycetes memegang peranan

penting dalam proses biodegradasi senyawa polimer dan memobilisasi

unsur hara makro dan mikro, sehingga berperan sentral dalam

menjaga kestabilan ekosistem (5).

Isolasi mikrobia pada prinsipnya adalah memisahkan suatu jenis

mikrobia dengan jenis mikrobia lainnya dengan asal mikrobia yang

terdiri dari berbagai macam spesies. Hal ini dapat dilakukan dengan
 menumbuhkan pada media padat. Pada media padat ini sel-

sel akan membentuk suatu koloni sel yang tetap. Jika sel-sel tersebut

tertangkap oleh media pada beberapa tempat yang terpisah maka

setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi

suatu koloni yang terpisah sehingga memudahkan pemisahan

selanjutnya (7).

II.2. Uraian Mikroba

1. Escherichia coli (7 : 122-123)

Kingdom : Bacteria

Divisi : Proteobacteria

Kelas : Gamma proteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Bakteri Escherichia coli merupakan spesies dengan habitat alami

dalam saluan pencernaan manusia maupun hewan. Escherichia coli

pertama kali di isolasi oleh Theodor Escherichia dari tinja seorang anak

kecil pada tahun 1885. Bakteri ini berbentuk batang, berukuran 0,4-0,7

µm, termasuk gram negatif, dapa hidup soliter maupun berkelompok,

umumnya motil, tidak berbentuk spora serta fakultatif anaerob. (8 : 949)

2. Staphylococcus aureus (7 :122-123)

 Kingdom : Protista

Divisi : Protophyta

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Enterobacteriaceae

Famili : Micrococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

Merupakan bakteri gram positif, tidak bergerak, tidak berspora dan

mampu membentuk kapsul, berbebtuk coccus, dan tersusun sepeti buah

anggur. (8 : 954)

3. Pseudomonas aeruginosa (7 :122)

Kingdom : Prokaryotae

Divisio : Schizophyta

Class : Schizomycetes

Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa

Merupakan sel tunggal, batang lurus atau melengkung, namun

tidak berbentuk heliks. Pada umumnya berukuran 0,5–1,0 µm x 1,5–4,0

µm. Motil flagellum polar, monotrikus atau multitrikus. Tidak menghasilkan

selongsong prosteka. Beberapa merupakan kemolitotrof fakultatif, dapat

menggunakan H2S atau Co sebagai sumber energy. Aerobic sejati,

kecuali spesies-spesies yang dapat menggunakan denitrifikasi sebagai

cara respirasi anaerobic. Katalase positif. (8 : 952)

4. Bacillus subtilis (7 : 122-123)

Kingdom : Prokaryotae

Divisio : Schizophyta

Class : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis

Merupakan sel berbentuk batang, 0,3–2,2 µm x 1,27–7,0 µm.

sebagian besar motil, flagellum khas lateral. Membentuk endospora, tidak

lebih dari satu dalam satu sel sporangium. Gram positif, kemoorganotrof.

Metabolisme dengan respirasi sejati, fermentasi sejati, atau kedua-

duanya, yaitu respirasi dan fermentasi aerobic sejati dan anaerobic

fakultatif. Umumnya dijumpai dalam tanah. (5 : 947)

5. Salmonella thyposa (9 : 122-123)

Kingdom : Prokaryotae

Divisio : Schizophyta

Class : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Salmonella
 Spesies : Salmonella thyposa

Berbentuk batang, biasanya motil dengan flagellum penitrikus,

mungkin terdapat muatan non motil. Kebanvakan akan tumbuh pada

medium sintens tanpa faktor tumbuh khusus dan juga dapat

menggunakan sitrat sebagai karbon. (8)

 BAB III

METODE KERJA

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah batang

pengaduk, botol semprot, cawan petri, erlenmeyer, inkubator, kertas

perkamen, ose bulat, ose lurus, paper disk, pinset, rak tabung, spoit,

sendok tanduk, sentrifuge, shaker, tabung reaksi, tabung sentrifuge, dan

timbangan analitik.

III.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah air steril,

Aluminium foil, biakan Escherichia coli, S. thyposa, Basillus subtilis

Staphylococcus aureus, P. aurogenosa, etanol, medium NA (Nutrient

Agar), medium SNA (Starch Nutrient Agar), SNB (Starch Nutrient Borth),

medium produksi.

III.2 Cara Kerja

1. Pengisolasian

a. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan

b. Sampel tanah peternakan sapi dimasukkan ke dalam botol vial

untuk dibuat pengenceran 10-1 sampai 10-7 dan diambil 1 ml

pengenceran 10-1,10-2,10-3 ke dalam cawan petri yang berisi

medium SNA dengan metode tuang.

 c. Diinkubasi 1x24 jam lalu dilihat pertumbuhan mikroorganisme

sampel

2. Penginokulasian

a. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan

b. Cawan petri yang berisi biakan bakteri sampel kemudian

diinokulasikan ke dalam medium SNA yang baru untuk

mendapatkan koloni murni

c. Hasil koloni murni dipindahkan kedalam agar miring berisi SNA

sebagai isolat

d. Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 amati pertumbuhan

bakteri

e. Kemudian hasil koloni dari agar miring diambil lalu diinokulasikan

lagi ke dalam cawan petri yang berisi medium SNA.

3. Uji Antagonis

a. Alat dan bahan yang digunakan disiapkan

b. Biakan bakteri Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella

thyposa, Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis diambil

menggunakan spoit sebanyak 1ml kemudian dimasukkan kedalam

masing-masing cawan petri setelah itu dimasukkan medium NA lalu

dihomogenkan

c. Bakteri sampel 10-1 dan 10-2 yang telah diinokulasikan ke dalam

cawan petri dicuplikan menggunakan ose lalu ditanamkan ke dalam

masing-masing cawan yang berisi medium dan biakan bakteri

 d. Diinkubasi pada suhu 37oc selama 1x24 jam kemudiaan di amati

zona bening yang dibentuk oleh bakteri sampel

4. Uji Fermentasi

a. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.

b. Koloni diinokulasikan kedalam medium SNB sebanyak 50 ml, lalu

dishaker sebagai medium starter

c. Diinkubasi 1x24 jam dan dilihat terjadi perubahan warna pada

medium.

d. Hasil medium starter dicampurkan kedalam medium SNB sebanyak

100 ml sebagai medium produksi, lalu dishaker 1 jam selama 7

hari.

5. Tahap Ekstraksi

a. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.

b. Dimasukan medium hasil fermentasi kedalam corong pisah

sebanyak 50 ml

c. Dimasukan pelarut etil asetat sebanyak 50 ml ke dalam corong

pisah

d. Digojok corong pisah selama ± 1 jam

e. Didiamkan selama beberapa menit hingga terpisah antara filtrat dan

supernatan, kemudian diambil bagian filtrat dan dimasukan pada

mangkok kaca

f. Filtrat yang ada dimangkok diuapkan pada suhu ruangan.

6. Uji Daya Hambat

a. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan

b. Disuspensikan biakan bakteri dan medium NA ke dalam cawan

petri steril, padatkan.

c. Dibagi dua bagian pada permukaan belakang cawan petri, ditandai

bagian kontrol dan bagian ekstrak.

d. Ekstrak yang terdapat pada mangkok dilarutkan menggunakan

pelarut DMSO secukupnya.

e. Dicelupkan paper disk kedalam larutan, kemudian ditempelkan

pada cawan petri yang berisi padatan medium (b) bagian ekstrak.

f. Dicelupkan paper disk kedalam pelarut DMSO, kemudian

ditempelkan pada cawan petri yang berisi padatan medium (b)

bagian kontrol.

g. Dibungkus cawan petri menggunakan kertas putih dan diinkubasi

selama 1 x 24 jam pada suhu 37°C.

h. Diamati zona bening yang terbentuk.

 BAB IV

HASIL PENGAMATAN

IV.1 TABEL PENGAMATAN

No Bakteri Control Sampel

0,8 cm 0,95 cm
0,675 cm 1 cm
1 Escherichia coli 0,9 cm 1,3 cm
0, 792 cm 1, 083 cm

1,1 cm 1,1, cm
0,95 cm 0,9 cm
2 Staphylococcus aureus 1,35 cm 1,3 cm
1,133 cm 1,1 cm

0,85 cm 1,3 cm
1,05 cm 1,2 cm
3 Salmonella thyposa 0,85 cm 1,45 cm
0,927 cm 1,317 cm
IV.2 Gambar Pengamatan

IV.2.1 Tahap Isolasi

LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Isolasi pengenceran 10-1 Ket : Isolasi pengenceran 10-2

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Isolasi pengenceran 10-3

IV.2.2 Tahap Inokulasi

LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Inokulasi pengenceran 10-1 Ket : Inokulasi pengenceran 10-2

LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Inokulasi tahap kedua Ket : Inokulasi tahap kedua

pengenceran 10-2 pengenceran 10-2
IV.2.3 Pemurnian

LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : isolat murni Ket : kultur murni

IV.2.4 Uji Antagonis

LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Staphylococcus aureus Ket : Escherichia coli

 LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Escherichia coli Ket : Staphylococcus aureus

LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Salmonella thyposa Ket : Pseudomonas aureginosa

 LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Bacillus subtilis

IV.2.5 Uji Fermentasi

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : starter
IV.2.6 Uji Daya Hambat

LABORATORIUM LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Staphylococcus aureus Ket : Salmonella thyposa

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

Ket : Escherichia coli

 BAB V

PEMBAHASAN

Pada isolasi mikroorganisme penghasil antibiotik ini, digunakan

sampel dari tanah peternakan sapi. Pada dasarnya, tanah merupakan

salah satu habitat dari mikroorganisme. Mikroorganisme yang umumnya

terdapat di tanah adalah populasi actinomycetes. Keberadaan

actinomycetes dalam tanah telah banyak dikaji peneliti. (3:2)

Langkah awal dari isolasi actinomycetes pada tanah sekitar

peternakan sapi yaitu dengan melakukan pengenceran sampel dengan

pengenceran 10-1 , 10-2, dan 10-3, menggunakan medium SNA (Starch

Nutrient Agar) dan diinkubasi1-2 hari pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi,

diperoleh 3 jenis koloni yang berbeda, yaitu koloni berwarna putih, koloni

berwarna hitam, dan koloni berwarna kuning. Salah satu karakteristik dari

bakteri actinomycetes yaitu dengan adanya pigmen sehingga

menghasilkan koloni yang berwarna.

Ketiga koloni bakteri actinomycetes tersebut, dilakukan uji

antagonis terhadap bakteri Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,

Salmonella thyposa, Eschericia coli, dan Pseudomonas aureginosa.

Setelah diinkubasi, diperoleh bahwa koloni putih yang merupakan hasil

inokulasi menunjukkan aktivitas yang dapat menghambat bakteri

Staphylococcus aureus, Salmonella thyposa, Eschericia coli, tetapi tidak

untuk bakteri Bacillus subtilis, dan Pseudomonas aureginosa.

 Aktivitas yang ditunjukkan oleh koloni putih (isolat) tersebut,

dilanjutkan dengan melakukan proses fermentasi. Sebelum fermentasi

dilakukan, terlebih dahulu dilakukan starter dengan menginokulasikan

koloni putih tersebut ke dalam medium SNB (Starch Nutrient Broth) 50 ml

selama 7 hari penginkubasian dengan dikocok setiap harinya selama 5

menit. Tujuan dilakukannya tahap starter dengan perlakuan dikocok setiap

harinya yaitu untuk mendapatkan koloni bakteri yang tumbuh dalam

medium SNB tersebut.

Setelah 7 hari penginkubasian dalam medium starter dan

didapatkan bakteri yang tumbuh, maka dilanjutkan ke tahap fermentasi

dengan menggunakan medium SNB (Starch Nutrient Broth) sebanyak 100

ml dan ditambahkan dengan medium starter. Tahap fermentasi dilakukan

selama 2 minggu dengan perlakuan yang sama pada tahap starter, tetapi

lama pengocokan yang berbeda, yaitu selama 1 jam.

Setelah tahap fermentasi, dilanjutkan dengan tahap ekstraksi isolat

dengan menggunakan pelarut etil asetat (1:1) yang dimasukkan ke dalam

corong pisah, kemudian digojog selama ± 30 menit, sehingga akan

menghasilkan filtrat dan residu. Selain etil asetat, dapat pula digunakan

pelarut yang memiliki sifat yang sama dengan etil asetat yaitu pelarut non

polar yang tidak dapat bercampur dengan isolat yang dihasilkan.

Contohnya seperti pelarut n-heksan.

Filtrat yang dihasilkan, selanjutnya dikeringkan sehingga di

dapatkan ekstrak dari isolat tersebut. Ekstrak yang dihasilkan selanjutnya

dilarutkan menggunakan pelarut organik, yaitu pelarut Dimethyl Sulfo

Okside (DMSO). Pelarut DMSO yang digunakan, karena pelarut ini

merupakan pelarut yang tidak menghambat aktivitas mikroorganisme.

Ekstrak yang telah dilarutkan dengan pelarut DMSO, selanjutnya

dilakukan uji daya hambat kembali, yang merupakan tahap akhir dari

isolasi ini. Uji daya hambat ini dilakukan terhadap tiga bakteri yaitu

Staphylococcus aureus, Salmonella thyposa, dan Eschericia coli.

Berdasarkan hasil pengamatan, diperoleh bahwa isolat yang

dihasilkan mampu menghambat ketiga jenis bakteri tersebut, terutama

untuk bakteri Salmonella thyposa yang menunjukkan hasil yang paling

baik dibanding kontrol yaitu masing-masing sebesar 1,32 cm dan 0,92 cm,

begitupun terhadap bakteri Eschericia coli yang menunjukkan luas daya

hambat yang lebih besar dibanding kontrol, masing-masing sebesar 1,08

cm dan 0,79 cm. Akan tetapi, untuk bakteri Staphylococcus aureus daya

hambat yang ditunjukkan hampir sama dengan kontrol yaitu masing-

masing sebesar 1,1 cm, sedangkan kontrol sebesar 1,2 cm. Aktivitas yang

ditunjukkan oleh isolat yang dapat menghambat ketiga jenis bakteri

tersebut menunjukkan bahwa isolat tersebut mampu menghasilkan

antibiotik.
 BAB VI
PENUTUP

VI.I Kesimpulan

Berdasarkan hasil percobaan, maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Isolat murni yang dihasilkan dari tanah sekitar peternakan sapi

mempunyai aktivitas antibiotik terhadap bakteri Salmonella thyposa,

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.

2. Aktivitas daya hambat isolat terbesar ditunjukkan terhadap bakteri

Salmonella thyposa yaitu sebesar 1,32 cm dibandingkan dengan

kontrol hanya sebesar 0,92 cm.

VI.2. Saran

Adapun saran dari penulis yaitu :

1. Perlu dilakukan pengembangan lebih lanjut terhadap isolat bakteri

actynomicetes penghasil antibiotik dari tanah sekitar peternakan sapi.

2. Perlu dilakukan aktivitas biokimia terhada isolat yang dihasilkan.

3. Perlu pula dilakukan adanya penentuan struktur terhadap antibiotik

yang di hasilkan. Instrumen yang dibutuhkan seperti Spektrofotometri

UV-Vis, PCR, dan NMR.

 DAFTAR PUSTAKA

1. Volk dan Wheeler, 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta : Erlangga.

2. Suwandi, U., 1993. Perkembangan Antibiotik. Cermin Dunia

Kedokteran No. 83. Pusat Penelitian dan Pengembangan PT.

Kalbe Farma, Jakarta.

3. Okami Y, Hotta K. 1988. Actinomycetes in Biotechnology. London:

Academic Pr. Hal. 11-19.

4. Budiyanto, M.A.K. 2004. Mikrobiologi Terapan. Malang: UMM-Press.

5. Dhanasekaran D et al. 2005. Screening of salt pans Actinomycetes for

antibacterial agents. The Internet J Microbiol 1:2.

6. Mutschler, E. 1991, Dinamika Obat, edisi kelima, Penerbit ITB,

Bandung.

7. Suriawiria, Unus. 1983. Pengantar Mikrobiologi Umum. Angkasa :

Bandung.

8. Lay, Bibiana W. 1990. Mikrobiologi. Bandung : Institut Pertanian

Bogor.

9. Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Jakarta. Rineka Cipta.

10. Cross, T. .1988. Actinomycetes: A Continuing Sources of New

Metabolites. Invitation ONR Lecture . Postgraduate School

of Studies in Biological Science,University of Bradford,

BradfordDB7 IDP, Great Britain

11. Locci. R., & G.P. Sharples. 1983.Morphology of Actinomycetes

InGoodfellow M., Mordarski, M. &Williams, S.T. (Eds.) The

Biologyof the Actinomycetes. AcademicPress, London, pp.

7164

12. Jiang, C-L, & Xu, L.-H, 1990, Characteristics Of The Populations Of

Soil ActinomycetesIn Yunnan, Juornal : Actinomycetes 1990 Vol. 1,

Part.3. p67-74. ISSN: 0732-0574.

 LAMPIRAN

Skema kerja

a. Tahap isolasi

diencerkan

Tanah sekitar 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

peternakan sapi

10-1 10-2 10-3

Di spoit 1 ml

Medium SNA

Di inkubasi 1x24
jam (37°C)

b. Tahap inokulasi
Diambil 1 ose

Metode Hasil isolasi

Medium SNA gores

Di inkubasi 1x24
jam (37°C)

c. Tahap antagonis

Potongan isolat
+
ditempelkan isolat
Medium NA
15 ml Biakan bakteri
1 ml
Di inkubasi 1x24
jam (37°C)
d. Tahap fermentasi

Potongan isolat

isolat
Medium starter
(SNB) 10 ml

Diinkubasi 7x24 jam

(di shaker 1 x sehari, 5 menit)

Medium fermentasi
(SNB) 100 ml

Diinkubasi 7x24 jam

(di shaker 1 x sehari, 1 jam)

e. Ekstraksi isolat

50 ml 50 ml

Hasil fermentasi Etil asetat

Digojok ± 30 menit

Diambil filtrat

diuapkan

f. Uji daya hambat

ditempelkan
dcelupkan

+ +
v
Paper disk
Medium Ekstrak dilarutkan
NA Biakan bakteri dengan DMSO
Diinkubasi 1x24 jam (37oC)

Amati zona bening