BAB I

PENDAHULUAN

Bioteknologi merupakan cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup

(bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam

proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Perkembangan bioteknologi tidak hanya

didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lainnya, seperti

biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain

sebagainya. Perkembangan bioteknologi pada abad 21 sudah sangat pesat, terutama di negara-

negara maju. Teknik bioteknologi modern telah berkembang pesat sejak 1970- an.

Perkembangan ini tidak lepas dari peran para ilmuan yang tak kenal lelah untuk

mengembangkan berbagai teknik bioteknologi. Teknik bioteknologi modern yang sudah sering

didengar antara lain teknik kultur jaringan dan Rekayasa Genetik atau yang lebih dikenal

dengan Teknik DNA Rekombinan. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk

yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu.

Tahapan- tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon,

pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA

vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA

rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi

molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.Teknik DNA

Rekombinan melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel

alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen.

Asam deoksiribonukleat, atau DNA adalah molekul yang mengandung instruksi yang

dibutuhkan organisme untuk berkembang, hidup, dan bereproduksi. Instruksi ini ditemukan di

dalam setiap sel, dan diturunkan dari orang tua kepada anak-anak mereka. DNA ditemukan

1
dalam nukleus sel dalam organisme multiseluler, dan pertama kali diisolasi pada tahun 1869,

oleh dokter Swiss Friedrich Miescher. Model heliks ganda dari DNA (asam deoksiribonukleat)

terdiri dari dua untaian yang saling terkait. Helai ini terdiri dari nukleotida, yang terdiri dari

tiga bagian komponen: gugus gula, gugus fosfat, dan basa. Gula dan gugus fosfat bergabung

membentuk 'tulang punggung' untaian DNA yang berulang. Ada empat basa berbeda yang

berpotensi melekat pada kelompok gula: adenin, timin, guanin, dan sitosin, mengingat

peruntukan A, T, G, dan C.

Basis adalah apa yang memungkinkan dua untai DNA untuk bersatu. Gaya antarmolekul

kuat yang disebut ikatan hidrogen antara pangkalan pada untaian yang berdekatan bertanggung

jawab untuk ini; karena struktur basa yang berbeda, adenin (A) selalu membentuk ikatan

hidrogen dengan timin (T), sedangkan guanin (G) selalu membentuk ikatan hidrogen dengan

sitosin (C). Dalam DNA manusia.2

Teknologi DNA rekombinan yaitu mengubah bahan genetik di luar organisme untuk

memperoleh karakteristik yang ditingkatkan dan diinginkan dalam organisme hidup atau

sebagai produk mereka. Teknologi ini melibatkan penyisipan fragmen DNA dari berbagai

sumber, memiliki urutan gen yang diinginkan melalui vektor yang sesuai. Manipulasi dalam

genom organisme dilakukan baik melalui pengenalan satu atau beberapa gen baru dan elemen

pengatur atau dengan mengurangi atau memblokir ekspresi gen endogen melalui

penggabungan ulang gen dan elemen. Pembelahan enzimatik diterapkan untuk mendapatkan

fragmen DNA yang berbeda menggunakan restriksi endonukleasi untuk situs target urutan

DNA spesifik diikuti oleh aktivitas DNA ligase untuk bergabung dengan fragmen untuk

memperbaiki gen yang diinginkan dalam vektor. Vektor kemudian dimasukkan ke dalam

organisme inang, yang ditanam untuk menghasilkan banyak salinan fragmen DNA yang

dimasukkan dalam kultur, dan akhirnya klon yang mengandung fragmen DNA yang relevan

dipilih dan dipanen. Molekul DNA rekombinan (rDNA) pertama dihasilkan pada tahun 1973

2
oleh Paul Berg, Herbert Boyer, Annie Chang, dan Stanley Cohen dari Universitas Stanford dan

Universitas California San Francisco. Pada tahun 1975, selama regulasi "The Asilomar

Conference" dan penggunaan aman teknologi rDNA telah dibahas. Paradoksnya bagi

pandangan para ilmuwan pada masa Asilomar, metode DNA rekombinan untuk mendorong

perkembangan pertanian dan obat-obatan memakan waktu lebih lama daripada yang

diperkirakan karena kesulitan yang tak terduga dan hambatan untuk mencapai hasil yang

memuaskan. Namun, sejak pertengahan 1980-an, jumlah produk seperti hormon, vaksin, agen

terapi, dan alat diagnostik telah dikembangkan terus menerus untuk meningkatkan kesehatan.1

Kloning DNA adalah proses pembuatan banyak salinan identik dari potongan DNA

tertentu. Dalam prosedur kloning DNA khas, gen atau fragmen DNA lain yang menarik

(mungkin gen untuk protein manusia yang penting secara medis) pertama kali dimasukkan ke

dalam potongan DNA melingkar yang disebut plasmid. Penyisipan dilakukan menggunakan

enzim yang "memotong dan menempel" DNA, dan menghasilkan molekul DNA rekombinan,

atau DNA yang dikumpulkan dari fragmen dari berbagai sumber. Selanjutnya, plasmid

rekombinan dimasukkan ke dalam bakteri. Bakteri yang membawa plasmid dipilih dan

tumbuh. Ketika mereka bereproduksi, mereka mereplikasi plasmid dan meneruskannya ke

keturunan mereka, membuat salinan DNA yang dikandungnya.

Kegunaan salinan dari sekuens DNA dalam plasmid yaitu pada beberapa kasus,

membutuhkan banyak salinan DNA untuk melakukan percobaan atau membangun plasmid

baru. Dalam kasus lain, potongan DNA mengkodekan protein yang berguna, dan bakteri

digunakan sebagai "pabrik" untuk membuat protein. Sebagai contoh, gen insulin manusia

diekspresikan dalam bakteri E. coli untuk membuat insulin digunakan oleh penderita diabetes.

3
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1. DNA (Deoxyribonucleotide Acid)

Asam deoksiribonukleat, atau DNA adalah molekul yang mengandung instruksi yang

dibutuhkan organisme untuk berkembang, hidup, dan bereproduksi. Instruksi ini ditemukan di

dalam setiap sel, dan diturunkan dari orang tua kepada anak-anak mereka. DNA ditemukan

dalam nukleus sel dalam organisme multiseluler, dan pertama kali diisolasi pada tahun 1869,

oleh dokter Swiss Friedrich Miescher. Model heliks ganda dari DNA (asam deoksiribonukleat)

terdiri dari dua untaian yang saling terkait. Helai ini terdiri dari nukleotida, yang terdiri dari

tiga bagian komponen: gugus gula, gugus fosfat, dan basa. Gula dan gugus fosfat bergabung

membentuk 'backbone' untaian DNA yang berulang. Ada empat basa berbeda yang berpotensi

melekat pada kelompok gula: adenin, timin, guanin, dan sitosin, mengingat peruntukan A, T,

G, dan C.

Basis adalah apa yang memungkinkan dua untai DNA untuk bersatu. Gaya antarmolekul

kuat yang disebut ikatan hidrogen antara pangkalan pada untaian yang berdekatan bertanggung

jawab untuk ini; karena struktur basa yang berbeda, adenin (A) selalu membentuk ikatan

hidrogen dengan timin (T), sedangkan guanin (G) selalu membentuk ikatan hidrogen dengan

sitosin (C).2

4
 Gambar 2.1. Sruktur DNA

Sel-sel dalam tubuh terus-menerus membelah, meregenerasi, dan mati tetapi agar proses

ini terjadi, DNA di dalam sel harus mampu mereplikasi dirinya sendiri. Selama pembelahan

sel, dua untai DNA terbelah menjadi dua untai tunggal kemudian dapat digunakan sebagai

templat untuk membangun versi baru untai komplementer. Karena A selalu berpasangan

dengan T, dan G selalu berpasangan dengan C, dimungkinkan untuk menyusun urutan basis

pada satu untai menggunakan untai yang berlawanan dan ini yang memungkinkan DNA untuk

mereplikasi dirinya sendiri. Proses ini dilakukan oleh keluarga enzim yang disebut DNA

polimerase.

Ketika DNA digunakan untuk membuat protein, kedua untai juga harus membelah.

Namun, dalam kasus ini, kode DNA disalin ke mRNA (messenger ribonucleic acid), suatu

proses yang dikenal sebagai 'transkripsi'. Struktur RNA sangat mirip dengan DNA, tetapi

dengan beberapa perbedaan utama. Pertama, mengandung gugus gula yang berbeda dalam

tulang punggung gula fosfat molekul: ribosa bukan deoksiribosa. Kedua, masih menggunakan

basa A, G dan C, tetapi alih-alih basa T, ia menggunakan urasil, U. Struktur urasil sangat mirip

dengan timin, dengan tidak adanya kelompok metil (CH3) menjadi satu-satunya perbedaan.

5
 Sifat penting dari DNA adalah dapat bereplikasi, atau membuat salinannya sendiri.

Setiap untai DNA dalam heliks ganda dapat berfungsi sebagai pola untuk menduplikasi urutan

basa. Ini sangat penting ketika sel membelah karena setiap sel baru perlu memiliki salinan tepat

dari DNA yang ada dalam sel lama.

Setelah nukleotida DNA disalin, mRNA dapat meninggalkan nukleus sel dan menuju

sitoplasma yaitu tempat sintesis protein terjadi. Di sini, molekul rumit yang disebut ribosom

'membaca' urutan basa pada molekul mRNA. Asam amino individu, yang membentuk protein,

dikodekan oleh tiga bagian huruf dari untai mRNA. Kode yang mungkin berbeda, dan asam

amino yang dikodekan untuknya, dirangkum dalam posting sebelumnya yang melihat struktur

asam amino. Jenis RNA yang berbeda, transfer RNA, bertanggung jawab untuk mengangkut

asam amino ke mRNA, dan memungkinkan mereka untuk bergabung bersama.

Namun, proses ini tidak selalu sempurna. Kesalahan dapat terjadi dalam menyalin urutan

DNA ke mRNA, dan kesalahan acak ini disebut sebagai mutasi. Kesalahan bisa dalam bentuk

basis yang diubah atau bahkan basis yang dihapus atau ditambahkan. Beberapa bahan kimia,

dan radiasi, dapat menyebabkan perubahan ini, tetapi mereka juga dapat terjadi tanpa adanya

efek eksternal ini. Mereka dapat menyebabkan kode asam amino diubah menjadi kode lain,

atau bahkan tidak terbaca. Sejumlah penyakit dapat terjadi akibat mutasi selama replikasi

DNA, termasuk cystic fibrosis, dan anemia sel sabit, tetapi patut dicatat bahwa mutasi juga

dapat memiliki efek positif.

Meskipun hanya ada 20 asam amino, tubuh manusia dapat menggabungkannya untuk

menghasilkan sekitar 100.000 protein. Pemuatan DNA adalah proses yang berkelanjutan, dan

rantai protein tunggal dapat memiliki 10-15 asam amino yang ditambahkan ke dalamnya per

detik melalui garis besar proses di atas. Karena tujuan tulisan ini terutama untuk menguji

6
struktur kimia DNA, pembahasan replikasi dan sintesis protein tetap singkat dan relatif

sederhana.

2.2 Rekombinasi DNA

Bioteknologi merupakan cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup

(bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam

proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Perkembangan bioteknologi tidak hanya

didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lainnya, seperti

biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia,matematika, dan lain

sebagainya. Perkembangan bioteknologi pada abad 21 sudah sangat pesat, terutama di negara-

negara maju. Teknik bioteknologi modern telah berkembang pesat sejak 1970- an.

Perkembangan ini tidak lepas dari peran para ilmuan yang tak kenal lelah untuk

mengembangkan berbagai teknik bioteknologi

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan atau dengan istilah yang lebih

populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatusel yang

bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah

diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salahsatu di

antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA

rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan

molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi

danmengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel

inang.Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan

mengisolasidan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi

dan mekanismekontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen

tertentu dalam waktulebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.

7
 Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui

teknologiDNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan

tersebutadalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA

menjadisejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen

DNA kedalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel

inangmenggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel

inang, dananalisis DNA rekombinan.

Kloning molekuler adalah proses laboratorium yang digunakan untuk membuat DNA

rekombinan. Proses ni adalah salah satu dari dua metode yang paling banyak digunakan,

bersama dengan reaksi rantai polimerase (PCR), digunakan untuk mengarahkan replikasi dari

setiap urutan DNA spesifik yang dipilih oleh peneliti. Ada dua perbedaan mendasar antara

metode. Salah satunya adalah bahwa kloning molekuler melibatkan replikasi DNA dalam sel

hidup, sementara PCR mereplikasi DNA dalam tabung reaksi, bebas dari sel-sel hidup.

Perbedaan lainnya adalah bahwa kloning melibatkan pemotongan dan menempelkan sekuens

DNA, sedangkan PCR diperkuat dengan menyalin sekuens yang ada.

Pembentukan DNA rekombinan membutuhkan vektor kloning, molekul DNA yang

mereplikasi dalam sel hidup. Vektor umumnya berasal dari plasmid atau virus, dan mewakili

segmen DNA yang relatif kecil yang mengandung sinyal genetik yang diperlukan untuk

replikasi, serta elemen tambahan untuk kenyamanan dalam memasukkan DNA asing,

mengidentifikasi sel yang mengandung DNA rekombinan dan jika diperlukan untuk

mengekspresikan DNA asing. Pilihan vektor untuk kloning molekuler tergantung pada pilihan

organisme inang, ukuran DNA yang akan dikloning, apakah dan bagaimana DNA asing akan

diekspresikan. Segmen DNA dapat dikombinasikan dengan menggunakan berbagai metode,

seperti pembatasan enzim / ligase kloning.

8
 Dalam standar protokol kloning, mengkloning setiap fragmen DNA pada dasarnya

melibatkan tujuh langkah: (1) Pilihan organisme inang dan vektor kloning, (2) Persiapan DNA

vektor, (3) Persiapan DNA yang akan dikloning, (4) Pembuatan DNA rekombinan, (5)

Pengenalan DNA rekombinan ke dalam organisme inang, (6) Pemilihan organisme yang

mengandung DNA rekombinan, dan (7) Penapisan untuk klon dengan sisipan DNA dan sifat

biologis yang diinginkan.

Secara garis besar ada tiga tipe rekombinasi genetik yang sudah banyak diketahui, yaitu

rekombinasi homolog/umum, rekombinasi khusus (site-specific rekombination), dan

rekombinasi transposisi/replikatif.

2.2.1. Rekombinasi Homolog

Rekombinasi homolog menyebabkan terjadinya pertukaran antarmolekul DNA yang

merupakan homologi urutan nukleotida cukup besar. Ciri khusus rekombinasi homolog adalah

bahwa proses tersebut dapat terjadi setiap titik di daerah homologi. Rekombinasi terjadi melalui

tahap pemotongan untaian DNA yang kemudian diikuti dengan proses penggabungan kembali.

Rekombinasi antarkromosom melibatkan proses pertukaran secara fisik antara bagian-bagian

kromosom. Proses rekombinasi terjadi secara akurat sehingga tidak ada satupun pasangan basa

nukleotida yang hilang atau ditambahkan ke dalam kromosom rekombinan. Proses pertukaran

tersebut menyebabkan terbentuknya struktur yang dapat terlihat sebagai kiasma (chiasma) pada

waktu meiosis. Kiasma merupakan tempat pemotongan dan penggabungan kembali untai

DNA, yaitu ketika dua kromatid yang berbeda (non-sister chromatids) terpotong dan

tergabungkan satu sama lain. Rekombinasi homolog dimulai ketika dua kromosom homolog

terletak berdekatan satu sama lain sehingga urutan nukleotida yang homolog dapat

dipertukarkan. Kontak antara dua pasang kromosom tersebut, disebut sebagai proses sinapsis,

terjadi pada awal meiosis yaitu pada profase.

9
 Rekombinasi genetik homolog melibatkan pertukaran genetik antara dua molekul DNA

(atau segmen molekul yang sama) yang mendiami wilayah yang luas dengan susunan homolog.

Susunan basa yang sebenarnya pada DNA tidak sesuai sepanjang susunan dua DNA yang

sama. Daerah rekombinasi khusus berbeda dalam hal pertukaran yang hanya terjadi pada

susunan DNA yang terdefinisi. Perubahan DNA adalah berbeda dalam hal perubahan ini

melibatkan segment pendek DNA dengan kapasitas yang luar biasa untuk berpindah dari satu

lokasi kromosom ke lokasi yang lain. “gen hopping” ini merupakan gen yang pertama kali

diamati pada maizena oleh Barbara McClintock pada tahun 1950. Tambahan lagi tentang kelas

terkarakterisasi ini, ada jarang yang lebar penyusunan kembali yang tidak biasa dimana tidak

ada mekanisme dan tujuan yang diajukan. Pembahasan dari mekanisme rekombinasi harus

selalu menyertakan stuktur DNA yang luar biasa. Pada rekombinasi genetik homolog, dua

molekul DNA berinteraksi dan meluruskan susunannya yang sama pada beberapa tahapan

reaksi. Proses pelurusan ini bisa melibatkan formasi DNA menengah barudima tiga atau

bahkan empat strand dilepaskan. Cabang struktur DNA juga ditemukan sebagai rekombinan

menengah. Pertukaran informasi antara dua makromolekul helix besar sering melibatkan

jalinan strand kompleks.

Gambar 2.2. Skema DNA rekombinan homolog

10
 Rekombinasi genetik homolog (juga disebut rekombinasi umum) dihubungkan secara

kuat dengan divisisel pada eukaryotik. Proses yang terjadi dalam frekuensi tinggi selama

meiosis, proses yang mana sel germline dengan dua pasangan kromosom yang cocok (sel

diploid) membagi untuk memproduksi satu set gamet—sel sperma atau ovum pada eukaryotik

yang lebih tinggi masing-masing gamet memiliki satu anggota untuk masing-masing pasangan

kromosom (sel haploid). Proses pada meiosis dimulai dengan replikasi DNA pada sel germ

sehingga masing-masing molekul DNA ada pada empat salinan. Sel kemudian berkembang

sepanjang proses dua divisi sel meiotik yang mengurangi kandungan DNA pada level haploid

pada masing-masing empat sel inang. Setelah DNA direplikasi selama profase I (profase divisi

meiotik pertama), hasil salinan DNA terasosiasi dengan sentromernya dan disebut sebagai

kromatid saudara. Masing-masing set molekul DNA homolog disusun sebagai dua pasang

kromatid. Informasi genetik ditukar antara kromatid genetik homolog terdekat pada tahap

meiosis dengan alat rekombinasi genetik homolog. Proses ini melibatkan kerusakan dan

penggabungan kembali DNA. Pertukaran juga disebut pindah silang, pindah silang

menghubungkan dua pasang kromatid saudara bersama-sama pada titik yang disebut chiasmata

(tunggal, chiasma). Hal ini secara efektif menghubungkan keempat kromatid homolog

bersama-sama, dan hubungan ini sangat esensial untuk segregasi kromosm yang tepat pada

divisi sel meiotik berikutnya. Pendekatan awal, rekombinasi atau pindah silang dapat terjadi

dengan kemungkinan yang sama pada hampir semua titik sepanjang kromosom homolog.

Frekuensi rekombinasi pada daerah yang memisahkan dua titik pada kromosom sebanding

dengan jarak antar titik. Fakta ini digunakan selama penerapan dekade untuk memetakan posisi

relatif dan jarak antara gen; rekombinasi homolog merupakan proses molekuler yang underpin

banyak penerapan ilmiah genetik.

Pada bakteri yang tidak menjalani meiosis, rekombinasi genetik terjadi pada proses

seperti konjugasi, perkawinan dimana kromosom DNA ditransfer antara dua sel bakteri yang

11
berhubungan secara dekat, hal ini dapat terjadi dalam sel tunggal antara dua kromosom

homolog, ada selama atau setelah replikasi.

Tipe rekombinasi ini menyediankan setidak-tidaknya tiga fungsi yang bisa

diidentifikasi :(1) tipe rekombinasi ini berkontribusi terhadap perbedaan genetik pada populasi;

(2) pada eukariot menyediakan penghubung sementara antara kromatid yang secara nyata

mengoreksi urutan segregasi pada kromosom ke sel inang pada divisi sel meiotik pertama; dan

(3) berkontribusi untuk memperbaiki beberapa tipe kerusakan DNA.

Fungsi pertama dan kedua sering menjadi bahan yang menarik bagi ilmuan untuk studi

tentang sel, dan rekombinasi homolog sering dijelaskan sebagai sumber perbedaan genetik.

Namun, fungsi perbaikan DNA merupakan peranan yang paling penting pada sel. Perbaikan

DNA seperti yang dijelaskan disebut pada fakta bahwa luka DNA pada satu strand dapat

diperbaiki secara akurat karena informasi genetik dijaga di dalam strand saling melengkapi

yang tidak rusak. Pada tipe luka tertentu, seperti luka pada strand ganda, strand ganda tautan

silang, luka yang ditinggalkan strand tunggal setelah replikasi strand komplementer rusak atau

tidak ada. , ketika hal ini terjadi, informasi yang dibutuhkan untuk perbaikan DNA yang akurat

harus berasal dari kromosom homolog yang terpisah dan perbaikan yang melibatkan

kromosom homolog. Jenis luka ini umumnya berasal radiasi ionisasi dan reaksi oksidatif, dan

perbaikannya mengoreksi produksi gamet eukariot yang bisa hidup dan keberadaan bakteri

setiap harinya. Perbaikan yang dimediasi oleh rekombinasi genetik homolog disebut perbaikan

rekombinasi (recombinant repair).

Berbeda dari proses rekombinasi homolog, rekombinasi khusus hanya terjadi pada

tempat khusus di dalam segmen molekul DNA. Pertukaran materi genetik dilakukan oleh

protein khusus yang mengkatalisis pemotongan dan penggabungan molekul DNA secara tepat

pada tempat terjadinya rekombinasi. Proses rekombinasi semacam ini tidak tergantung pada

protein recA. Rekombinasi khusus mempunyai beberapa ciri yaitu (i) proses rekombinasi

12
terjadi di tempat khusus pada kedua fragmen DNA, (ii) rekombinasi berlangsung timbal balik

(reciprocal), artinya kedua hasil pertukaran genetik tersebut dapat diperoleh kembali, (iii)

rekombinasi terjadi secara konservatif, artinya proses pertukaran genetik tersebut dilakukan

melalui pemotongan dan penyambungan kembali bagian DNA yang berekombinasi tanpa ada

sintesis nukleotida baru, dan (iv) bagian yang mengalami rekombinasi tersebut mempunyai

homologi dalam hal urutan nukleotida.

Gambar 2.3. Rekombinasi khusus spesifik

2.2.2. Isolasi DNA

Saat ini kita dapat menemukan berbagai macam metode ektraksi DNA. Para peneliti

selalu berusaha menyederhanakan tahapan yang digunakan atau mengurangi jumlah

perlakukan. Tahapan atau perlakuan yang terlalu panjang dan terlalu kompleks sering

meningkatkan resikok egagalan, terutama bagi pemula. Tahapan atau perlakuan dalam

ekstraksi DNA juga dipengaruhi asal sel atau jaringan target.DNA biasanya diisolasi dari sel

dengan menggunakan metode yang melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA. Langkah

ini biasanya melibatkan EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) yang dalam proses tersebut

13
akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim D Nase). Idealnya

dinding sel (jika ada) didigesti secara enzimatis (misalnya dengan enzim lisosim). Selanjutnya

membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. Jika disrupsi fisik dibutuhkan

sebaiknya dilakukan seminim mungkin. Dalam proses disrupsi ini enzim nuklease yang

terlepas dari komponen selular dapat mencerna asam nukleat secara efisien, sehingga kerja

enzim nuklease harus dihambat. Disrupsi sel dan sebagian besar langkah selanjutnya sebaiknya

dilakukan pada suhu 40 C, menggunakan alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah di-

autoclave (fungsi autoclave adalah untuk menghancurkan aktivitas DNase pada alat

atau larutan tersebut). Setelah melepaskan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan

dengan penambahan RNase yang telah diterapi panas untuk menginaktivasi DNase kontaminan

(RNase relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang akan menyebabkan

proses renaturasi ketika didinginkan). Kontaminan mayor lainnya, yaitu protein, dihilangkan

dengan dengan larutan fenol atau campuran fenol-khloroform (keduanya akan mendenaturasi

protein tetapi tidak mendenaturasi asam nukleat). Setelah campuran tersebut dibuat menjadi

emulsi, dilakukan sentrifugasi. Setelah sentrifugasi akan terbentuk bagian organik di bagian

bawah dan bagian aquos di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri dari protein yang

terdenaturasi. Cairana aquous diambil dan dideproteinisasi beberapa kali sampai tidak ada lagi

material yang terlihat pada lapisan tengah. Kemudian DNA yang sudah tidak mengandung

protein ini dicampur dengandua bagian etanol. DNA akan menjadi presipitat, terpisah dari

larutan sampel tersebut. Setelah disentrifugasi, pelet DNA kemudian dilarutkan kembali.

Secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional adalah sebagai

berikut:

1. Homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 40 C, semua bahan dan peralatan steril)

2. Lisis seluler (dengan detergen atau lisosim)

3. Penambahan chelating agents: EDTA/sitrat

14
 4. Penambahan proteinase (proteinase K)

5. Ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform)

6. Presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol)

7. Pelarutan kembali DNA, misalnya dengan bufer TE (Tris-EDTA)

Beberapa senyawa mempunyai fungsi multipel dalam protokol ekstraksi asam nukleat.

Agen chaotropic seperti GuSCN (guanidine isothiocyanate), NaI (sodium iodide), dan LiCl

(lithium chloride) memiliki kemampuan untuk menghancurkan kapsul lemak dan

merusak integritas sel, denaturasi protein dan menginaktivasi nuklease. GuSCN dengan

molaritas di atas 4M dapat mempresipitasi DNA dan RNA berberat molekular tinggi.

Dalam lingkungan yang tinggi garam chaotropic ini senyawa silika dapat berikatan

secara spesifik dengan molekul DNA dan RNA, sedangkan lemak dan protein kontaminan

hanya mempunyai afinitas yang moderat terhadap silika sehingga dapat dicuci bersih darinya.

Absorbsi asam nukleat pada matriks silika meningkat pada pH asam dan konsentrasi garam

yang tinggi,sehingga larutan bufer yang mengandung pH yang tinggi dan konsentrasi garam

yang rendahdapat digunakan untuk mencuci-lepaskan asam nukleat dari matriks silika .Cara

lain pemanfaatan silika dalam proses ekstraksi asam nukleat adalah dengan melakukan

perubahan kimia pada matriks silika sehingga akan secara spesifik berikatan dengan protein

atau polisakarida (prosesnya berkebalikan dengan penjelasan sebelumnya). Ekstraksiasam

nukleat berbasis silika ini telah menjadi dasar metode ekstraksi asam nukleat kit komersial.

Matriks silika dalam kit komersial tersebut dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, seperti

filter (spin column), gel (glassmilk, silica gel), suspensi (celite, plain-coarse silicate), bahkan

partikelberselubung magnetik (Dynabeads). Filtrasi, sentrifugasi, atau penggunaan magnet

memungkinkan pemisahan asam nukleat yang berikatan dengan silika dari kontaminasi lemak,

karbohidrat dan protein melalui langkah pembilasan yang multipel. Metode ini juga mendasari

pembuatan alat ekstraksi asam nukleat.

15
 Metode alternatif yang berbasis matriks silika antara lain teknik hibridisasi fragmen

asam nukleat yang menggunakan probe yang didesain spesifik yang melekat pada matriks solid

atau bead magnetik. Kelemahan umum dari teknik penangkapan seperti ini adalah selama

proses pelekatan dan cuci-lepas, dapat terjadi fragmentasi dan hilangnya DNA target.DNA juga

dapat diisolasi dari organela spesifik atau partikel virus. Untuk ekstraksi DNAsemacam ini

sebaiknya dilakukan isolasi organela target atau virus tersebut terlebih dahulu sebelum

dilakukan ekstraksi DNA-nya karena isolasi DNA target dari campuran DNA (DNAtotal)

relatif sulit. Jika dibutuhkan isolat DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNA dapat

dimurnikan dengan density gradient centrifugation menggunakan CsCl (Caesium chloride).

Untuk memeriksa integritas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel

agarose. Secara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada gel agarose tersebut

juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat DNA kita. Cara yang lebih akurat

untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh adalah dengan

menggunakan spektrofotometer UV. DNA untai tunggal mempunyai koefisien absorbsi 0,027,

DNA untai ganda 0,02 dan RNA 0,025 per-ml per-cm pada panjang gelombang 260 nm. Rasio

absorbs 260/280 nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi protein atau fenol

(proteinmemiliki absorbsi maksimum pada 280 nm).

Sampel DNA yang murni memiliki rasio 260/280 nm sebesar 1,8-1,9, sedangkan

sampelRNA yang murni 1,9-2,0. Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian

yang signifikan yang masih tertinggal di dalam sampel. Saat ini sudah banyak dijual alat

spektrofotometer otomatik yang secara otomatis mengkalkulasi rasio 260/280 nm dan

kuantitasasam nukleat. Yang perlu diingat dalam penggunaan spektrofotometer adalah jangan

lupa untuk selalu melakukan kalibrasi dengan larutan ³blank´ sebelum memeriksa konsentrasi

asam nukleatsampel. Yang digunakan sebagai blank adalah pelarut yang digunakan untuk

melarutkan asam nukleat yang diperiksa.

16
2.2.3. Enzim Restriksi

Enzim restriksi atau disebut juga enzim endonuklease restriksi merupakan bagian dari

sistem kekebalan bakteri untuk melindungi bakteri dari infeksi DNA asing. Enzim

endonuklease restriksi biasanya diberi nama berdasarkan nama bakteri asal enzim tersebut

diisolasi. Saat ini telah dikenal lebih dari 200 enzim restriksi dengan sekuens tempat

pembelahan yang spesifik. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat

ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan

infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E.

coli, yakni strain K dan C.

Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian

digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih

kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini,

dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1. Namun, jika l

yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya

10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan.

Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika

direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem

restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K.

Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul

DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi

lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai

sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan

tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi

tersebut.

17
 DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus

infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim

restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir

putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke

strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi.

Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA.

Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA

baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi. Enzim restriksi dari strain

K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu

kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. Banyak enzim serupa yang ditemukan

kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya.

Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke

dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim

tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari

475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah

menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika.

Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai

berikut:

1. Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul

DNA.

2. Memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat

pengenalannya.

3. Menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.

Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal

yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti

18
aturan sebagai berikut. Huruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi

enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua

nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari

nama strain bakteri, dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda

tetapi diisolasi dari spesies yang sama.

Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang

basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-

fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak

sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu

sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau

ujung kohesif.

Gambar 2.4. Enzim Restriksi

Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat

pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan

mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya.

Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan.

Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung

19
tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim

deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3.

Tabel 2.1. Contoh enzim-enzim restriksi

Enzim Organisme Urutan Pengenal Ujung Potongan

EcoRI Escherichia coli RY13 GAATTC sticky-end

HindIII Haemophylus influenzae Rd AAGCTT sticky-end

HinfI Haemophylus influenzae Rf GANTC sticky-end

HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC blund end

AluI Arthrobacter luteus AGCT blund end

SmaI Serratia marcescens CCCGGG blund end

XbaI Xanthomonas badrii TCTAGA sticky-end

2.2.4. Ligasi Molekul – molekul DNA

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus

menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA

genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah

berbentuk linier.

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in

vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi

menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau

lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk

meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket

maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu

pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal

20
homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan,

yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini

ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak

stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu,

ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang

diperpanjang (sering kali hingga semalam).

Gambar 2.5. Pemberian DNA Ligase pada Vektor

Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya

plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah

dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan

menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa

cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan

dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul

DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan

21
enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti

telah disebutkan di atas.

2.2.5. Transformasi

Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA

genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut.

menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa

fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga

terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang

agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut

selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA

plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke

dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami

perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.

Gambar 2.6. Transformasi plasmid rekombinan pada bateri E. coli.

Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan

A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada

beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus

subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah

dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium

minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan

22
preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan

menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi

E.coli.

Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid

(CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag l. Pada

tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan bahwa sel-sel yang diperlakukan

dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan

diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5ºC.

Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45ºC selama lebih kurang satu menit yang diberikan

setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi

transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi

transformasinya daripada molekul DNA kecil.

Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidak-tidaknya

transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel

bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya

sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan

membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel.

Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan.

2.2.6. Seleksi (Screening)

Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan,

maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA

rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan

masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa

fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

23
 Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid.

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu

(1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang

dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan

dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara

kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel

inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan

kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga

dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan

salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan

ketigalah yang terjadi.

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui

cara yang dinamakan hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran

nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal

tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan

pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi

koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni

sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

24
 Gambar 2.7. Teknik melakukan Screening.

2.2.7. Vektor

Vector adalah sebuah agen yang dapat membawa fragmen DNA ke dalam sel inang.

Ada dua macam vector yaitu vector cloning yang digunakan untuk memproduksi fragmen

DNA dan vector ekspresi yang digunakan untuk mengekspresikan gen tertentu dalam fragmen

DNA. Ada beberapa vector yang sering digunakan dalam teknik DNA rekombinan, antara lain

plasmid, phaga, cosmid, YAC, BAC, dan Ti-Plasmid.

1. Plasmid

Plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat

bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah jenis, dan jumlah

tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri.

Ukuran plasmid berkisar antara beberapa kbp hingga mendekati 100kbp. Sebuah vector

plasmid juga harus mengandung gen resistensi obat untuk amplifikasi selektif.

25
 Gambar 2.8. Struktur Plasmid.

Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel

bila memiliki:

a. Replikator (origin of replication)

b. Penanda (Marker) yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)

c. Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa nukleotida yang

menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau

penanda

2. Phaga

Phaga merupakan virus yang dapat menginfeksi bakteri, tersusun atas molekul DNA

yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus). Keuntungan

utama dari vector phaga adalah efisiensi transformasi yang tinggi, sekitar 1000 kali lebih

efisien dari pada vector plasmid.

Terdapat dua jenis siklus hidup phaga yaitu:

a. Siklus litik yaitu siklus yang diakhiri degan pelepasan fage baru dari bakteri yang

menjadi sel inang karena terjadi lisis .

b. Siklus lisogenik yaitu siklus dimana DNA fage tersisip di dalam kromosom bakteri

yang berfungsi sebagai sel inang.

26
 Gambar 2.9. Struktur phaga.

3. Cosmid

Cosmid merupakan vector kombinasi antara vector plasmid dan situs COS yang

memungkinkan DNA target untuk dimasukkan ke dalam kepala situs COS. Teknik ini memiliki

keuntungan yaitu efisiensi transformasi yang tinggi dan cosmid dapat membawa 45 kbp

dibandingkan plasmid dan phaga yang dibatasi hingga 25 kbp.

Gambar 2.10. Strukur Cosmid.

27
 4. YAC

Yeast Artificial Chromosomes (YAC) merupakan vector yang mampu membawa fragmen

DNA hingga sebesar 2mbp, untuk membuat pustaka genom yang berukuran besar. Digunakan

untuk membuat pengurutan (sequencing) organisme genom organisme eukaryote, namun

efisiensi transformasi sangat rendah.

Gambar 2.11. Penyisipan YAC pada DNA target

5. BAC

Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) adalah membentuk DNA berdasarkan

kesuburan fungsional plasmid (atau F-plasmid), digunakan untuk mengubah dan kloning pada

bakteri, F-plasmid memainkan peran penting partisi karena mengandung gen yang

mempromosikan pemerataan plasmid setelah pembelahan sel bakteri. Buatan bakteri yang

biasa menyisipkan kromosom ukuran 150-350 KBP, tetapi dapat lebih besar dari 700 KBP.

28
 Gambar 2.12. Strutur BAC

BAC sering digunakan untuk urutan genom organisme dalam proyek genom, misalnya

Proyek Genom Manusia. Potongan pendek organisme DNA diperkuat sebagai masukkan

BAC, dan kemudian sequencing. Akhirnya, bagian-bagian yang mengatur sequencing in

silico, menghasilkan urutan genom organisme.

2.2.8. Gel Elektroforesis

Elektroforesis adalah sebuah teknik yang biasa digunakan di laboratorium

untuk memisahkan campuran DNA, RNA atau protein berdasarkan ukuran molekulnya. Pada

elektroforesis gel, molekul yang ingin dipisahkan didorong oleh medan elektrik melalui sebuah

gel yang berpori kecil. Molekul akan berjalan melalui pori dalam gel pada kecepatan

yang berbanding terbalik dengan panjangnya. Artinya, molekul DNA yang lebih kecil akan

melalui jarak yang lebih jauh melalui gel daripada molekul DNA yang lebih besar.

Untuk memahami fungsi aplikatif dari elektroforesis, ia memiliki kesamaan dengan

kromatografi yaitu untuk memisahkan komponen zat tertentu untuk dianalisis lebih lanjut,

29
namun dalam hal elektroforesis ia memanfaatkan prinsip medan elektrik untuk memisahkan

molekul yang berbeda ukuran.

Gambar 2.13. Elektroforesis

Seperti yang sebelumnya disebutkan, elektroforesis gel melibatkan medan elektrik;

mudahnya, medan ini dibuat dengan satu ujung gel memiliki muatan positif dan pada ujung

lainnya bermuatan negatif. Karena DNA dan RNA bermuatan negatif, ia akan tertarik menuju

medan yang bermuatan positif. Namun untuk protein yang tidak bermuatan negatif, jika

peneliti ingin memisahkan protein menggunakan elektroforesis gel maka pertama-tama protein

harus dicampur dengan deterjen yang disebut Sodium Deodecyl Sulfate. Perlakuan ini

membuat protein terbuka menjadi bentuk linear dan selnjutnya diselubungi muatan negatif

yang mengizinkannya untuk berpindah menuju medan bermuatan positif pada gel dan terpisah.

Akhirnya, setelah molekul DNA, RNA, atau protein terpisah menggunakan elektroforesis gel,

pita (band) yang menunjukkan ukuran berbeda tiap molekul dapat dideteksi.

30
2.2.9. Hibridisasi asam nukleat
Hibridisasi asam nukleat adalah salah satu metode analisis yang paling sering

digunakan. Teknik ini digunakan untuk Southern blotting, Northern blotting dan untuk skrining

library. Tujuan metode ini adalah untuk melihat (visulisasi) sekuens asam nukleat tertentu

(DNA atau RNA) dalam lingkungan/latar belakang campuran sekuens lain yang kompleks.

Teknik ini memanfaatkan sifat DNA yaitu dua untai asam nukleat yang komplemen akan saling

mengikat (hibridisasi) dengan tingkat spesifisitas yang tinggi.

1. Southern Blotting

Southern blotting dimulai dengan pemisahan elektroforesis gel fragmen DNA yang

telah didigesti dengan enzim pemotong. DNA kemudian didenaturasi (dipisahkan

menjadi 2 untai tunggal) dengan perlakuan alkali, selanjutnya untai tunggal ditransfer

ke membran melalui transfer kapilaritas. DNA akan terikat pada secara kovalen pada

membran dan diimobilisasi pada fase padat, menghasilkan replika fragmen pada gel.

Fagmen DNA spesifik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi

menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen gen yang dikehendaki.

2. Northern Blotting

Pemisahan gel dan hibridisasi asam nukleat dapat juga untuk analisis RNA

menggunakan prosedur Northern blotting. Beberapa hal yang membedakan dengan

Southern blotting adalah: (1) RNA jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding

DNA, oleh karena itu elektroforesis dilakukan dalam buffer yang mengandung zat

kimia yang bersifat melindungi (biasanya formaldehid), (2) RNA sudah berupa untai

tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih ringan, (3) RNA biasanya

berukuran tertentu sehingga tidak memerlukan digesti enzim untuk memperoleh pola

pita.

31
2.2.10. DNA Library (Perpustakaan DNA)

Ada dua jenis utama perpustakaan DNA yang dibangun oleh para ilmuwan yang

menggunakan teknik rekayasa genetika. Itu adalah perpustakaan cDNA dan perpustakaan

Genomik. Perbedaan utama antara perpustakaan cDNA dan genomik adalah bahwa pustaka

'cDNA berisi DNA komplementer kloning dari total mRNA organisme sementara

perpustakaan genomik DNA mengandung fragmen kloning dari seluruh genom suatu

organisme. Perpustakaan DNA genom lebih besar dari perpustakaan cDNA.

Perpustakaan genomik DNA adalah kumpulan klon yang mengandung fragmen DNA

genom total organisme. Ini berisi seluruh DNA genom organisme itu, termasuk urutan

pengkodean dan nonkode. Pembangunan perpustakaan genom dilakukan oleh teknologi DNA

rekombinan yang diikuti dengan kloning (rekayasa genetika).

Prosesnya dimulai dengan isolasi DNA genomik. Dengan menggunakan protokol

ekstraksi DNA yang sesuai, DNA genomik total organisme harus diisolasi. Kemudian DNA

harus diubah menjadi ukuran yang mudah diatur atau ke dalam fragmen spesifik dengan

restriksi endonuklease (enzim pemotongan DNA). DNA terfragmentasi harus dimasukkan ke

dalam vektor yang menggunakan ligas DNA (enzim penyatu DNA). Vektor adalah organisme

yang mereplikasi dirinya sendiri. Plasmid dan bakteriofag umumnya digunakan vektor dalam

teknologi DNA rekombinan. Vektor ligasi ini dikenal sebagai molekul DNA rekombinan

karena keduanya membawa sekumpulan DNA sendiri dan dimasukkan. Rekombinan vektor

ditambahkan ke bakteri inang dan dibuat untuk menyerap vektor rekombinan di dalam sel

bakteri. Bakteri dengan vektor rekombinan (plasmid) harus ditanam dalam media kultur.

Selama penggandaan bakteri, DNA bakteri, bersama dengan plasmid rekombinan, meniru

genom mereka dan menghasilkan klon. Klon ini mengandung seluruh genom organisme

sumber. Makanya, itu disebut perpustakaan genomik. Plasmid dapat dengan mudah dipisahkan

dari DNA kromosom bakteri untuk membangun perpustakaan genom organisme tersebut. Jika

32
organisme tertentu mengandung gen yang tertarik, mudah untuk mendeteksi di perpustakaan

genom dengan hibridisasi menggunakan probe molekuler (spidol).

Perpustakaan cDNA adalah kumpulan klon DNA pelengkap (cDNA) yang disintesis dari

total mRNA organisme. Prosedur konstruksi melibatkan berbagai langkah. Pemurnian total

mRNA dari organisme adalah langkah pertama yang terlibat. MRNA terisolasi diubah menjadi

untai cDNA dengan proses yang disebut reverse transcription. Transkripsi terbalik difasilitasi

oleh enzim yang disebut reverse transcriptase. Ini menggunakan primer 3 'kecil dan memulai

sintesis untai cDNA pertama yang melengkapi mRNA template untai.

Hasil cDNA terdoping ganda diubah menjadi fragmen yang lebih kecil menggunakan

endonuklease restriksi dan dimasukkan ke dalam vektor yang sesuai. Molekul rekombinan

yang dibangun ini kemudian ditambahkan ke dalam organisme inang dan ditanam dalam media

kultur untuk menghasilkan klon. Kumpulan klon yang mengandung fragmen cDNA dari

organisme dikenal sebagai perpustakaan cDNA. MRNA matang yang diiris seluruhnya tidak

mengandung intron dan area peraturan. Oleh karena itu fragmen non-coding tidak ada di

perpustakaan cDNA tidak seperti di perpustakaan genomik. Perpustakaan cDNA penting untuk

analisis daerah pengkodean, fungsi gen, ekspresi gen dan lain-lain.

2.3. Escherichia coli

Escherichia coli atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu

jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan

oleh Theodor Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E.

Coli tidak berbahaya, tetapi beberapa, seperti E. Coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan

keracunan makanan yang serius pada manusia yaitu diare berdarah karena eksotoksin yang

dihasilkan bernama verotoksin. Toksin ini bekerja dengan cara menghilangkan satu

basa adenin dari unit 28S rRNA, sehingga menghentikan sintesis protein. Sumber bakteri ini

33
contohnya adalah daging yang belum masak, seperti daging hamburger yang belum matang. E.

Coli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K2,

atau dengan mencegah bakteri lain di dalam usus.

Gambar 2.14. Mikroskopis Escherichia coli

E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan

sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E.

coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. Negara-

negara di eropa sekarang sangat mewaspadai penyebaran bakteri E. Coli ini, mereka bahkan

melarang mengimpor sayuran dari luar.

34
 BAB III

KESIMPULAN

 Rekayasa genetika merupakan proses dan teknik untuk menghasilkan produk dan jasa

yang melibatkan pemanfaatan mikroba

 Rekombinasi DNA adalah proses pertukaran elemen genetik yang dapat terjadi antara

untaian DNA yang berlainan atau antara bagian-bagian gen yang terletak dalam satu

untaian DNA

 Rekombinasi homolog dapat terjadi pada sel eukariot (proses meiosis) dan sel

prokariot (proses konjugasi)

 Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tak berujung) yang berukuran kecil

yang terdapat di dalam sitoplasma, dan dapat melakukan replikasi secara autonom

 Recovery fragmen DNA meliputi proses restriksi plasmid, elusi, ligasi dan

transformasi

 Isolasi DNA plasmid meliputi 3 tahap penting yaitu lisis membran sel bakteri,

ekstraksi DNA dan pengendapan DNA

 Mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan ujung tidak rata

sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu

menggunakan ujung rata

 Jenis-jenis vector yaitu, plasmid, phaga, cosmid, YAC dan BAC.

 E. coli dipilih untuk teknologi rekayasa genetika karena pertumbuhannya sangat cepat

dan mudah dalam penanganannya.

35
 DAFTAR PUSTAKA

1. Khan S, Ullah MW, Siddique R, Nabi G, Manan S, Yousaf M, et al. Role of

Recombinant DNA Technology to Improve Life. Int J Genomics [Internet]. 2016 [cited
2019 Jul 13];2016:2405954. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28053975
2. The Chemical Structure of DNA | Compound Interest [Internet]. [cited 2019 Jul 13].
Available from: https://www.compoundchem.com/2015/03/24/dna/
3. Anam, Khairul. Laporan Praktikum Genetika Molekuler. DNA Rekombinasi,
Bioteknologi Pascasarjana IPB 2009. 1-20
4. Ausubel, F.M. et all. 2003. Current Protocol of Molecular Biology. John Wiley and
Sons. ISBN: 047150338X. 213-250
5. HiMedia Laboratories. 2015. Luria Bertani Agar Miller M1151 Teknikal Data.
Revision : 2 / 2015. Pvt. Ltd. A-516,Swastik Disha Business Park,Via Vadhani Ind.
Est., LBS Marg, Mumbai-400086, India.
6. Prasetya, A.W. 2014. Biologi Molekuler Dasar. Analisis DNA. Publish at http://agung-
w-p-fpk11.web.unair.ac.id/artikel_detail-107737-Biologi%20Molekuler%20Dasar-
ANALISIS%20DNA.html
7. Rahayu, N.J.; Krisno, M.A. 2012. Aplikasi DNA Rekombinan Oleh Bakteri E.coli
dalam Produksi Hormon GH untuk Mengatasi Kekerdilan. Program Studi Pendidikan
Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah Malang,
January 11, 2012. Publish at https://aguskrisnoblog.wordpress.com/2012/01/11/5918/
8. Rifai, Muhaimin. 2011. Modul Genetika Universitas Brawijaya. Rekombinasi DNA.
2011. 32-34. http://muhaiminrifai.lecture.ub.ac.id/files/2011/01/Modul-Genetika.pdf
9. Roseto D.A. 2007. L.B. Medium (Luria Bertani). Liofilchem Diagnostic Technical
Sheet. Itali. Rev. 0 of 22.01.2007. 1-2. Publish at web: http://www.liofilchem.net.
10. Warianto, Chaidar. 2011. Rekombinasi Genetik. Publish at 20-05-2011
10:02:24.http://skp.unair.ac.id/repository/Guru-
Indonesia/RekombinasiGenetik_ChaidarWarianto_23.pdf

36